Name: design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Författarna tackar alla medlemmar i Green, Pardee och Pena labs samt alla medförfattare till tidigare manuskript som rör det arbete som avslöjas i detta manuskript. SJ R.d.S. stöddes av ett doktorandstipendium sponsrat av Foundation for Science and Technology of Pernambuco (FACEPE), Brasilien, referensnummer IBPG-1321-2.12/18, och stöds för närvarande av ett postdoktoralt stipendium sponsrat av University of Toronto, Kanada. PB stöds av William Knapp Buckley Award från farmaceutiska fakulteten, University of Toronto. M.K. stöddes av Precision Medicine Initiative (PRiME) vid University of Torontos interna stipendienummer PRMF2019-002. Detta arbete stöddes av medel till K.P från Canada Research Chairs Program (Files 950-231075 och 950-233107), University of Toronto's Major Research Project Management Fund, CIHR Foundation Grant Program (201610FDN-375469) och till L.P, A.A.G. och K.P genom CIHR/IDRC Team Grant: Canada-Latin/America-Caribbean Zika Virus Program (FRN: 149783), samt genom medel till K.P. från Kanadas International Development Research Center (bidrag 109434-001) genom den kanadensiska 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Rapid Research Funding Opportunity. Detta arbete stöddes också av medel till A.A.G. från en Arizona Biomedical Research Commission New Investigator Award (ADHS16-162400), Gates Foundation (OPP1160667), en NIH Director's New Innovator Award (1DP2GM126892), en NIH R21-utmärkelse (1R21AI136571-01A1) till K.P./A.A.G och ett Alfred P. Sloan Fellowship (FG-2017-9108). Figur 1 skapades med Biorender.com under akademisk licens till K.P.

<ol>
	<li>Urdea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+high+impact+diagnostics+in+the+developing+world.">Requirements for high impact diagnostics in the developing world.</a> Nature. 444, 73-79 (2006).</li><li>Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+diagnostics+for+global+health.">Point-of-care diagnostics for global health.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+real-time+surveillance+of+Zika+virus+in+Brazil.">Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil.</a> Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+Early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Duyen, T. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+colorimetric+biosensor+for+antibiotics+inhibiting+bacterial+protein+synthesis.">Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).</li><li>Jung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosensors+for+rapid+detection+of+water+contaminants.">Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants.</a> Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).</li><li>Yang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+Escherichia+coli-based+system+to+screen+for+quorum-sensing+molecules+interacting+with+quorum+receptor+proteins+of+streptomyces+coelicolor.">Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).</li><li>Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+detection+of+norovirus+using+paper-based+cell-free+systems+and+synbody-based+viral+enrichment.">Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment.</a> Synthetic Biology. 3 (1), (2018).</li><li>Park, S., Lee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+coronaviruses+using+RNA+toehold+switch+sensors.">Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).</li><li>Amalfitano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucose+meter+interface+for+point-of-care+gene+circuit-based+diagnostics.">A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).</li><li>Nguyen, P. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wearable+materials+with+embedded+synthetic+biology+sensors+for+biomolecule+detection.">Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection.</a> Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).</li><li>Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+biosensor+for+the+detection+of+transcriptional+inducers+using+firefly+luciferase+as+a+reporter.">A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter.</a> Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+approach+to+biosensing+hTR&#946;-specific+endocrine+disruptors.">Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTR&#946;-specific endocrine disruptors.</a> Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensing+estrogenic+endocrine+disruptors+in+human+blood+and+urine:+A+RAPID+cell-free+protein+synthesis+approach.">Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).</li><li>Voyvodic, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+metabolic+transducers+expand+the+chemical+detection+space+of+cell-free+biosensors.">Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).</li><li>Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+and+streamlining+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis.">Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).</li><li>Gr&#228;we, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paper-based,+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs.">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).</li><li>Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toehold+Switches:+De-Novo-Designed+Regulators+of+Gene+Expression.">Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression.</a> Cell. 159 (4), 925-939 (2014).</li><li>Craw, P., Balachandran, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+nucleic+acid+amplification+technologies+for+point-of-care+diagnostics:+a+critical+review.">Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).</li><li>Zyrina, N. V., Antipova, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecific+Synthesis+in+the+Reactions+of+Isothermal+Nucleic+Acid+Amplification.">Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification.</a> Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+paper-based+synthetic+biology+platform+for+analyzing+gut+microbiota+and+host+biomarkers.">A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).</li><li>Karlikow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+validation+of+the+performance+of+paper-based+tests+for+the+detection+of+the+Zika+and+chikungunya+viruses+in+serum+samples.">Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).</li><li>Agarwala, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+resources+of+the+National+Center+for+Biotechnology+Information.">Database resources of the National Center for Biotechnology Information.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).</li><li>. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Available from: <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> (2022)</li><li>Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+applications+of+nucleic+acid+sequence-based+amplification+(NASBA).">Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA).</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).</li><li>Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sequence+design+via+efficient+ensemble+defect+optimization.">Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic,+Yap+State,+Micronesia,+2007.">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).</li><li>Walsh, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+automated+DNA+assembly:+Best+practices,+metrics,+and+protocols+using+robots.">Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots.</a> SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).</li><li>Silva, S. J. R., de Magalh&#227;es, J. J. F., de Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+circulation+of+DENV,+CHIKV,+ZIKV+and+SARS-CoV-2+in+Brazil:+An+inconvenient+truth.">Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth.</a> One Health. 12, 100205 (2021).</li><li>Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+machine.+Tanpakushitsu+kakusan+koso.">PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso.</a> Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).</li><li>Arce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decentralizing+cell-free+RNA+sensing+with+the+use+of+low-cost+cell+extracts.">Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).</li><li>Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+one-step+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+(RT-LAMP)+for+rapid+detection+of+ZIKV+in+patient+samples+from+Brazil.">Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li></ol>

K.P. och A.A.G. är meduppfinnare av pappersbaserad tåsensorrelaterad teknik. Y.G., S.C. och K.P. är medgrundare av LSK Technologies, Inc. M.K., K.P. och A.A.G. är medgrundare av En Carta Diagnostics Ltd. Andra författare har inga intressekonflikter. Patent: PLUM-enhet: Y.G., S.C. och K.P. patentansökan lämnades in av University of Toronto och tilldelades LSK Technologies Inc. Toehold switch patent: A.A.G., P.Y. och J.J. C. "Riboregulator compositions and methods of use", Patent. WO2014074648A3 arkiverad 6 november 2012; Pappersbaserat diagnostiskt patent: K.P. och J.J.C. "Paper-based synthetic gene networks" U.S. patent pending No. US15/963,831 arkiverad 6 december 2013; Zika-patent 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. och J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", U. S. Provisional Patent Application No. 62/403,778 inlämnad 4 oktober 2016; Zika-patent 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. och J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform", USA: s provisoriska patentansökan nr 62/341,221 inlämnad 25 maj 2016.

Det kombinerade pappersbaserade systemet som beskrivs här kan ge kliniskt relevant molekylär diagnostik, med prestanda som är funktionellt jämförbar med RT-qPCR, till behovspunkten6. Det är viktigt att för fjärrinställningar kan tillgängligheten för diagnostik på plats minska tiden till resultat från dagar till timmar. Genom att markera programmerbarheten för detta tillvägagångssätt kan pipelinen som har beskrivits användas för att upptäcka praktiskt taget alla patogenmål. Vi har parat ihop molekylverktygen med en specialbyggd bärbar plattläsare, som är kompakt och kompatibel med batteridrift (8–9 timmar) och tillhandahåller dataanalys ombord för att möjliggöra distribuerade applikationer. I annat arbete har vi validerat den kombinerade hårdvaru- och zikavirusdiagnostikplattformen med 268 patientprover, parallellt med RT-qPCR, och funnit en diagnostisk noggrannhet på 98,5%24. Sammantaget är vårt mål att möjliggöra tekniköverföring av denna plattform till forskare så att den kan återanvändas och förbättras av samhället för att tillgodose ouppfyllda diagnostiska behov.
Designprocessen för in silico toehold switch har integrerats och automatiserats i en pipeline som kan delas in i tre steg. Det första steget genererar en pool av tåhållarswitchdesigner som hybridiserar till målsekvensen i steg om en nukleotid. Det andra steget undersöker den sekundära strukturen och tillgängligheten av tåhållare och eliminerar sensorer med för tidiga stoppkodoner i ramen. En bedömningsfunktion som tar hänsyn till flera faktorer (t.ex. defektnivå för toehold-omkopplaren, tillgänglighet för toehold-omkopplare och målwebbplatsens tillgänglighet) implementeras sedan för att välja topptåomkopplare baserat på övergripande poäng. I det sista steget genereras en lista med sekvenser för de översta tåhållaromkopplardesignerna och deras motsvarande målutlösare. De översta sensorsekvenserna bör screenas för specificitet mot det mänskliga transkriptomet och närbesläktade virusgenom med hjälp av NCBI/Primer-BLAST25. Det är också bästa praxis att screena sensorns målplatser för sekvensbevarande i Zika-virusgenomet för att säkerställa att sensorerna ger bred och robust detektering. Flera versioner av toehold switch design programvara har utvecklats och designalgoritmen tillåter användare att generera två versioner, antingen serie A 6 eller serie B toehold switchar6. I den här artikeln har fokus legat på serie B toehold switch design.
Efter kommersiell DNA-syntes kan tåhållaromkopplarna snabbt monteras och sedan testas genom att utföra en initial skärm mot en syntetisk målutlösningssekvens som motsvarar korta regioner (200-300 nt) av målgenomet. För att screena prestanda för tåhållaromkopplarbaserade sensorer är det idealiskt att lägga till målsekvensen i form av RNA. I den här artikeln har de steg som krävs för att lägga till in vitro-transkriberat trigger-RNA beskrivits. Men om det finns tillgängligt kan genommallar i full längd, såsom kvantifierade virala RNA-extrakt eller kommersiella syntetiska RNA-genom eller standarder, användas. Att använda RNA-genom i full längd för initial screening av tåhållare är fördelaktigt eftersom det kan informera om ytterligare faktorer, såsom RNA-sekundär struktur, kommer att påverka sensorns prestanda. För att optimera ON/OFF-förhållandet för kandidatomkopplare kan tåhållaromkopplarens DNA titreras in i den cellfria reaktionen. Detta steg kan också tjäna till att identifiera högpresterande tåhållebrytare (vikförstärkning eller högt ON / OFF-förhållande) och utelämna läckande tåhållebrytare (hög signal i frånvaro av mål-RNA) från nedströms karakteriseringssteg.
För att förbättra detektionsgränsen för de bäst presterande toehold switch-kandidaterna används NASBA för att öka kliniskt relevanta koncentrationer av zikavirus-RNA till en nivå som kan detekteras med tåhållaromkopplare6. Olika kombinationer av framåt- och bakåtprimersatser screenas för att bestämma de bästa NASBA-primer- och tåhållaromkopplarkombinationerna för att möjliggöra detektion vid kliniskt relevanta koncentrationer. När en idealisk primeruppsättning och kombination av tåhållare har identifierats tas analysen vidare till klinisk validering. Det är viktigt att notera att tåhållaromkopplaren och NASBA-screeningstegen kan vara arbets- och resurskrävande och därför är testutveckling bäst lämpad för välresurserade forskningsplatser. Även om vi inte har tillämpat processautomatisering är det troligt att detta kan påskynda den iterativa designen, bygget och testcykeln32. Lyckligtvis kan handläggningstiden från sensordesign och testning till distribution vara anmärkningsvärt kort (mindre än en vecka), vilket gör denna strategi idealisk för tidskritiska situationer, till exempel epidemiska utbrott6.
Även efter att en biosensor med kliniskt relevant känslighet har utvecklats finns det tekniska utmaningar som måste hanteras. Eftersom detta protokoll involverar manuell drift och är ett flerstegsförfarande finns det risk för korskontaminering mellan prover. Vi gör vårt bästa för att minska denna risk genom noggrann laboratoriepraxis. I en nyligen genomförd klinisk prövning av 268 patientprover stötte vi inte på några kontamineringsproblem; Det är dock en viktig faktor24. Med detta i åtanke förblir protokollet en laboratorieanalys och kräver en skicklig användare med kommando över korrekt molekylärbiologisk teknik. Ett ytterligare övervägande för distribution är RNA-isolering från patientprover. Här beskriver vi RNA-isolering med hjälp av kolonnbaserade nukleinsyraextraktionssatser. I övrigt arbete har vi dock visat en effektiv och enkel kokningslysmetod (95 °C i 2 min) för lågbelastad patientprovbehandling6. Denna strategi eliminerar nästan kostnaden för RNA-extraktion och undviker användning av kolonnbaserade nukleinsyraextraktionssatser, vilket kan utgöra en logistikutmaning i miljöer med låga resurser eller problem med försörjningskedjan under kriser, såsom COVID-19-pandemin33.
Som vi har sett under COVID-19-pandemin kan instrumenten som används för att utföra RT-qPCR själva fungera som en flaskhals och begränsa patientens tillgång till testning. Denna faktor, som också till stor del är ekonomisk, leder till ett centraliserat testläge som kan begränsa diagnostisk åtkomst. Till exempel, under Zika-utbrottet 2015/2016, var endast fem nationella referenslaboratorier tillgängliga i Brasilien, vilket orsakade förseningar i patienttestning. Utan att ta hänsyn till den potentiella fördelen med stordriftsfördelar är den nuvarande kostnaden för varor för den bärbara plattläsaren ~ $ 500 USD, som även om den ökade femfaldigt för att ta hänsyn till arbetskraft och kommersiell marginal, fortfarande ger ett prisvärt instrument. Detta kan jämföras med RT-qPCR-instrument som varierar i kostnad från $ 15,000- $ 90,000 USD34. Dessutom är den uppskattade kostnaden per test för den cellfria analysen i Latinamerika cirka $ 5.48 USD, medan kostnaden per test av RT-qPCR i Brasilien var ~ $ 10-11 USD vid tidpunkten för Zika-utbrottet36. Utöver kostnaden för utrustning har den bärbara plattläsaren ett litet fotavtryck (20 cm3), automatisk analys, datauppladdning till molnet via internet och kan köras på batteriström. Dessa funktioner utökar dramatiskt de potentiella inställningarna där testning kan distribueras och utökar samtidigt patientpopulationen som kan betjänas.
Hittills är de vanligaste kommersiella E. coli CFPS-plattformarna S30- och PURE-systemen37; En viktig faktor för att förbättra tillgången till diagnostik i låg- och medelinkomstländer är dock den begränsade inhemska tillgången på dessa reagenser. Ett viktigt steg mot att lösa denna utmaning är utvecklingen av lokal CFPS-produktion. Federici-labbet har nyligen gjort betydande framsteg mot att utveckla en icke-kommersiell plattform för att implementera tåhållaromkopplarbaserade sensorer i lysatbaserade cellfria system och nått en 2,7 fM LOD med zikavirus RNA14. Denna prestation gör det inte bara möjligt att göra reagenserna i användningslandet, vilket undviker importtullar och förseningar, utan arbetskraftskostnaderna skalas också till lokala priser och därmed kan den totala kostnaden sänkas avsevärt. I det arbete som beskrivs av Federici-gruppen var kostnaden för att producera CFPS-uttrycksreaktionen (5 μL) i Chile 6,9 cent (USD)35,38, vilket gav ett dubbelt incitament (förbättrad logistik och kostnad) för att implementera lysatbaserade system 35,38.
Placeringen av RT-qPCR-jämförbar testning i distribuerade diagnostiska nätverk kan ge betydande fördelar jämfört med nuvarande praxis som är beroende av transport av prover till centraliserade RT-qPCR-anläggningar. I stadsnära miljöer, där zikafallen var koncentrerade, bromsar det fysiska avståndet mellan en patient och diagnosanläggningen diagnosen och ökar risken för att resultaten inte når patienten vid en kliniskt relevant tidpunkt. Det är vår förhoppning att det arbete som presenteras här kan bidra till att göra det möjligt för forskarsamhället att genom kunskapsöverföring skapa decentraliserad bioteknik och bärbar hårdvara för människors hälsa, jordbruk och miljöövervakning.

RT-qPCR har förblivit guldstandardtekniken för klinisk diagnostik på grund av dess utmärkta känslighet och specificitet. Även om den är mycket robust beror metoden på dyr, specialiserad utrustning och reagenser som kräver temperaturkontrollerad distribution och lagring. Detta utgör betydande hinder för tillgången till kvalitetsdiagnostik globalt, särskilt i tider av sjukdomsutbrott och i regioner där tillgången till välutrustade laboratorier är begränsad 1,2. Detta observerades under zikavirusutbrottet 2015/2016 i Brasilien. Med endast fem centraliserade laboratorier tillgängliga för att tillhandahålla RT-qPCR-testning resulterade betydande flaskhalsar, vilket begränsade tillgången till diagnostik. Detta var särskilt utmanande för individer i stadsnära miljöer, som drabbades hårdare av utbrottet 3,4. I ett försök att förbättra åtkomsten till diagnostik visar protokollet en plattform som har utvecklats med potential att tillhandahålla decentraliserad, billig och högkapacitetsdiagnostik i miljöer med låg resurs. Som en del av detta etablerades en diagnostisk upptäcktspipeline som kopplar isotermisk förstärkning och syntetiska RNA-switchbaserade sensorer med pappersbaserade cellfria uttryckssystem 5,6.
Cellfria proteinsyntessystem (CFPS), särskilt E. coli-baserade cellfria system, är en attraktiv plattform för ett brett spektrum av biosensingapplikationer från miljöövervakning7,8 till patogendiagnostik 5,6,9,10,11,12 . CFPS-system består av de komponenter som är nödvändiga för transkription och översättning och har betydande fördelar jämfört med helcellsbiosensorer. Specifikt är avkänning inte begränsad av en cellvägg och i allmänhet är de modulära i design, biosäkra, billiga och kan frystorkas för bärbar användning. Förmågan att frystorka genkretsbaserade reaktioner på substrat som papper eller textilier möjliggör transport, långvarig lagring vid rumstemperatur5 och till och med införlivande i bärbar teknik13.
Tidigare arbete har visat att E. coli-cellfria system kan användas för att detektera många analyter, till exempel giftiga metaller som kvicksilver, antibiotika som tetracyklin7,14, hormonstörande kemikalier15,16, biomarkörer som hippursyra 17, patogenassocierade kvorumavkänningsmolekyler 9,18 och olagliga ämnen som kokain 17 och gammahydroxibutyrat (GHB)19 . För sekvensspecifik detektion av nukleinsyror har strategier för det mesta förlitat sig på användningen av switchbaserade biosensorer kopplade till isotermiska förstärkningstekniker. Toehold-omkopplare är syntetiska riboregulatorer (även kallade helt enkelt "switchar" i resten av texten) som innehåller en hårnålstruktur som blockerar nedströms översättning genom att binda ribosomalt bindningsställe (RBS) och startkodonet. Vid interaktion med deras målutlösande RNA lindras hårnålsstrukturen och efterföljande översättning av en reporter öppen läsram aktiveras20.
Isotermisk förstärkning kan också användas som molekylär diagnostik21; Dessa metoder är emellertid benägna att ospecifik förstärkning, vilket kan minska testets specificitet och därmed noggrannheten till under RT-qPCR 22. I det arbete som rapporteras här användes isotermisk förstärkning uppströms de switchbaserade sensorerna för att ge kombinerad signalförstärkning som möjliggör kliniskt relevant detektion av nukleinsyror (femtomolar till attomolar). Denna parning av de två metoderna ger också två sekvensspecifika kontrollpunkter som i kombination ger en hög grad av specificitet. Med hjälp av detta tillvägagångssätt har tidigare arbete visat detektion av virus som Zika6, Ebola5, Norovirus10, liksom patogena bakterier som C. difficile23 och antibiotikaresistent tyfus12. Senast har cellfria tåhållare demonstrerats för SARS-CoV-2-detektion i försök att tillhandahålla tillgänglig diagnostik för COVID-19-pandemin11,12,13.
Följande protokoll beskriver utvecklingen och valideringen av cellfri, pappersbaserad syntetisk toehold-switchanalys för zikavirusdetektering, från in silico-biosensordesign , via monterings- och optimeringsstegen, till fältvalidering med patientprover. Protokollet börjar med in silico-designen av RNA-toehold-switchbaserade sensorer och isotermiska förstärkningsprimrar som är specifika för Zika-viralt RNA. Även om det finns många isotermiska förstärkningsmetoder, visades här användningen av nukleinsyrasekvensbaserad förstärkning (NASBA) för att öka koncentrationen av viralt RNA-mål närvarande i reaktionen, vilket möjliggjorde kliniskt signifikant känslighet. Praktiskt taget har isotermiska förstärkningsmetoder fördelen att de arbetar vid konstant temperatur, vilket eliminerar behovet av specialutrustning, såsom termiska cykler, som i allmänhet är begränsade till centraliserade platser.
Därefter beskrivs processen att montera de syntetiska tåhållaromkopplarsensorerna med reporterkodningssekvenser genom överlappningsförlängning PCR och screening av de syntetiska tåhållaromkopplarsensorerna för optimal prestanda i cellfria system med syntetiskt RNA. För denna uppsättning Zika-virussensorer har vi valt lacZ-genen som kodar för enzymet β-galaktosidas, som kan klyva ett kolorimetriskt substrat, klorfenolrött-β-D-galaktopyranosid (CPRG), för att producera en gul till lila färgförändring som kan detekteras av ögat eller med en plattläsare. När högpresterande syntetiska omkopplare har identifierats beskrivs processen för screening av primers för nukleinsyrasekvensbaserad isotermisk förstärkning av motsvarande målsekvens med syntetiskt RNA för att hitta uppsättningar som ger den bästa känsligheten.
Slutligen valideras diagnostikplattformens prestanda på plats i Latinamerika (figur 1). För att bestämma den kliniska diagnostiska noggrannheten utförs den pappersbaserade cellfria analysen med hjälp av Zika-virusprover från patienter; parallellt utförs en guldstandard RT-qPCR-analys för jämförelse. För att övervaka kolorimetriska cellfria analyser möjliggör vi kvantifiering på plats av resultat i regioner där termiska cykler inte är tillgängliga. Den handmonterade plattläsaren som kallas Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; nedan kallad bärbar plattläsare) introduceras också här24. Den bärbara plattläsaren utvecklades ursprungligen som en kompletterande enhet för cellfri syntetisk tåhållaromkopplardiagnostik och erbjuder ett tillgängligt sätt att inkubera och läsa resultat på ett sätt med hög genomströmning, vilket ger integrerad, datorvisionsbaserad mjukvaruanalys för användare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> Figur 1: Arbetsflöde för testning av patientprover med pappersbaserade cellfria tåhållarreaktioner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - aluminum</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1995</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - transparent</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1994</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11006-180</td>
			<td>2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>AGA001.500</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td>Blocking agent for the Whatman filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell free reactions</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800L</td>
			<td>PURExpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10884308001</td>
			<td>Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Sterile Biopsy Punches</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>23233-31</td>
			<td>Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td>Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74104</td>
			<td>DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487</td>
			<td>Used to run the agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>ChemiDoc XRS+ Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVT kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used for determining nucleic acid concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NASBA kit</td>
			<td>Life Sciences Advanced Technologies</td>
			<td>NWK-1</td>
			<td>Isothermal amplification reaction components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free H20</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Added to reaction mixes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE electrophoresis system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>Used to cast and run polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCOLADuet-LacZ DNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>75006</td>
			<td>https://www.addgene.org/75006/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase/reactioin buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioTek NEO2</td>
			<td>Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase/reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>2X RNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>EN0521</td>
			<td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td>Used to prevent contamination of RNases A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>208352</td>
			<td>QuantiNova Probe RT-PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Invitrogen S11494</td>
			<td>S11494</td>
			<td>PAGE gel stain for nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td>Gel electrophoresis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used for temperature cycling and incubating reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 42 filter paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1442-042</td>
			<td>Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics

Tillgång till molekylär diagnostik med låg belastning som kan distribueras i samhället för testning blir allt viktigare och har meningsfulla bredare konsekvenser för samhällenas välbefinnande och ekonomisk stabilitet. Under de senaste åren har flera nya isotermiska diagnostiska metoder dykt upp för att möta behovet av snabb, billig molekylär diagnostik. Vi har bidragit till detta arbete genom utveckling och patientvalidering av tåhållarbaserad diagnostik, inklusive diagnostik för myggburna zika- och chikungunyavirus, vilket gav prestanda jämförbar med guldstandard omvänd transkriptionskvantitativ polymeraskedjereaktion (RT-qPCR) baserade analyser. Dessa diagnostiker är billiga att utveckla och tillverka, och de har potential att ge diagnostisk kapacitet till miljöer med låg resurs. Här ger protokollet alla steg som krävs för att utveckla en switchbaserad analys för Zika-virusdetektering. Artikeln tar läsarna genom den stegvisa diagnostiska utvecklingsprocessen. För det första fungerar genomiska sekvenser av zikavirus som indata för beräkningsdesign av kandidatswitchar med hjälp av programvara med öppen källkod. Därefter visas montering av sensorerna för empirisk screening med syntetiska RNA-sekvenser och optimering av diagnostisk känslighet. När valideringen är klar utförs valideringen med patientprover parallellt med RT-qPCR och en specialbyggd optisk läsare, PLUM. Detta arbete ger en teknisk färdplan till forskare för utveckling av billiga tåhållarbaserade sensorer för applikationer inom människors hälsa, jordbruk och miljöövervakning.

Efter beräkningsdesignrörledningen utfördes konstruktionen av tre tåomkopplare av PCR. PCR-produkterna analyserades med hjälp av agarosgelelektrofores (figur 2). Närvaron av ett klart band runt 3,000 bp, ungefär storleken på lacZ-genen kopplad till en tåomkopplare, indikerar vanligtvis en framgångsrik reaktion. Alternativt indikerar en fil utan band, flera band eller ett band av fel storlek en misslyckad PCR. Vid misslyckad PCR bör reaktionsbetingelserna och/eller primersekvenserna optimeras.
De monterade tåhållarbrytarna screenades för att bedöma varje sensor mot dess respektive in vitro-transkriberade trigger-RNA (figur 3). Medan alla tre sensorerna visade en ökad OD 570-absorbans, hade switch27B (figur 3A) den snabbaste hastigheten. Switcharna 33B och, i mindre utsträckning, 47B visade en ökad OD570-absorbans i frånvaro av målutlösar-RNA, vilket indikerar att dessa omkopplare har viss bakgrundsaktivitet eller läckande (figur 3B, C) - en egenskap som inte önskas i en kandidatsensor eftersom det kan minska specificiteten. För att tydligare identifiera sensorn med det högsta ON/OFF-signalförhållandet beräknades vikförändringen av OD570-absorbansen (se kompletterande information avsnitt 5) och plottades (figur 4). Från denna analys är det tydligt att switch 27B är den sensor som har bäst prestanda med ett ON / OFF-förhållande på cirka 60.
Känsligheten hos den bäst presterande tåhållomkopplaren (27B) utvärderades sedan genom att bestämma den lägsta RNA-koncentrationen som krävs för att aktivera tåhållomkopplaren i kombination med en NASBA-reaktion. Grafen illustrerar att de bäst presterande zikasensorerna kan detektera RNA vid koncentrationer så låga som 1,24 molekyler per μL (motsvarande ~ 2 aM; Figur 5).
Efter att switch 27B identifierats och validerats distribuerades sensormaterialet till teammedlemmarna i Recife i delstaten Pernambuco i Brasilien. I Brasilien bedömdes den kliniska diagnostiska noggrannheten hos zikavirusdiagnostikplattformen med hjälp av patientprover från zikavirus, parallellt med RT-qPCR för jämförelse. För att validera den pappersbaserade zikadiagnosplattformen användes den bärbara plattläsaren, som kan inkubera och läsa kolorimetriska utdata från pappersbaserade sensorer. Färgförändringen från gult till lila används för att identifiera ett positivt prov, medan ett negativt prov förblir gult (figur 6). Ett ytterligare alternativ för att visualisera resultaten som genereras av den bärbara plattläsaren (figur 8) är att plotta det kolorimetriska svaret för varje pappersbaserad reaktion över tiden. Proverna testades i tre exemplar och de som överskred tröskelvärdet (röd linje inställd på 1) ansågs vara positiva, medan prover under tröskelvärdet ansågs vara negativa (figur 6 och figur 7).
Slutligen, för att utvärdera och jämföra den kliniska prestandan hos Zika toehold switch sensor med den nuvarande guldstandardmetoden för att diagnostisera zikavirusinfektion, testades alla patientprover parallellt med RT-qPCR. Förstärkningsdiagrammet för två representativa patientprover testades i tre exemplar för detektion av zikavirus med RT-qPCR (figur 9). Proverna anses vara positiva när cykeltröskelvärdet (Ct) är ≤38. den röda linjen indikerar ett positivt prov och den blå linjen indikerar ett negativt prov för Zika-virus.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> Figur 2: Agarosgelelektrofores för att bedöma kvaliteten på PCR-produkter. PCR-produkter analyseras på en 1% agarosgel i 1X TAE, körs vid 80 V i 90 min. Ett enda tydligt band indikerar vanligtvis en framgångsrik reaktion. Bana 1: 1 kb DNA-stege; Körfält 2-4: 27B switch DNA, 33B trigger DNA respektive 47B trigger DNA. Siffrorna till vänster representerar bandstorlek i bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> Figur 3: Prototyper av tre tåhållare för pappersbaserade zikasensorer. Prestandan hos tre pappersbaserade RNA-tåhållarsensorer mättes vid 37 °C i över 130 minuter. Varje diagram innehåller två spår, en representerar endast switchkontrollen, medan den andra representerar omkopplaren och utlösaren. De tre graferna representerar data som erhållits med hjälp av tåkopplingssensorer 27B (A), 33B (B) och 47B (C). Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet (SEM) från tre replikat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> Figur 4: Högpresterande sensorer identifieras genom att beräkna vikförändringen i absorbans vid 570 nm. Vikningsförändring (eller maximalt ON/OFF-förhållande) beräknas genom att mäta absorbansförhållandet (OD570) vid 130 min mellan omkopplarens enda kontroll och omkopplaren plus utlösaren CFPS-analys. Felstaplar representerar SEM från tre replikat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> Figur 5: Känslighetsbedömning av högpresterande switch. In vitro-transkriberat zika-RNA titreras till NASBA-reaktioner. Efter en inkubation på 1 timme tillsattes reaktionerna till cellfria PURExpress-reaktioner på pappersskivor i förhållandet 1:7. Vikbytet efter 130 min vid 37 °C plottas. Denna siffra har återgetts från24. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> Bild 6: Hämtningssida för bärbar plattläsare som lästs in med inspelade bilddata. Den här bilden visar en exempelbild av den slutliga bilden som tagits av den bärbara plåtläsaren under en datainsamlingskörning. Den ursprungliga datum-/tidsstämpeln visas högst upp i bilden. Gul färg indikerar kontroll eller negativa reaktioner, och den lila färgen indikerar en positiv reaktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> Bild 7: Dataanalysläge. Till vänster väljer användarna de datauppsättningar de vill rita. Diagrammen visas sedan till höger med unika färger för varje prov eller kontrolluppsättning. Den streckade röda linjen fungerar som en tröskel för att bestämma positiva och negativa prover. Prover som testats i tre exemplar som överskrider tröskelvärdet anses vara positiva, medan prover under tröskelvärdet anses vara negativa. Felstaplar representerar standardavvikelse (SD) från tre replikat. Ctrl 1 till Ctrl 5 indikerar kontroller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> Figur 8. PLUM, en bärbar plattläsare. Denna bärbara plattläsare fungerar som ett labb-i-en-låda och fungerar som en temperaturkontrollerad plattläsare för att inkubera och övervaka kolorimetriska reaktioner. Denna bärbara enhet kan tillhandahålla kvantitativa och genomströmningsmätningar av de pappersbaserade zikasensorerna på plats. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> Figur 9: RT-qPCR-diagram över förstärkningen av två patientprover som testats i tre exemplar för detektion av zikaviruset. Prover anses vara positiva när cykeltröskelvärdet (Ct) är ≤38. Den prickade röda linjen fungerar som ett tröskelvärde för att bestämma positiva och negativa prover. Det röda spåret indikerar ett positivt prov och det blå spåret indikerar ett negativt prov. ΔRn (delta Rn) -värdet representerar den normaliserade storleken på fluorescenssignalen som detekteras av RT-qPCR-instrumentet för alla testade prover. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Kompletterande protokollfil. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande siffror. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner dessa siffror.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

Tillgång till decentraliserad, billig och högkapacitetsdiagnostik som kan distribueras i samhället för decentraliserad testning är avgörande för att bekämpa globala hälsokriser. Detta manuskript beskriver hur man bygger pappersbaserad diagnostik för virala RNA-sekvenser som kan detekteras med en bärbar optisk läsare.

Design to implementation-studie för utveckling och patientvalidering av pappersbaserad tåhållarswitchdiagnostik

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

Vårt protokoll beskriver design, montering och validering av genkretsbaserad diagnostik. Dessa pappersbaserade molekylära diagnostik är billiga och känsliga, kan detektera kliniskt relevanta koncentrationer av nukleinsyror och kan utformas för att detektera praktiskt taget vilken sekvens som helst. Detta är en plattformsteknik som kan utformas av användare för deras behov och har potential att föra diagnostik av klinisk kvalitet till mer decentraliserade tandresursinställningar.Cellfri tåhållarsensor kan utformas för praktiskt taget alla nukleinsyrabaserade mål. Nyligen utfört arbete har visat cellfri diagnostik för ebola, norovirus, SARS-CoV-2, C.difficile och tyfusframkallande bakterier. Demonstrerar proceduren kommer att vara Severino Jefferson Rivero da Silva, en postdoktor, och Pouriya Bayat, doktorand från mitt laboratorium.För att designa tåhållaromkopplaren, identifiera målsekvenserna från Zika-virusgenomet och välj zikavirusets målsekvenser från amplikonerna enligt beskrivningen i textprotokollet. Ladda ner programvarupaketet för design av toehold switch. Öppna MATLAB och navigera till mappen designprogramvara.Mata in målsekvenserna i csv-filen för designindatafilen som finns i indataundermappen. Välj de parametrar som ska användas för designfunktionen. Kör designfunktionen för att generera tåhållaromkopplarens design för de intressanta målen.När du är klar navigerar du till mappen final_designs och letar reda på designsekvenserna för den övre tåhållaren och motsvarande målsekvenser i kalkylblad i csv-format. Se till att DNA-sekvenserna för toehold-omkopplaren som genereras av algoritmen innehåller T7-promotorsekvenserna vid de fem primtalsändarna och en bevarad 21-nukleotidlänksekvens vid de tre primtalsändarna. Använd NCBI BLAST för att screena designsekvenserna för topptåomkopplaren mot andra vanliga virus genom att söka efter sekvenshomologi.Acceptera sekvenser med mindre än 40% hemologi. Förbered lösningar av tåhållarens hårnåls-DNA-oligos och omvänd förstärkningsprimrar i en koncentration av 10 mikromolar i nukleasfritt vatten. Montera reaktioner i PCR-rör på is enligt denna tabell.Placera reaktionsrören i en termocykler enligt de cykelförhållanden som anges i denna tabell. Analysera PCR-produkterna på en agarosgel. Rena PCR-produkterna och eluera DNA i en minimal volym nukleasfritt vatten för att säkerställa en tillräckligt hög koncentration.Kvantifiera DNA med hjälp av en spektrofotometer. Bered en HLRG-stamlösning genom att lösa upp 25 milligram av pulvret i en milliliter nukleasfritt vatten. Förbered en huvudblandning på is enligt standardprotokollet som visas här.Dispensera den cellfria masterblandningen i PCR-rör. För cellfria kontroller och switch-ensamma kontroller, tillsätt nukleasfritt vatten till en volym på 5,94 mikroliter. Och för reaktionen, tillsätt PCR-renat tåhållaromkopplare DNA för att få en slutlig koncentration på 33 nanomolar.För att testa tåhållomkopplaren och mål-RNA-kombinationen, lägg till in vitro-transkriberat mål-RNA till en slutlig koncentration av en mikromolär. Blanda alla reaktioner noggrant genom pipettering och centrifugera kort. På en svart klarbottnad 384-brunnsplatta, tillsätt 30 mikroliter nukleasfritt vatten till brunnarna som omger reaktionsbrunnarna.Skär sedan BSA-blockerade filterpappersskivor med en två millimeter biopsistans och placera dem i reaktionsbrunnarna. Fördela 1,8 mikroliter från varje reaktionsrör på filterpappersskivorna i 384-brunnsplattan i tre exemplar. Täck plattan med klar PCR-film och placera den i en plattläsare.Mät absorbansen vid 570 nanometer vid 37 grader Celsius varje minut i 130 minuter. Bered en 25 mikromolar stamlösning av alla framåt- och bakåtprimersatser i nukleasfritt vatten. Ställ in en fem mikroliter reaktion med hjälp av huvudblandningen som visas här.Blanda genom pipettering tills den vita fällningen löser sig och dosera sedan i PCR-rör. Tillsätt de framåt- och bakåtprimerarna till lämpliga rör, följt av att tillsätta en mikroliter antingen nukleasfritt vatten eller två pikomolära målutlösar-RNA. Blanda med försiktig pipettering och snurra kort ner rören.Ställ in inkubationsprotokollet på en termocykler som visas här. Efter 12 minuter, ta bort rören och tillsätt 1,25 mikroliter av enzymblandningen till varje rör, följt av blandning och centrifugering. Sätt tillbaka rören till termocyclern efter att ha hoppat över 41 grader Celsius hållsteg för att starta en timmes reaktionsinkubation.För att sedan bedöma primerprestanda, montera de pappersbaserade cellfria tåhållarreaktionerna och analysera data. För känslighetsanalys, identifiera kandidatprimerpar och bereda seriella utspädningar av mål-RNA i nukleasfritt vatten. Upprepa NASBA- och cellfria reaktioner med de valda primeruppsättningarna i biologiska tredubblar.Använd en mikroliter extraherat patient-RNA och utför NASBA-förstärkningen och pappersbaserade cellfria reaktioner som visas i avsnitt fem. Efter reaktionerna, förbered reaktionsplattan med 384 brunnar och kör analysen i en bärbar plattläsare vid 37 grader Celsius. Montera sedan RT-qPCR-komponenterna och tillsätt reagenserna till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör enligt denna tabell.Blanda reaktionen genom pipettering. Fördela 6,5 mikroliter i varje brunn på en 96-brunn eller 384-brunns PCR-platta, följt av 3,5 mikroliter av varje RNA-mall i tre exemplar. Placera en PCR-film över toppen av plattan.Centrifugera 384-brunnsplattan vid 600 gånger G i två minuter. Placera plattan i en RT-qPCR-maskin och kör cykelförhållandena som visas här. Efter beräkningsdesignen konstruerades och analyserades tre tåbrytare med hjälp av agarosgelelektrofores.Ett band runt 3 000 baspar indikerade en framgångsrik reaktion. Toehold-omkopplarna bedömdes mot deras respektive in vitro-transkriberade trigger-RNA. Medan alla tre sensorerna visade en ökning av absorbansen, hade sensor 27B den snabbaste hastigheten, medan omkopplarna 33B och 47B hade ett lägre på / av-förhållande som indikerar bakgrundsaktivitet och minskad specificitet.Vikförändringen av absorbansen vid 570 nanometer visade att omkopplaren 27B har bäst prestanda med ett på/av-signalförhållande. Dessutom, i kombination med NASBA, kan det detektera RNA vid koncentrationer så låga som 124 molekyler per mikroliter vilket indikerar hög känslighet. Zikaviruspatientprover från Brasilien testades för att bedöma sensorernas kliniska diagnostiska noggrannhet med hjälp av en bärbar plattläsare.En färgförändring från gul till lila identifierade ett positivt prov. Det kolorimetriska svaret för varje pappersbaserad reaktion plottades över tid av den integrerade programvaran på den bärbara PLUM-plattläsaren. De prover som överskred tröskelvärdet ansågs vara positiva.Sensorns kliniska prestanda fastställdes genom jämförelse med RT-qPCR. Proverna ansågs vara positiva när cykeltröskelvärdet var lika med eller mindre än 38. Det är viktigt att säkerställa att resultaten från tåhållarknappar och NASBA-primerkänslighet är reproducerbara och optimerade innan man går vidare med patientprövningar.Med tanke på dess enkelhet och anpassningsförmåga har den diagnostiska plattformen som beskrivs här banat väg för utvecklingen av nya vårdverktyg som kan ge fördelar för hälso- och sjukvårdssystemet, särskilt för låginkomstländer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design av en cyklisk tryck Bioreaktor för Ex vivo Studie av Aorta hjärtklaffar

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Karakterisering av komplexa system Använda Försöks Tillvägagångssätt: Transient Protein Expression i tobak som en fallstudie

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Pappersbaserade enheter för Isolering och karakterisering av extracellulär Blåsor

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Konstruktion av definierade mänskliga Engineered hjärtvävnader att studera mekanismer för Cardiac Cellterapi

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Design och implementering av en automatisk Lysande, Odling och provtagningssystemet för Microbial optogenetic Applications

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Magnetisk levitation Tillsammans med Portable Imaging och analys for Disease Diagnostics

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Tillverkning av Tredimensionell Pappersbaserade Mikrofluidikanordningar för Immun

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Tillverkning och validering av en orgel-on-chip System med integrerad elektroder direkt kvantifiera Transendothelial resistans

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Anatomically Realistic Neonatal Heart Model for Use in Neonatal Patient Simulators

Anatomiskt realistiska Neonatal hjärtat modell för användning i Neonatal patienten simulatorer

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensorer att upptäcka proteas aktivitet In Vivo för noninvasiv diagnostik

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...