Name: design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics
Uploaded: 2022-06-17T14:00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Yazarlar, Green, Pardee ve Pena laboratuvarlarının tüm üyelerine ve bu makalede açıklanan çalışmalarla ilgili önceki makalelerin tüm ortak yazarlarına teşekkür eder. S.J.R.D.S., Brezilya'daki Pernambuco Bilim ve Teknoloji Vakfı (FACEPE) tarafından desteklenen bir doktora bursu, referans numarası IBPG-1321-2.12/18 tarafından desteklenmektedir ve şu anda Toronto Üniversitesi, Kanada tarafından desteklenen bir Doktora Sonrası Bursu tarafından desteklenmektedir. P.B., Toronto Üniversitesi Eczacılık Fakültesi'nden William Knapp Buckley Ödülü ile desteklenmektedir. M.K., Toronto Üniversitesi PRMF2019-002 dahili burs numarasındaki Hassas Tıp Girişimi (PRiME) tarafından desteklenmiştir. Bu çalışma, Kanada Araştırma Başkanları Programı'ndan (Dosyalar 950-231075 ve 950-233107), Toronto Üniversitesi Büyük Araştırma Projesi Yönetim Fonu'ndan, CIHR Vakfı Hibe Programı'ndan (201610FDN-375469) ve L.P, A.A.G. ve K.P.'ye CIHR / IDRC Ekip Hibesi: Kanada-Latin / Amerika-Karayipler Zika Virüsü Programı (FRN: 149783) ve Kanada Uluslararası Kalkınma Araştırma Merkezi'nden (hibe 109434-001) K.P.'ye Kanada 2019 Yeni Koronavirüs (COVID-19) Hızlı Araştırma Fonu Fırsatı aracılığıyla fon sağladı. Bu çalışma aynı zamanda A.A.G.'ye Arizona Biyomedikal Araştırma Komisyonu Yeni Araştırmacı Ödülü (ADHS16-162400), Gates Vakfı (OPP1160667), bir NIH Director's New Innovator Award (1DP2GM126892), bir NIH R21 ödülü (1R21AI136571-01A1) ve bir Alfred P. Sloan Bursu (FG-2017-9108) tarafından A.A.G.'ye sağlanan fonlarla da desteklenmiştir. Şekil 1 , K.P.'ye akademik lisans altında Biorender.com ile oluşturulmuştur.

<ol>
	<li>Urdea, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+high+impact+diagnostics+in+the+developing+world.">Requirements for high impact diagnostics in the developing world.</a> Nature. 444, 73-79 (2006).</li><li>Yager, P., Domingo, G. J., Gerdes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Point-of-care+diagnostics+for+global+health.">Point-of-care diagnostics for global health.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 10, 107-144 (2008).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mobile+real-time+surveillance+of+Zika+virus+in+Brazil.">Mobile real-time surveillance of Zika virus in Brazil.</a> Genome Medicine. 8 (1), 97 (2016).</li><li>Faria, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zika+virus+in+the+Americas:+Early+epidemiological+and+genetic+findings.">Zika virus in the Americas: Early epidemiological and genetic findings.</a> Science. 352 (6283), 345-349 (2016).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+synthetic+gene+networks.">Paper-based synthetic gene networks.</a> Cell. 159 (4), 940-954 (2014).</li><li>Pardee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+low-cost+detection+of+Zika+virus+using+programmable+biomolecular+components.">Rapid, low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components.</a> Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).</li><li>Duyen, T. T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paper-based+colorimetric+biosensor+for+antibiotics+inhibiting+bacterial+protein+synthesis.">Paper-based colorimetric biosensor for antibiotics inhibiting bacterial protein synthesis.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 123 (1), 96-100 (2017).</li><li>Jung, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biosensors+for+rapid+detection+of+water+contaminants.">Cell-free biosensors for rapid detection of water contaminants.</a> Nature Biotechnology. 38 (12), 1451-1459 (2020).</li><li>Yang, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+Escherichia+coli-based+system+to+screen+for+quorum-sensing+molecules+interacting+with+quorum+receptor+proteins+of+streptomyces+coelicolor.">Cell-free Escherichia coli-based system to screen for quorum-sensing molecules interacting with quorum receptor proteins of streptomyces coelicolor.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (19), 6367 (2009).</li><li>Ma, D., Shen, L., Wu, K., Diehnelt, C. W., Green, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-cost+detection+of+norovirus+using+paper-based+cell-free+systems+and+synbody-based+viral+enrichment.">Low-cost detection of norovirus using paper-based cell-free systems and synbody-based viral enrichment.</a> Synthetic Biology. 3 (1), (2018).</li><li>Park, S., Lee, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+coronaviruses+using+RNA+toehold+switch+sensors.">Detection of coronaviruses using RNA toehold switch sensors.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1-13 (2021).</li><li>Amalfitano, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glucose+meter+interface+for+point-of-care+gene+circuit-based+diagnostics.">A glucose meter interface for point-of-care gene circuit-based diagnostics.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-10 (2021).</li><li>Nguyen, P. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wearable+materials+with+embedded+synthetic+biology+sensors+for+biomolecule+detection.">Wearable materials with embedded synthetic biology sensors for biomolecule detection.</a> Nature Biotechnology. 39 (11), 1366-1374 (2021).</li><li>Pellinen, T., Huovinen, T., Karp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-free+biosensor+for+the+detection+of+transcriptional+inducers+using+firefly+luciferase+as+a+reporter.">A cell-free biosensor for the detection of transcriptional inducers using firefly luciferase as a reporter.</a> Analytical Biochemistry. 330 (1), 52-57 (2004).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+protein+synthesis+approach+to+biosensing+hTR&#946;-specific+endocrine+disruptors.">Cell-free protein synthesis approach to biosensing hTR&#946;-specific endocrine disruptors.</a> Analytical Chemistry. 89 (6), 3395-3401 (2017).</li><li>Salehi, A. S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensing+estrogenic+endocrine+disruptors+in+human+blood+and+urine:+A+RAPID+cell-free+protein+synthesis+approach.">Biosensing estrogenic endocrine disruptors in human blood and urine: A RAPID cell-free protein synthesis approach.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 345, 19-25 (2018).</li><li>Voyvodic, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+metabolic+transducers+expand+the+chemical+detection+space+of+cell-free+biosensors.">Plug-and-play metabolic transducers expand the chemical detection space of cell-free biosensors.</a> Nature Communications. 10 (1), 1-8 (2019).</li><li>Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplifying+and+streamlining+Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis.">Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).</li><li>Gr&#228;we, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+paper-based,+cell-free+biosensor+system+for+the+detection+of+heavy+metals+and+date+rape+drugs.">A paper-based, cell-free biosensor system for the detection of heavy metals and date rape drugs.</a> PLOS One. 14 (3), 0210940 (2019).</li><li>Green, A. A., Silver, P. A., Collins, J. J., Yin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toehold+Switches:+De-Novo-Designed+Regulators+of+Gene+Expression.">Toehold Switches: De-Novo-Designed Regulators of Gene Expression.</a> Cell. 159 (4), 925-939 (2014).</li><li>Craw, P., Balachandran, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+nucleic+acid+amplification+technologies+for+point-of-care+diagnostics:+a+critical+review.">Isothermal nucleic acid amplification technologies for point-of-care diagnostics: a critical review.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2469-2486 (2012).</li><li>Zyrina, N. V., Antipova, V. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonspecific+Synthesis+in+the+Reactions+of+Isothermal+Nucleic+Acid+Amplification.">Nonspecific Synthesis in the Reactions of Isothermal Nucleic Acid Amplification.</a> Biochemistry (Moscow). 86 (7), 887-897 (2021).</li><li>Takahashi, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low-cost+paper-based+synthetic+biology+platform+for+analyzing+gut+microbiota+and+host+biomarkers.">A low-cost paper-based synthetic biology platform for analyzing gut microbiota and host biomarkers.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-12 (2018).</li><li>Karlikow, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Field+validation+of+the+performance+of+paper-based+tests+for+the+detection+of+the+Zika+and+chikungunya+viruses+in+serum+samples.">Field validation of the performance of paper-based tests for the detection of the Zika and chikungunya viruses in serum samples.</a> Nature Biomedical Engineering. 6 (3), 246-256 (2022).</li><li>Agarwala, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Database+resources+of+the+National+Center+for+Biotechnology+Information.">Database resources of the National Center for Biotechnology Information.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 7-19 (2016).</li><li>. BLAST: Basic Local Alignment Search Tool Available from: <a target="_blank" href="https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi">https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> (2022)</li><li>Deiman, B., Van Aarle, P., Sillekens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+applications+of+nucleic+acid+sequence-based+amplification+(NASBA).">Characteristics and applications of nucleic acid sequence-based amplification (NASBA).</a> Molecular Biotechnology. 20 (2), 163-179 (2002).</li><li>Zadeh, J. N., Wolfe, B. R., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleic+acid+sequence+design+via+efficient+ensemble+defect+optimization.">Nucleic acid sequence design via efficient ensemble defect optimization.</a> Journal of Computational Chemistry. 32 (3), 439-452 (2011).</li><li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+DNA+Gel+Electrophoresis.">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).</li><li>Lanciotti, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+serologic+properties+of+Zika+virus+associated+with+an+epidemic,+Yap+State,+Micronesia,+2007.">Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007.</a> Emerging Infectious Diseases. 14 (8), 1232 (2008).</li><li>Walsh, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardizing+automated+DNA+assembly:+Best+practices,+metrics,+and+protocols+using+robots.">Standardizing automated DNA assembly: Best practices, metrics, and protocols using robots.</a> SLAS Technology. 24 (3), 282 (2019).</li><li>Silva, S. J. R., de Magalh&#227;es, J. J. F., de Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+circulation+of+DENV,+CHIKV,+ZIKV+and+SARS-CoV-2+in+Brazil:+An+inconvenient+truth.">Simultaneous circulation of DENV, CHIKV, ZIKV and SARS-CoV-2 in Brazil: An inconvenient truth.</a> One Health. 12, 100205 (2021).</li><li>Kimura, S., Fujinaga, K., Sekiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR+machine.+Tanpakushitsu+kakusan+koso.">PCR machine. Tanpakushitsu kakusan koso.</a> Protein, Nucleic Acid, Enzyme. 41 (5), 514-517 (1996).</li><li>Arce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decentralizing+cell-free+RNA+sensing+with+the+use+of+low-cost+cell+extracts.">Decentralizing cell-free RNA sensing with the use of low-cost cell extracts.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 727584 (2021).</li><li>Silva, S. J. R., Pardee, K., Balasuriya, U. B. R., Pena, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+one-step+reverse+transcription+loop-mediated+isothermal+amplification+(RT-LAMP)+for+rapid+detection+of+ZIKV+in+patient+samples+from+Brazil.">Development and validation of a one-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP) for rapid detection of ZIKV in patient samples from Brazil.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nature Biotechnology. 19 (8), 751-755 (2001).</li><li>Lavickova, B., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+robust,+and+low-cost+method+to+produce+the+PURE+cell-free+system.">A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system.</a> ACS Synthetic Biology. 8 (2), 455-462 (2019).</li></ol>

K.P. ve A.A.G., kağıt tabanlı ayak parmağı sensörü ile ilgili teknolojilerin ortak mucitleridir. Y.G., S.C. ve K.P., LSK Technologies, Inc.'in kurucu ortaklarıdır ve PLUM ile ilgili teknolojilerin ortak mucitleridir. M.K., K.P. ve A.A.G., En Carta Diagnostics Ltd.'nin kurucu ortaklarıdır. Diğer yazarların çıkar çatışması yoktur. Patentler: PLUM cihazı: Y.G., S.C. ve K.P. patent başvurusu Toronto Üniversitesi tarafından yapıldı ve LSK Technologies Inc. ABD Geçici Patent Başvurusu No. 62/982,323'e atandı 27 Şubat 2020'de dosyalandı; Toehold anahtar patenti: A.A.G., P.Y. ve J.J. C. "Ribororegülatör bileşimleri ve kullanım yöntemleri", Patent. WO2014074648A3 6 Kasım 2012'de dosyalandı; Kağıt bazlı teşhis patenti: K.P. ve J.J.C. "Kağıt bazlı sentetik gen ağları" ABD patenti bekleniyor No. US15/963,831 6 Aralık 2013 tarihinde dosyalandı; Zika patent 1: K.P., A.A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. ve J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform," ABD Geçici Patent Başvurusu No. 62/403,778 4 Ekim 2016 tarihinde dosyalanmıştır; Zika patent 2: K.P., A. A.G., M.K.T., D.B., G.L., T.F. ve J.J.C., "Portable, Low-Cost Virus Detection and Strain Identification Platform," ABD Geçici Patent Başvurusu No. 62/341,221, 25 Mayıs 2016'da dosyalandı.

Burada açıklanan kombine kağıt tabanlı sistem, işlevsel olarak RT-qPCR ile karşılaştırılabilir performansla klinik olarak ilgili moleküler tanılamayı ihtiyaç noktasınagetirebilir 6. Daha da önemlisi, uzak ayarlar için, yerinde tanılamanın kullanılabilirliği, sonuç alma süresini günlerden saatlere düşürebilir. Bu yaklaşımın programlanabilirliğini vurgulayarak, tarif edilen boru hattı hemen hemen her patojen hedefini tespit etmek için kullanılabilir. Moleküler aletleri, kompakt ve pille çalışma (8-9 saat) ile uyumlu olan ve dağıtılmış uygulamaları etkinleştirmek için yerleşik veri analizi sağlayan amaca yönelik bir taşınabilir plaka okuyucu ile eşleştirdik. Diğer çalışmalarda, RT-qPCR'ye paralel olarak 268 hasta örneği ile birleştirilmiş donanım ve Zika virüsü tanı platformunu doğruladık ve% 98.5'lik bir tanı doğruluğu bulduk24. Birlikte ele alındığında, amacımız bu platformun araştırmacılara teknoloji transferini sağlamaktır, böylece karşılanmamış teşhis ihtiyaçlarını karşılamak için topluluk tarafından yeniden kullanılabilir ve geliştirilebilir.
In silico toehold anahtar tasarım süreci, üç aşamaya ayrılabilen bir boru hattına entegre edilmiş ve otomatikleştirilmiştir. İlk aşama, bir nükleotid artışıyla hedef diziye melezleşen bir ayak parmağı anahtarı tasarımları havuzu oluşturur. İkinci aşama, ikincil yapıyı ve ayak parmağı tutma anahtarının kullanılabilirliğini inceler ve çerçeve içi erken durdurma kodonları ile sensörleri ortadan kaldırır. Birden fazla faktörü (örneğin, ayak parmağı anahtarının kusur seviyesi, ayak parmağı tutma anahtarı kullanılabilirliği ve hedef site erişilebilirliği) dikkate alan bir puanlama işlevi daha sonra genel puanlara göre üst ayak parmağı anahtarı tasarımlarını seçmek için uygulanır. Son aşamada, üst ayak parmağı anahtar tasarımları ve bunlara karşılık gelen hedef tetikleyiciler için bir dizi listesi oluşturulur. Üst sensör dizileri, NCBI / Primer-BLAST25 kullanılarak insan transkriptomuna ve yakından ilişkili viral genomlara karşı özgüllük açısından taranmalıdır. Ayrıca, sensörlerin geniş ve sağlam algılama sağlayacağından emin olmak için Zika viral genomunda sekans koruması için sensör hedef bölgelerini taramak en iyi uygulamadır. Toehold anahtar tasarım yazılımının çeşitli versiyonları geliştirilmiştir ve tasarım algoritması, kullanıcıların A 6 serisi veya B serisi toeholdanahtarları 6 olmak üzere iki versiyon oluşturmalarını sağlar. Bu yazıda, B serisi ayak parmağı anahtarı tasarımına odaklanılmıştır.
Ticari DNA sentezini takiben, ayak parmağı anahtarları hızlı bir şekilde monte edilebilir ve daha sonra hedef genomun kısa bölgelerine (200-300 nt) karşılık gelen sentetik bir hedef tetikleme dizisine karşı bir başlangıç taraması yapılarak test edilebilir. Ayak parmağı anahtarı tabanlı sensörlerin performansını taramak için, hedef diziyi RNA şeklinde eklemek idealdir. Bu makalede, in vitro transkribe edilmiş tetikleyici RNA'yı eklemek için gereken adımlar özetlenmiştir. Bununla birlikte, eğer varsa, niceliklendirilmiş viral RNA ekstraktları veya ticari sentetik RNA genomları veya standartları gibi tam uzunlukta genom şablonları kullanılabilir. İlk ayak parmağı anahtarı taraması için tam uzunlukta RNA genomlarının kullanılması, RNA ikincil yapısı gibi ek faktörlerin sensör performansını etkileyip etkilemeyeceğini bildirebileceği için faydalıdır. Aday anahtarların ON/OFF oranını optimize etmek için, ayak parmağı anahtarı DNA'sı hücresiz reaksiyona titre edilebilir. Bu adım aynı zamanda yüksek performanslı ayak parmağı tutma anahtarlarını (katlanır amplifikasyon veya yüksek AÇIK/KAPALI oranı) tanımlamaya ve sızıntılı ayak parmağı anahtarlarını (hedef RNA'nın yokluğunda yüksek sinyal) aşağı akış karakterizasyon adımlarından çıkarmaya da hizmet edebilir.
En iyi performans gösteren ayak parmağı anahtarı adaylarının tespit sınırını iyileştirmek için NASBA, klinik olarak ilgili hedef Zika viral RNA konsantrasyonlarını, ayak parmağı anahtarları6 tarafından tespit edilebilecek bir seviyeye çıkarmak için kullanılır. Klinik olarak ilgili konsantrasyonlarda tespiti mümkün kılmak için en iyi NASBA primer ve ayak parmağı anahtarı kombinasyonlarını belirlemek için ileri ve geri astar setlerinin farklı kombinasyonları taranır. İdeal bir astar seti ve ayak parmağı anahtarı kombinasyonu belirlendikten sonra, tahlil klinik doğrulamaya götürülür. Ayak parmağı anahtarının ve NASBA tarama aşamalarının emek ve kaynak yoğun olabileceğini ve bu nedenle test geliştirmenin iyi kaynaklara sahip araştırma alanlarına en uygun olduğunu belirtmek önemlidir. Süreç otomasyonu uygulamamış olsak da, bunun yinelemeli tasarım, yapı ve test döngüsü32'yi hızlandırması muhtemeldir. Neyse ki, sensör tasarımı ve testinden devreye alınmasına kadar geçen geri dönüş süresi oldukça kısa olabilir (bir haftadan az), bu da bu stratejiyi salgın salgınlar gibi zaman açısından kritik durumlar için ideal hale getirir6.
Klinik olarak ilgili duyarlılığa sahip bir biyosensör geliştirildikten sonra bile, ele alınması gereken teknik zorluklar vardır. Bu protokol manuel çalışmayı içerdiğinden ve çok adımlı bir prosedür olduğundan, numuneler arasında çapraz kontaminasyon riski vardır. Dikkatli laboratuvar uygulamaları ile bu riski azaltmak için elimizden gelenin en iyisini yapıyoruz. 268 hasta örneğinden oluşan yakın tarihli bir klinik çalışmada, herhangi bir kontaminasyon sorunuyla karşılaşmadık; ancak, bu önemli bir husustur24. Bunu akılda tutarak, protokol bir laboratuvar tahlili olmaya devam eder ve uygun moleküler biyoloji tekniklerine hakim yetenekli bir kullanıcı gerektirir. Dağıtım için ek bir husus, hasta örneklerinden RNA izolasyonudur. Burada RNA izolasyonunu kolon bazlı nükleik asit ekstraksiyon kitleri kullanarak tanımlıyoruz. Bununla birlikte, diğer çalışmalarda, düşük yüklü hasta numune işleme6 için etkili ve basit bir kaynar lizis yöntemi (2 dakika boyunca 95 ° C) gösterdik. Bu strateji, RNA ekstraksiyonu ile ilişkili maliyeti neredeyse ortadan kaldırır ve COVID-19 pandemisi33 gibi krizler sırasında düşük kaynak ortamlarında veya tedarik zinciri sorunlarında lojistik bir zorluk oluşturabilecek sütun tabanlı nükleik asit ekstraksiyon kitlerinin kullanılmasını önler.
COVID-19 pandemisi sırasında gördüğümüz gibi, RT-qPCR'yi gerçekleştirmek için kullanılan aletlerin kendileri bir darboğaz görevi görebilir ve hastanın testlere erişimini sınırlayabilir. Aynı zamanda büyük ölçüde finansal olan bu faktör, tanılama erişimini sınırlayabilen merkezi bir test moduna yol açar. Örneğin, 2015/2016 Zika salgını sırasında, Brezilya'da sadece beş ulusal referans laboratuvarı mevcuttu ve bu da hasta testlerinde gecikmelere neden oldu. Ölçek ekonomilerinin potansiyel faydasını göz önünde bulundurmadan, taşınabilir plaka okuyucu için malların mevcut maliyeti ~ 500 ABD Dolarıdır; bu, işgücü ve ticari marjı hesaba katmak için beş kat artırılmış olsa bile, yine de uygun fiyatlı bir araç sağlar. Bu, maliyeti 15.000-90.000 ABD Doları34 ABD Doları arasında değişen RT-qPCR cihazlarıyla iyi bir şekilde karşılaştırılır. Ayrıca, Latin Amerika'daki hücresiz tahlil için test başına tahmini maliyet yaklaşık 5.48 ABD Doları, Brezilya'daki RT-qPCR testi başına maliyet ise Zika salgını36 sırasında ~ 10-11 ABD Doları idi. Ekipman maliyetinin ötesinde, taşınabilir plaka okuyucu küçük bir ayak izine (20 cm3), otomatik analize, internet üzerinden buluta veri yüklemeye sahiptir ve pil gücüyle çalıştırılabilir. Bu özellikler, testin uygulanabileceği potansiyel ortamları önemli ölçüde genişletir ve aynı zamanda hizmet verilebilecek hasta popülasyonunu genişletir.
Bugüne kadar en yaygın ticari E. coli CFPS platformları S30 ve PURE sistemleri37; Bununla birlikte, düşük ve orta gelirli ülkelerde teşhise erişimin iyileştirilmesinde önemli bir husus, bu reaktiflerin sınırlı yerel mevcudiyetidir. Bu zorluğun çözümüne yönelik önemli bir adım, yerel CFPS üretiminin geliştirilmesidir. Federici laboratuvarı son zamanlarda lizat bazlı hücresiz sistemlerde ayak parmağı anahtarı tabanlı sensörleri uygulamak için ticari olmayan bir platform geliştirmeye yönelik önemli ilerleme kaydetti ve Zika virüsü RNA14 ile 2.7 fM LOD'ye ulaştı. Bu başarı sadece reaktiflerin kullanım ülkesinde yapılmasına izin vermekle kalmaz, ithalat tarifelerinden ve gecikmelerden kaçınır, aynı zamanda işçilik maliyetleri de yerel oranlara ölçeklenir ve böylece genel maliyet önemli ölçüde azaltılabilir. Federici grubu tarafından özetlenen çalışmada, Şili'de CFPS ekspresyon reaksiyonunu (5 μL) üretmenin maliyeti 6,9 sent (USD) 35,38 idi ve lizat bazlı sistemlerin uygulanması için ikili bir teşvik (geliştirilmiş lojistik ve maliyet) sağladı35,38.
RT-qPCR ile karşılaştırılabilir testlerin dağıtılmış tanılama ağlarına yerleştirilmesi, numunelerin merkezi RT-qPCR tesislerine taşınmasına bağlı olan mevcut uygulamalara göre önemli avantajlar sağlayabilir. Zika vakalarının yoğunlaştığı peri-kentsel ortamlarda, bir hasta ile tanı tesisi arasındaki fiziksel mesafe tanıyı yavaşlatır ve sonuçların klinik olarak ilgili bir zamanda hastaya ulaşmama riskini artırır. Burada sunulan çalışmanın, araştırma topluluğunun, bilgi aktarımı yoluyla, insan sağlığı, tarım ve çevresel izleme için merkezi olmayan biyoteknolojiler ve taşınabilir donanımlar oluşturmasını sağlamaya katkıda bulunabileceğini umuyoruz.

RT-qPCR, mükemmel duyarlılığı ve özgüllüğü nedeniyle klinik teşhis için altın standart teknoloji olmaya devam etmiştir. Son derece sağlam olmasına rağmen, yöntem sıcaklık kontrollü dağıtım ve depolama gerektiren pahalı, özel ekipman ve reaktiflere bağlıdır. Bu, özellikle hastalık salgınları zamanlarında ve iyi donanımlı laboratuvarlara erişiminsınırlı olduğu bölgelerde 1,2 küresel olarak kaliteli teşhisin erişilebilirliğinin önünde önemli engeller sunmaktadır. Bu, Brezilya'daki 2015/2016 Zika virüsü salgını sırasında gözlendi. RT-qPCR testi sağlamak için yalnızca beş merkezi laboratuvar bulunduğundan, tanılamaya erişimi sınırlayan önemli darboğazlar ortaya çıktı. Bu, özellikle salgından daha ciddi şekilde etkilenen kentsel ortamlardaki bireyler için zorlayıcıydı 3,4. Tanılamaya erişimi iyileştirmek amacıyla protokol, düşük kaynak ayarlarında merkezi olmayan, düşük maliyetli ve yüksek kapasiteli tanılama sağlama potansiyeli ile geliştirilmiş bir platform göstermektedir. Bunun bir parçası olarak, izotermal amplifikasyon ve sentetik RNA anahtar tabanlı sensörleri kağıt tabanlı hücresiz ekspresyon sistemleri ile birleştiren bir teşhis keşif boru hattı kuruldu 5,6.
Hücresiz protein sentezi (CFPS) sistemleri, özellikle E. coli bazlı hücresiz sistemler, çevresel izleme 7,8'den patojen teşhisine kadar çok çeşitli biyo-algılama uygulamaları için çekici bir platformdur 5,6,9,10,11,12 . Transkripsiyon ve translasyon için gerekli bileşenleri içeren CFPS sistemleri, tüm hücre biyosensörlerine göre önemli avantajlara sahiptir. Spesifik olarak, algılama bir hücre duvarı ile sınırlı değildir ve genel olarak, tasarımda modülerdir, biyogüvenli, ucuzdur ve taşınabilir kullanım için dondurularak kurutulabilir. Gen devresi tabanlı reaksiyonları kağıt veya tekstil gibi substratlara dondurma-kurutma yeteneği, taşıma, oda sıcaklığında uzun süreli depolama5 ve hatta giyilebilir teknolojiye dahil edilmesini sağlar13.
Önceki çalışmalar, E. coli hücresiz sistemlerin, cıva gibi toksik metaller, tetrasiklin 7,14 gibi antibiyotikler, endokrin bozucu kimyasallar 15,16, hippurik asit 17 gibi biyobelirteçler, patojenle ilişkili çekirdek algılama molekülleri 9,18 ve kokain17 gibi yasadışı maddeler ve gama hidroksibutirat (GHB)19 gibi yasadışı maddeler gibi çok sayıda analiti tespit etmek için kullanılabileceğini göstermiştir. . Nükleik asitlerin diziye özgü tespiti için, stratejiler çoğunlukla izotermal amplifikasyon tekniklerine bağlı anahtar tabanlı biyosensörlerin kullanımına dayanmaktadır. Toehold anahtarları, ribozomal bağlanma bölgesini (RBS) ve başlangıç kodonunu ayırarak aşağı akış çevirisini engelleyen bir saç tokası yapısı içeren sentetik riborgülatörlerdir (metnin geri kalanında basitçe 'anahtarlar' olarak da adlandırılır). Hedef tetikleyici RNA'ları ile etkileşime girdikten sonra, saç tokası yapısı rahatlar ve daha sonra bir muhabir açık okuma çerçevesinin çevirisi sağlanır20.
İzotermal amplifikasyon moleküler tanı21 olarak da kullanılabilir; Bununla birlikte, bu yöntemler spesifik olmayan amplifikasyona eğilimlidir, bu da özgüllüğü ve dolayısıyla testin doğruluğunu RT-qPCR 22'nin altına düşürebilir. Burada bildirilen çalışmada, anahtar tabanlı sensörlerin yukarı akış izotermal amplifikasyonu, nükleik asitlerin (femtomolar ila attomolar) klinik olarak ilgili tespitini sağlayan kombine sinyal amplifikasyonu sağlamak için kullanılmıştır. İki yöntemin bu eşleşmesi, kombinasyon halinde, yüksek düzeyde özgüllük sağlayan iki diziye özgü kontrol noktası da sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, önceki çalışmalar Zika6, Ebola5, Norovirüs 10 gibi virüslerin yanı sıra C. difficile23 ve antibiyotiğe dirençli Tifo12 gibi patojenik bakterilerin tespitini göstermiştir. Son zamanlarda, COVID-19 pandemisi için erişilebilir teşhis sağlama çabalarında SARS-CoV-2 tespiti için hücresiz ayak parmağı anahtarları gösterilmiştir11,12,13.
Aşağıdaki protokol, in silico biyosensör tasarımından montaj ve optimizasyon adımlarına, hasta örnekleriyle saha doğrulamasına kadar Zika virüsü tespiti için hücresiz, kağıt bazlı sentetik ayak parmağı anahtar testinin geliştirilmesini ve doğrulanmasını özetlemektedir. Protokol, RNA ayak parmağı anahtar tabanlı sensörlerin ve Zika viral RNA'ya özgü izotermal amplifikasyon primerlerinin in silico tasarımı ile başlar. Çok sayıda izotermal amplifikasyon yöntemi mevcut olmasına rağmen, burada reaksiyonda bulunan viral RNA hedefinin konsantrasyonunu arttırmak için nükleik asit dizisine dayalı amplifikasyonun (NASBA) kullanımı klinik olarak anlamlı duyarlılık sağlamıştır. Pratik olarak, izotermal amplifikasyon yöntemleri, sabit bir sıcaklıkta çalışma avantajına sahiptir ve genellikle merkezi konumlarla sınırlı olan termal döngüleyiciler gibi özel ekipmanlara olan ihtiyacı ortadan kaldırır.
Daha sonra, sentetik ayak parmağı anahtar sensörlerinin örtüşme uzatma PCR aracılığıyla muhabir kodlama dizileri ile birleştirilmesi ve sentetik RNA kullanan hücresiz sistemlerde optimum performans için sentetik ayak parmağı anahtar sensörlerinin taranması işlemi açıklanmaktadır. Bu Zika virüsü sensörleri seti için, kolorimetrik bir substrat olan klorofenol kırmızı-β-D-galaktopiranosid (CPRG) ile göz veya plaka okuyucu ile tespit edilebilen sarıdan mora renk değişimi üretmek için β-galaktosidaz enzimini kodlayan lakZ genini seçtik. En iyi performans gösteren sentetik anahtarlar belirlendikten sonra, en iyi hassasiyeti sağlayan setleri bulmak için sentetik RNA kullanarak karşılık gelen hedef dizinin nükleik asit dizisi tabanlı izotermal amplifikasyonu için primerlerin taranması işlemi açıklanmaktadır.
Son olarak, teşhis platformunun performansı Latin Amerika'da yerinde doğrulanmıştır (Şekil 1). Klinik tanısal doğruluğu belirlemek için, kağıt tabanlı hücresiz tahlil, hastalardan alınan Zika virüsü örnekleri kullanılarak gerçekleştirilir; paralel olarak karşılaştırma için altın standart RT-qPCR testi yapılır. Kolorimetrik hücresiz tahlilleri izlemek için, termal döngücülerin bulunmadığı bölgelerdeki sonuçların yerinde ölçülmesini sağlıyoruz. Portable, Low-Cost, User-friendly, Multimodal (PLUM; bundan böyle portatif plaka okuyucu olarak anılacaktır) olarak adlandırılan elle monte edilmiş plaka okuyucu da burada tanıtılmaktadır24. Başlangıçta hücresiz sentetik ayak parmağı anahtarı tanılaması için tamamlayıcı bir cihaz olarak geliştirilen taşınabilir plaka okuyucu, sonuçları yüksek verimli bir şekilde inkübe etmek ve okumak için erişilebilir bir yol sunarak, kullanıcılar için entegre, bilgisayar görüşü tabanlı yazılım analizi sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig1v9.jpg"> Şekil 1: Kağıt tabanlı hücresiz ayak parmağı anahtarı reaksiyonlarını kullanarak hasta örneklerini test etmek için iş akışı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig1v8large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - aluminum</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1995</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the PLUM reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plate covers - transparent</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>95.1994</td>
			<td>Used to cover the 384-well plates before they are inserted into the BioTek plate reader</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA11006-180</td>
			<td>2 mm paper-based diagnostics are placed into the wells of these plates for quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>AGA001.500</td>
			<td>Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>ALB001.500</td>
			<td>Blocking agent for the Whatman filter paper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell free reactions</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6800L</td>
			<td>PURExpress</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPRG</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10884308001</td>
			<td>Chlorophenol red-b-D-galactopyranoside</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Sterile Biopsy Punches</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>23233-31</td>
			<td>Used to create 2 mm paper discs that fit into a 384-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K2981</td>
			<td>Digests template DNA following incubation of the in vitro transcription reaction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse I Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>74104</td>
			<td>DNase I Kit For removing template DNA from IVT RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>electrophoresis system</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704487</td>
			<td>Used to run the agarose gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imaging station</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1708265</td>
			<td>ChemiDoc XRS+ Imaging System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVT kit</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E2040S</td>
			<td>Used for in vitro transcribing template (trigger) RNA for switch screening</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop One</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td>Used for determining nucleic acid concentrations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NASBA kit</td>
			<td>Life Sciences Advanced Technologies</td>
			<td>NWK-1</td>
			<td>Isothermal amplification reaction components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free H20</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>10977015</td>
			<td>Added to reaction mixes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAGE electrophoresis system</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td>Used to cast and run polyacrylamide gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCOLADuet-LacZ DNA</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>75006</td>
			<td>https://www.addgene.org/75006/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phusion polymerase/reactioin buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0530L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate reader</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>BioTek NEO2</td>
			<td>Multi Mode Plate Reader, Synergy Neo2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>Custom oligo synthesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q5 polymerase/reaction buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0491L</td>
			<td>Used for PCRs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qiagen PCR Puriifcation Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>27106</td>
			<td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA loading dye</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0363S</td>
			<td>2X RNA loading dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>EN0521</td>
			<td>QIAamp Viral RNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase inhibitor</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0314S</td>
			<td>Used to prevent contamination of RNases A, B, and C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RT-qPCR kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>208352</td>
			<td>QuantiNova Probe RT-PCR Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYBR Gold</td>
			<td>Invitrogen S11494</td>
			<td>S11494</td>
			<td>PAGE gel stain for nucleic acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAE Buffer</td>
			<td>BioShop Canada</td>
			<td>TAE222.4</td>
			<td>Gel electrophoresis buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4484073</td>
			<td>Used for temperature cycling and incubating reactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 42 filter paper</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>1442-042</td>
			<td>Used to imbed molecular components for paper-based diagnostics</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics

Test için topluma dağıtılabilecek düşük yüklü moleküler teşhislere erişim giderek daha önemli hale gelmekte ve toplumların refahı ve ekonomik istikrar için anlamlı daha geniş etkilere sahiptir. Son yıllarda, hızlı, düşük maliyetli moleküler teşhis ihtiyacını karşılamak için birkaç yeni izotermal tanı yönteminin ortaya çıktığı görülmüştür. Bu çabaya, altın standart ters transkripsiyon-kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) tabanlı testlerle karşılaştırılabilir performans sağlayan sivrisinek kaynaklı Zika ve chikungunya virüsleri için teşhis de dahil olmak üzere, ayak parmağı anahtarı tabanlı teşhislerin geliştirilmesi ve hasta doğrulaması yoluyla katkıda bulunduk. Bu tanılamaların geliştirilmesi ve üretilmesi ucuzdur ve düşük kaynaklı ortamlara tanılama kapasitesi sağlama potansiyeline sahiptir. Burada protokol, Zika virüsü tespiti için anahtar tabanlı bir tahlilin geliştirilmesi için gerekli tüm adımları sağlar. Makale, okuyucuları aşamalı tanısal geliştirme sürecinden geçirir. İlk olarak, Zika virüsünün genomik dizileri, açık kaynaklı yazılım kullanarak aday anahtarların hesaplamalı tasarımı için girdiler olarak hizmet eder. Daha sonra, sentetik RNA dizileri ile ampirik tarama için sensörlerin montajı ve teşhis duyarlılığının optimizasyonu gösterilmiştir. Doğrulama tamamlandıktan sonra, RT-qPCR'ye paralel olarak hasta numuneleri ve amaca yönelik bir optik okuyucu olan PLUM ile gerçekleştirilir. Bu çalışma, araştırmacılara insan sağlığı, tarım ve çevresel izleme uygulamaları için düşük maliyetli ayak parmağı anahtarı tabanlı sensörlerin geliştirilmesi için teknik bir yol haritası sunmaktadır.

Hesaplamalı tasarım boru hattını takiben, üç ayak parmağı anahtarının yapımı PCR tarafından gerçekleştirildi. PCR ürünleri agaroz jel elektroforezi kullanılarak analiz edildi (Şekil 2). 3.000 bp civarında berrak bir bandın varlığı, kabaca bir ayak parmağı anahtarına bağlı lakZ geninin boyutu, tipik olarak başarılı bir reaksiyonu gösterir. Alternatif olarak, bandı olmayan bir şerit, birden fazla bant veya yanlış boyutta bir bant, başarısız bir PCR'yi gösterir. Başarısız bir PCR durumunda, reaksiyon koşulları ve / veya primer dizileri optimize edilmelidir.
Birleştirilen ayak parmağı anahtarları, her bir sensörü ilgili in vitro transkribe edilmiş tetik RNA'sına karşı değerlendirmek için tarandı (Şekil 3). Her üç sensör de artan OD570 absorbansı gösterirken, anahtar 27B (Şekil 3A) en hızlı açılış oranına sahipti. 33B anahtarları ve daha az ölçüde 47B, hedef tetikleyici RNA'nın yokluğunda OD570 absorbansının arttığını gösterdi, bu da bu anahtarların bazı arka plan aktivitesine veya sızıntıya sahip olduğunu gösteriyor (Şekil 3B, C) - özgüllüğü azaltabileceği için aday sensörde istenmeyen bir özellik. En yüksek AÇIK/KAPALI sinyal oranına sahip sensörü daha net bir şekilde tanımlamak için, OD570 absorbansının katlama değişimi hesaplanmış (ek bilgiler bölüm 5'e bakınız) ve çizilmiştir (Şekil 4). Bu analizden, anahtar 27B'nin yaklaşık 60 ON / OFF oranıyla en iyi performansa sahip sensör olduğu açıktır.
En iyi performans gösteren ayak parmağı tutma anahtarının (27B) duyarlılığı daha sonra NASBA reaksiyonu ile birleştirildiğinde ayak parmağı tutma anahtarını aktive etmek için gereken en düşük RNA konsantrasyonu belirlenerek değerlendirildi. Grafik, en iyi performans gösteren Zika sensörlerinin RNA'yı μL başına 1.24 molekül kadar düşük konsantrasyonlarda tespit edebildiğini göstermektedir (~ 2'ye eşdeğer; Şekil 5).
Anahtar 27B tanımlandıktan ve doğrulandıktan sonra, sensör malzemeleri Brezilya'nın Pernambuco eyaletindeki Recife'deki ekip üyelerine dağıtıldı. Brezilya'da, Zika virüsü tanı platformunun klinik tanısal doğruluğu, karşılaştırma için RT-qPCR'ye paralel olarak Zika virüsü hasta örnekleri kullanılarak değerlendirildi. Kağıt tabanlı Zika teşhis platformunu doğrulamak için, kağıt tabanlı sensörlerin kolorimetrik çıktısını inkübe edebilen ve okuyabilen taşınabilir plaka okuyucu kullanılmıştır. Sarıdan mora renk değişimi, pozitif bir numuneyi tanımlamak için kullanılırken, negatif bir numune sarı kalır (Şekil 6). Portatif plaka okuyucu tarafından oluşturulan sonuçları görselleştirmek için ek bir seçenek (Şekil 8), zaman içinde her kağıt tabanlı reaksiyon için kolorimetrik yanıtı çizmektir. Örnekler üçlü olarak test edildi ve eşiği aşanlar (kırmızı çizgi 1 olarak ayarlandı) pozitif kabul edilirken, eşiğin altındaki örnekler negatif olarak kabul edildi (Şekil 6 ve Şekil 7).
Son olarak, Zika ayak parmağı anahtar sensörünün klinik performansını Zika virüsü enfeksiyonunu teşhis etmek için mevcut altın standart yöntemle değerlendirmek ve karşılaştırmak için, tüm hasta örnekleri RT-qPCR ile paralel olarak test edilmiştir. İki temsili hasta örneğinin amplifikasyon grafiği, RT-qPCR ile Zika virüsünün tespiti için üçlü olarak test edildi (Şekil 9). Döngü eşiği (Ct) değeri ≤38 olduğunda numuneler pozitif olarak kabul edilir; kırmızı çizgi pozitif bir örneği gösterir ve mavi çizgi Zika virüsü için negatif bir örneği gösterir.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig2v6.jpg"> Resim 2: PCR ürünlerinin kalitesini değerlendirmek için agaroz jel elektroforezi. PCR ürünleri, 1X TAE'de% 1'lik bir agaroz jeli üzerinde analiz edilir, 90 dakika boyunca 80 V'ta çalıştırılır. Tek bir şeffaf bant tipik olarak başarılı bir reaksiyonu gösterir. Şerit 1: 1 kb DNA merdiveni; Şerit 2-4: 27B anahtar DNA, 33B tetikleyici DNA ve 47B tetikleyici DNA, sırasıyla. Sol taraftaki sayılar bp cinsinden bant boyutunu temsil <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig02large.jpg" target="_blank">eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6.jpg"> Şekil 3: Kağıt tabanlı Zika sensörleri için üç ayak parmağı anahtarının prototiplenmesi. Üç kağıt tabanlı RNA ayak parmağı anahtar sensörünün performansı, 130 dakikadan fazla bir süre boyunca 37 ° C'de ölçüldü. Her grafik iki izleme içerir, biri yalnızca anahtar denetimini temsil ederken, diğeri anahtarı ve tetikleyiciyi temsil eder. Üç grafik, ayak parmağı anahtar sensörleri 27B (A), 33B (B) ve 47B (C) kullanılarak elde edilen verileri temsil eder. Hata çubukları, üç çoğaltmadan ortalamanın (SEM) standart hatasını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig03v6large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig04v7.jpg"> Şekil 4: En iyi performans gösteren sensörler, 570 nm'de absorbanstaki kıvrım değişiminin hesaplanmasıyla tanımlanır. Katlama değişimi (veya maksimum AÇIK/KAPALI oranı), yalnızca anahtar kontrolü ile anahtar artı tetik CFPS testi arasındaki 130 dakikada absorbans oranının (OD570) ölçülmesiyle hesaplanır. Hata çubukları, üç çoğaltmadan SEM'i temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig4v8large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig05v7.jpg"> Şekil 5: En iyi performans gösteren anahtarın duyarlılık değerlendirmesi. In vitro transkribe edilmiş Zika RNA, NASBA reaksiyonlarına titre edilir. 1 saatlik bir inkübasyondan sonra, reaksiyonlar kağıt diskler üzerindeki hücresiz PURExpress reaksiyonlarına 1: 7 oranında eklendi. 37 °C'de 130 dakika sonra kıvrım değişimi çizilir. Bu rakam24'ten çoğaltılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig05v4large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig6v9.jpg"> Şekil 6: Yakalanan görüntü verileriyle yüklenen taşınabilir plaka okuyucu yakalama sayfası. Bu şekilde, veri toplama çalışması sırasında taşınabilir plaka okuyucu tarafından yakalanan son görüntünün örnek bir resmi gösterilmektedir. Orijinal tarih/saat damgası resmin üst kısmında görünür. Sarı renk kontrolü veya negatif reaksiyonları, mor renk ise pozitif reaksiyonu gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig6v8large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig7v9.jpg"> Şekil 7: Veri analizi modu. Sol tarafta, kullanıcılar çizmek istedikleri veri kümelerini seçerler; grafikler daha sonra her örnek veya kontrol kümesi için benzersiz renklerle sağda görüntülenir. Kesikli kırmızı çizgi, pozitif ve negatif örnekleri belirlemek için bir eşik görevi görür. Eşiği aşan üçlü olarak test edilen numuneler pozitif olarak kabul edilirken, eşiğin altındaki numuneler negatif olarak kabul edilir. Hata çubukları, üç çoğaltmadan standart sapmayı (SD) temsil eder. Ctrl 1 - Ctrl 5 arasındaki kontrolleri gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig7v8large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8.jpg"> Şekil 8. PLUM, taşınabilir bir plaka okuyucu. Bu taşınabilir plaka okuyucu, bir kutuda laboratuvar görevi görür ve kolorimetrik reaksiyonları inkübe etmek ve izlemek için sıcaklık kontrollü bir plaka okuyucu görevi görür. Bu taşınabilir cihaz, sahada kağıt tabanlı Zika sensörlerinin nicel ve yüksek verimli ölçümlerini sağlayabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig8v8large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63223/63223fig9v9.jpg"> Şekil 9: Zika virüsünün tespiti için üçlü olarak test edilen iki hasta örneğinin amplifikasyonunun RT-qPCR grafiği. Döngü eşiği (Ct) değeri ≤38 olduğunda numuneler pozitif olarak kabul edilir. Noktalı kırmızı çizgi, pozitif ve negatif numuneleri belirlemek için bir eşik görevi görür. Kırmızı iz pozitif bir örneği, mavi iz ise negatif bir örneği gösterir. ΔRn (delta Rn) değeri, test edilen tüm numuneler için RT-qPCR cihazı tarafından algılanan floresan sinyalinin normalleştirilmiş büyüklüğünü temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/63223fig9v8large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Protokol Dosyası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplementary_protocol_R2_RE_KJ.docx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Rakamlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63223/Supplemental_Figures.zip" target="_blank">Bu rakamları indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics at JoVE.com

Design to Implementation Study for Development and Patient Validation of Paper-Based Toehold Switch Diagnostics

Merkezi olmayan testler için topluluğa dağıtılabilecek merkezi olmayan, düşük maliyetli ve yüksek kapasiteli tanılamaya erişim, küresel sağlık krizleriyle mücadelede kritik öneme sahiptir. Bu makale, taşınabilir bir optik okuyucu ile tespit edilebilen viral RNA dizileri için kağıt tabanlı teşhislerin nasıl oluşturulacağını açıklamaktadır.

Kağıt Tabanlı Toehold Anahtarı Tanılamanın Geliştirilmesi ve Hasta Doğrulaması için Tasarımdan Uygulamaya Çalışma

Access to low-burden molecular diagnostics that can be deployed into the community for testing is increasingly important and has meaningful wider ...

Protokolümüz, gen devresi tabanlı teşhisin tasarımını, montajını ve doğrulanmasını açıklar. Bu kağıt tabanlı moleküler teşhisler düşük maliyetli ve hassastır, klinik olarak ilgili nükleik asit konsantrasyonlarını tespit edebilir ve hemen hemen her sırayı tespit etmek için tasarlanabilir. Bu, kullanıcılar tarafından ihtiyaçları için tasarlanabilen ve klinik sınıf teşhisleri daha merkezi olmayan diş kaynağı ayarlarına getirme potansiyeline sahip bir platform teknolojisidir.Hücresiz ayak parmağı tutma anahtarı sensörü, hemen hemen her nükleik asit bazlı hedef için tasarlanabilir. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, Ebola, norovirüs, SARS-CoV-2, C.difficile ve tifoya neden olan bakteriler için hücresiz teşhis göstermiştir. Prosedürü gösterenler, doktora sonrası araştırmacı Severino Jefferson Rivero da Silva ve laboratuvarımdan doktora öğrencisi Pouriya Bayat olacak.Ayak parmağı anahtarını tasarlamak için, Zika virüsü genomundan hedef dizileri tanımlayın ve metin protokolünde açıklandığı gibi amplikonlardan Zika virüsü hedef dizilerini seçin. Toehold switch tasarım yazılımı paketini indirin. MATLAB'ı açın ve tasarım yazılımı klasörüne gidin.Hedef dizileri, giriş alt klasöründe bulunan tasarım giriş dosyası csv dosyasına girin. Tasarım işlevi için kullanılacak parametreleri seçin. İlgilenilen hedefler için ayak parmağı anahtarı tasarımlarını oluşturmak üzere tasarım işlevini çalıştırın.Tamamlandığında, final_designs klasörüne gidin ve csv formatındaki elektronik tablolarda üst ayak parmağı anahtarı tasarım dizilerini ve ilgili hedef dizileri bulun. Algoritma tarafından üretilen ayak parmağı anahtarı DNA dizilerinin beş asal uçta T7 promotör dizilerini ve üç asal uçta korunmuş bir 21 nükleotid bağlayıcı dizisini içerdiğinden emin olun. Dizi homolojisini kontrol ederek üst ayak parmağı anahtarı tasarım dizilerini diğer yaygın virüslere karşı taramak için NCBI BLAST kullanın.%40'tan az hemolojiye sahip dizileri kabul edin. Nükleaz içermeyen suda 10 mikromolar konsantrasyonunda ayak parmağı anahtarı saç tokası DNA oligolarının ve ters amplifikasyon primerlerinin çözeltilerini hazırlayın. PCR tüplerindeki reaksiyonları buz üzerinde bu tabloya göre birleştirin.Reaksiyon tüplerini, bu tabloda listelenen döngü koşullarını izleyerek bir termosikletçiye yerleştirin. PCR ürünlerini bir agaroz jeli üzerinde analiz edin. PCR ürünlerini saflaştırın ve yeterince yüksek bir konsantrasyon sağlamak için DNA'yı minimum miktarda nükleaz içermeyen suda süzün.DNA'yı bir spektrofotometre kullanarak sayısallaştırın. Bir mililitre nükleaz içermeyen suda tozun 25 miligramını çözerek bir CPRG stok çözeltisi hazırlayın. Burada gösterilen standart protokole göre buz üzerinde bir ana karışım hazırlayın.Hücresiz ana karışımı PCR tüplerine dağıtın. Hücresiz kontroller ve tek başına anahtarlı kontroller için, 5.94 mikrolitrelik bir hacme nükleaz içermeyen su ekleyin. Ve reaksiyon için, 33 nanomolar'ın son konsantrasyonunu elde etmek için PCR saflaştırılmış ayak parmağı anahtar DNA'sını ekleyin.Ayak parmağı anahtarını ve hedef RNA kombinasyonunu test etmek için, in vitro transkribe edilmiş hedef RNA'yı bir mikromolar'ın son konsantrasyonuna ekleyin. Pipetleme ve santrifüj ile tüm reaksiyonları kısaca iyice karıştırın. Siyah berrak tabanlı 384 kuyucuklu bir plaka üzerinde, reaksiyon kuyularını çevreleyen kuyucuklara 30 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin.Daha sonra iki milimetrelik bir biyopsi zımba ve cımbız kullanarak, BSA bloke filtre kağıdı disklerini kesin ve reaksiyon kuyularına yerleştirin. Her reaksiyon tüpünden 1,8 mikrolitreyi, 384 delikli plakadaki filtre kağıdı disklerine üçlü olarak dağıtın. Plakayı şeffaf PCR filmle örtün ve bir plaka okuyucuya yerleştirin.Absorbansı 130 dakika boyunca her dakika 37 santigrat derecede 570 nanometrede ölçün. Nükleaz içermeyen suda tüm ileri ve geri astar setlerinden oluşan 25 mikromolar stok çözeltisi hazırlayın. Burada gösterilen ana karışımı kullanarak beş mikrolitrelik bir reaksiyon ayarlayın.Beyaz çökelti çözünene kadar pipetleme ile karıştırın ve ardından PCR tüplerine dağıtın. İleri ve geri primerleri uygun tüplere ekleyin, ardından bir mikrolitre nükleaz içermeyen su veya iki pikomolar hedef tetikleyici RNA ekleyin. Nazik pipetleme ile karıştırın ve tüpleri kısaca aşağı doğru döndürün.Burada gösterildiği gibi bir termosikler üzerinde inkübasyon protokolünü ayarlayın. 12 dakika sonra, tüpleri çıkarın ve her tüpe 1.25 mikrolitre enzim karışımı ekleyin, ardından karıştırma ve santrifüjleme yapın. Bir saatlik reaksiyon inkübasyonuna başlamak için 41 santigrat derece tutma adımını atladıktan sonra tüpleri termosiklere geri döndürün.Daha sonra astar performansını değerlendirmek için, kağıt bazlı hücresiz ayak parmağı anahtarı reaksiyonlarını bir araya getirin ve verileri analiz edin. Duyarlılık analizi için, aday primer çiftlerini tanımlayın ve nükleaz içermeyen suda hedef RNA'nın seri seyreltimlerini hazırlayın. NASBA ve hücresiz reaksiyonları, biyolojik üçlülerde seçilen astar setleriyle tekrarlayın.Bir mikrolitre ekstrakte edilmiş hasta RNA'sı kullanarak, NASBA amplifikasyonunu ve kağıt bazlı hücresiz reaksiyonları beşinci bölümde gösterildiği gibi gerçekleştirin. Reaksiyonları takiben, 384 kuyucuklu reaksiyon plakasını hazırlayın ve tahlili 37 santigrat derecede taşınabilir bir plaka okuyucuda çalıştırın. Daha sonra RT-qPCR bileşenlerini birleştirin ve reaktifleri bu tabloya göre 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne ekleyin.Reaksiyonu pipetleme ile karıştırın. 96 delikli veya 384 delikli bir PCR plakasının her bir kuyucuğuna 6,5 mikrolitre, ardından üçlü olarak her RNA şablonunun 3,5 mikrolitresini dağıtın. Plakanın üstüne bir PCR filmi yerleştirin.384 delikli plakayı iki dakika boyunca 600 kez G'de santrifüj yapın. Plakayı bir RT-qPCR makinesine yerleştirin ve burada gösterildiği gibi bisiklet koşullarını çalıştırın. Hesaplamalı tasarımı takiben, üç ayak parmağı anahtarı inşa edildi ve agaroz jel elektroforezi kullanılarak analiz edildi.3.000 baz çifti civarında bir bant başarılı bir reaksiyona işaret etti. Ayak parmağı anahtarları, ilgili in vitro transkribe edilmiş tetik RNA'larına karşı değerlendirildi. Her üç sensör de absorbansta bir artış gösterirken, sensör 27B en hızlı açılma oranına sahipken, 33B ve 47B anahtarları arka plan aktivitesini ve azalmış özgüllüğü gösteren daha düşük bir açma / kapama oranına sahipti.570 nanometredeki emmenin katlanma değişimi, 27B anahtarının açma / kapama sinyal oranıyla en iyi performansa sahip olduğunu gösterdi. Dahası, NASBA ile birleştiğinde, RNA'yı mikrolitre başına 124 molekül kadar düşük konsantrasyonlarda tespit edebilir ve bu da yüksek hassasiyeti gösterir. Brezilya'dan alınan Zika virüsü hasta örnekleri, taşınabilir bir plaka okuyucu kullanılarak sensörlerin klinik teşhis doğruluğunu değerlendirmek için test edildi.Sarıdan mora renk değişikliği pozitif bir örnek tanımladı. Her kağıt tabanlı reaksiyon için kolorimetrik tepki, PLUM taşınabilir plaka okuyucusundaki entegre yazılım tarafından zaman içinde çizildi. Eşiği aşan örnekler pozitif olarak kabul edildi.Sensörün klinik performansı RT-qPCR ile karşılaştırılarak belirlenmiştir. Örnekler, döngü eşik değeri 38'e eşit veya daha küçük olduğunda pozitif olarak kabul edildi. Hasta denemelerine geçmeden önce ayak parmağı anahtar ekranlarından ve NASBA primer duyarlılığından elde edilen sonuçların tekrarlanabilir ve optimize edilebilir olmasını sağlamak önemlidir.Sadeliği ve uyarlanabilirliği göz önüne alındığında, burada açıklanan teşhis platformu, özellikle düşük gelirli ülkeler için sağlık sistemine fayda sağlayabilecek yeni bakım noktası araçlarının geliştirilmesinin yolunu açmıştır.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Devirli Basınç Biyoreaktör Tasarım Ex vivo</emAort Kalp Vanalar> Eğitim

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Characterization of Complex Systems Using the Design of Experiments Approach: Transient Protein Expression in Tobacco as a Case Study

Bir Vaka Çalışması Olarak Tütün Geçici Protein Expression: Deneyler Yaklaşımı Tasarım Kullanma Karmaşık Sistemler Karakterizasyonu

Plants provide multiple benefits for the production of biopharmaceuticals including low costs, scalability, and safety. Transient expression offers the ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Ekstrasellüler Veziküller Yalıtım ve Karakterizasyonu için kağıt tabanlı cihazlar

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Construction of Defined Human Engineered Cardiac Tissues to Study Mechanisms of Cardiac Cell Therapy

Tanımlı İnsan Engineered Kalp Dokuların inşaatı Kardiyak Hücre Tedavisinin Mekanizmaları Eğitim için

Human cardiac tissue engineering can fundamentally impact therapeutic discovery through the development of new species-specific screening systems that ...

Design and Implementation of an Automated Illuminating, Culturing, and Sampling System for Microbial Optogenetic Applications

Mikrobiyal optogenetic Uygulamaları Tasarım ve Otomatik Aydınlatıcı, kültürleme ve Örnekleme Sistemi Uygulaması

Optogenetic systems utilize genetically-encoded proteins that change conformation in response to specific wavelengths of light to alter cellular ...

Magnetic Levitation Coupled with Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Hastalık Teşhis için Taşınabilir Görüntüleme ve Analiz ile birleştiğinde Manyetik Levitasyonunun

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

İmmüno için üç boyutlu Paper-based mikroakışkan Cihazlar İmalat

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

İmalat ve Organ-on-chip sistemin doğrudan Transendothelial elektrik direncini ölçmek için entegre elektrotlar ile doğrulama

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Anatomically Realistic Neonatal Heart Model for Use in Neonatal Patient Simulators

Anatomik olarak gerçekçi yenidoğan kalp modeli kullanılmak üzere yenidoğan hasta simülatörleri

Neonatal patient simulators (NPS) are artificial patient surrogates used in the context of medical simulation training. Neonatologists and nursing staff ...

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors to Detect Protease Activity In Vivo for Noninvasive Diagnostics

Nanosensors için noninvaziv tanı koyma proteaz aktivitesi Vivo tespit

Proteases are multi-functional enzymes that specialize in the hydrolysis of peptide-bonds and control broad biological processes including homeostasis and ...