Name: isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies
Uploaded: 2022-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies at JoVE.com

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة HL140024 إلى CGN و HL150277 إلى CMC. تم إنشاء الشكل 1 والشكل 2 مع BioRender.com.

تم تربية جميع أسماك الزرد (سلالة من النوع البري AB ، من الذكور والإناث) وصيانتها والتعامل معها للتجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوانات بجامعة واشنطن (IACUC).
1. عزل الأذين والبطين والشرايين المنتفخة عن أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات</st...

<ol>
	<li>Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish's+swim+to+fame+as+an+experimental+model+in+biology.">The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).</li><li>Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+for+high-throughput+screens:+The+present+and+future+using+zebrafish.">Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).</li><li>Ke&#223;ler, M., Rottbauer, W., Just, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+use+of+zebrafish+for+novel+cardiac+drug+discovery.">Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).</li><li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+dissection+in+larval,+juvenile+and+adult+zebrafish,+Danio+rerio.">Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).</li><li>Brette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isolated+ventricular+myocytes+from+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).</li><li>Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+primary+cardiomyocytes+from+adult+zebrafish+hearts.">Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts.</a> Nature protocol. 8, 800-809 (2013).</li><li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart?+An+electrophysiological+study.">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+consequences+of+KATP+overactivity+in+Cantu+syndrome.">Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome.</a> JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).</li><li>Singareddy, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-sensitive+potassium+channels+in+zebrafish+cardiac+and+vascular+smooth+muscle.">ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).</li><li>Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+intestinal+smooth+muscle+development+using+a+novel+sm22&#945;-b+promoter.">Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22&#945;-b promoter.</a> Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).</li><li>Yang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+amount+in+situ+hybridization+and+transgene+via+microinjection+in+zebrafish.">Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).</li><li>Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenanthrene+impacts+zebrafish+cardiomyocyte+excitability+by+inhibiting+IKr+and+shortening+action+potential+duration.">Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration.</a> The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).</li><li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li></ol>

كانت الطرق السابقة لعزل الخلايا العضلية البطينية لأسماك الزرد 5,6 ، التي تهدف إلى توليد الخلايا العضلية للزراعة أو الدراسات الكهروفسيولوجية ، توفر خلايا ذات عائد أقل وتنطوي على خطوات طويلة من أجهزة الطرد المركزي المتعددة التي تؤثر سلبا على جودة الخلية وقاب...

الزرد هي أسماك تيليوست صغيرة تستخدم منذ فترة طويلة ككائن فقاري نموذجي1 وبرزت مؤخرا كنظام فقاري قابل للحياة لفحص الجينات والأدوية عالية الإنتاجية 2,3. ومع ذلك ، فإن التحليل الفسيولوجي لأنسجة الزرد ليس متطورا بشكل جيد. في نظام القلب والأوعية الدموية ، تم وصف طرق لتشريح قلوب الزرد4 وعزل الخلايا العضلية القلبية البطينية5،6،7. هناك عدد قليل من الأوصاف التفصيلية للعزل الفعال للخلايا العضلية الأذينية ولا توجد تقارير عن استعدادات العضلات الملساء الوعائية (VSM) لدراسات المشبك الرقعي.
يصف العمل الحالي منهجية عزل الخلايا العضلية القلبية والوعائية لأسماك الزرد ، وهي قابلة للتطبيق للدراسات الكهروفسيولوجية والوظيفية. يتضمن هذا النهج تعديلات على البروتوكولات المبلغ عنها سابقا لعزل الخلايا العضلية البطينية لأسماك الزرد 5,6 ويكيف الطرق من عزل خلايا VSM للثدييات8 ، مما يسمح بعزل خلايا العضلات الملساء الوعائية لأسماك الزرد عن الشرايين المنتفخة (BA). تؤدي البروتوكولات إلى غلة فعالة للخلايا الأذينية والبطينية و VSM المعزولة من أسماك الزرد التي يمكن استخدامها بشكل موثوق في دراسات المشبك التصحيحي لمدة تصل إلى 8 ساعاتو 9.
على الرغم من يرقاتها الشفافة تقريبا التي تتطور بالكامل خارج الكائن الحي الأبوي ، إلا أن استكشاف إمكاناتها الجينية الموعودة في دراسة تطور القلب والأوعية الدموية كان محدودا بسبب التحديات في استخراج الأنسجة وتحليلها في سن مبكرة. تتناول المقالة الحالية هذا القيد من خلال إظهار تجارب المشبك التصحيحي على قلوب الزرد المعزولة في وقت مبكر من 3 أيام بعد الإخصاب (dpf) ، باستخدام طريقة استخراج منشورة ومكيفة10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 Guage Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119479</td>
			<td>For embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Used for action potential recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Mini Centrifuge</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>MLX-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Strainer Sieve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06336-71</td>
			<td>100 &#956;m sieve for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type H</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #5</td>
			<td>Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981</td>
			<td>For dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Hematocrit Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>41A2502</td>
			<td>Soda lime glass for patch pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td>100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>For adult and juvenile zebrafish decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #SF</td>
			<td>For isolating larval CV tissues (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13687711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate (MS222)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For anaesthetizing zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies

منذ فترة طويلة تستخدم أسماك الزرد ككائن فقاري نموذجي في أبحاث القلب والأوعية الدموية. كانت الصعوبات التقنية لعزل الخلايا الفردية عن أنسجة القلب والأوعية الدموية لأسماك الزرد محدودة في دراسة خصائصها الكهروفسيولوجية. تم وصف الطرق السابقة لتشريح قلوب أسماك الزرد وعزل الخلايا العضلية القلبية البطينية. ومع ذلك ، لم يتم تفصيل عزل الخلايا العضلية الأذينية والوعائية لأسماك الزرد للتوصيف الكهروفسيولوجي. يصف هذا العمل البروتوكولات الأنزيمية الجديدة والمعدلة التي توفر بشكل روتيني خلايا عضلية بطينية وأذينية معزولة من أسماك الزرد الصغرى والبالغة ، بالإضافة إلى خلايا العضلات الملساء الوعائية (VSM) من الشرايين المنتفخة ، وهي مناسبة لتجارب المشبك الرقعة. لم يكن هناك أي دليل أدبي على الدراسات الكهروفسيولوجية على أنسجة القلب والأوعية الدموية لأسماك الزرد المعزولة في مراحل التطور الجنينية واليرقات. يتم عرض تقنيات التفكك الجزئي التي تسمح بتجارب المشبك التصحيحي على الخلايا الفردية من اليرقات والقلوب الجنينية.

توفر البروتوكولات المذكورة أعلاه بشكل موثوق وروتيني ما يكفي من الخلايا العضلية القلبية والوعائية ذات الجودة المتسقة القابلة لدراسات المشبك الرقعة كما ورد مؤخرا في دراسات مكثفة لقنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP (KATP) في نمط الزرد البري والمتحور cardiovasculature9. تظهر الآثار التمث...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

يصف هذا البروتوكول العزلة الحادة لخلايا العضلات الملساء القلبية والوعائية القابلة للحياة من أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات والجنينية (Danio rerio) ، وهي مناسبة للدراسات الكهربية.

عزل خلايا العضلات الملساء القلبية والوعائية عن أسماك الزرد البالغة واليافعة واليرقات والجنينية للدراسات الكهروفسيولوجية

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

تتطلب دراسة خصائص القناة الأيونية الأصلية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية المشبك الرقعة الوصول إلى الخلايا المعزولة بشكل حاد. يصف هذا البروتوكول طرق الوصول إلى الخلايا العضلية القلبية الوعائية الفردية من أسماك الزرد في مختلف الأعمار. هذا البروتوكول قوي وبسيط وقابل للتكرار بسهولة ، ويعزل الخلايا العضلية القلبية الوعائية عن أسماك الزرد في حالتها الأصلية مع غلة عالية نسبيا وقابلية للحياة.للبدء ، انقل السمك إلى طبق بتري كبير مملوء جزئيا بمخزن مؤقت للتروية وضعه تحت مجهر تشريح. امسك السمكة في اليد غير المهيمنة مع الجانب البطني الذي يواجه نطاق التشريح. باستخدام الملقط الناعم في اليد المهيمنة ، قم بتمزيق العضلات الصدرية وزعانف الأسماك بلطف للكشف عن أنسجة القلب والأوعية الدموية بما في ذلك الأذين والبطين والشرايين البصلعة.اسحب الشرايين البصيلة برفق عند الطرف المتقاطع للشريان البصلي والشريان الأورطي البطني. افصل بعناية الشريان البصلي عن الشريان الأورطي عن طريق قرص الملقط ، وتحديد موقع طرف الأذين في الفروع الوريدية المتعددة التي تتقارب. ثم ، انتزع طرف الأذين من الجيوب الأنفية الوريدية لعزل أنسجة القلب والأوعية الدموية عن بقية الجسم.لتشريح الخلايا العضلية القلبية ، انتزع الأذين والبطين من أنسجة القلب والأوعية الدموية. قم بعمل تمزق لطيف في البطين باستخدام ملقط ناعم لتصريف الدم الزائد ، والذي يمكن ضمانه عندما يتحول نسيج القلب من اللون الأحمر الفاتح إلى لون السلمون الشاحب. قم بتجميع الأذين والبطين المعزولين في أنبوب طرد مركزي منفصل سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على مخزن مؤقت للتروية.استبدل المخزن المؤقت للتروية في الأنابيب ب 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم. ضع الأنابيب على شاكر حراري عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة. اسمح بهضم الأنسجة حتى تصبح شفافة.قم بإنهاء عملية الهضم عن طريق تدوير الأنسجة بلطف في جهاز طرد مركزي صغير على مقاعد البدلاء بسرعة 2،000 مرة G لمدة ثلاث إلى خمس ثوان واستبدل مخزن الهضم الفائق ب 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتوقف. استبدل المخزن المؤقت للتوقف بلطف ب 500 إلى 750 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتروية وقم بتقطيع الأنسجة 30 مرة باستخدام ماصة باستور مصقولة باللهب لتفريق الخلايا. ثم، قم بتعديل البطينين بلطف.للحصول على عينات موحدة ، قم بماصة الخلايا بلطف لأعلى ولأسفل عدة مرات للإنعاش ، قبل إضافة قطرة منها للدراسات المقابلة. انتزع البصيلات الشريانية البالغة من أنسجة القلب والأوعية الدموية وتجمع خمسة بصيلات شريانية في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر يحتوي على عازل S1. استبدل S1 ب 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت S2 واسمح بهضم غراء البصيلات الشريانية على شاكر حراري عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة.اسمح للشريان البصلي المهضوم جزئيا بالاستقرار لمدة دقيقة واحدة واستبدل السوبرناتانت S2 ب 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت S3 الذي يحتوي على الكولاجيناز. هضم الأنسجة على شاكر حراري عند 37 درجة مئوية و 800 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق. قم بإنهاء عملية الهضم عن طريق تدوير الأنسجة بلطف في جهاز طرد مركزي صغير على مقاعد البدلاء بسرعة 2000 مرة G لمدة ثلاث إلى خمس ثوان ، واستبدل S3 supernatant ب 500 ميكرولتر من S1. قم بتثلث الأنسجة الحبيبية بلطف لتفريق خلايا العضلات الملساء الوعائية.لوحة خلايا العضلات الملساء الوعائية المنتشرة على زلات الغطاء الزجاجي ذات الحجم المناسب. احتفظ بانزلاقات الغطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة حتى تعلق الخلايا ، واستخدمها خلال الساعات الست التالية. تخدير الأجنة.ثم ركز الأجنة عن طريق نقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة خمسة ملليلترات ، ثم أزل الوسائط الزائدة. اغسل الأجنة بثلاثة ملليلترات من مخزن التروية البارد مرتين ، ثم أعد تعليقها في ملليلتر من مخزن التروية المؤقت. باستخدام جهاز عزل القلب الجنيني ، اسحب ملليلتر واحد من الأجنة إلى الإبرة وطردها على الفور مرة أخرى إلى الأنبوب.مرر الأجنة المجزأة من خلال غربال مصفاة خلية 100 ميكرومتر موضوعة في قمع. اجمع القلوب المصفاة في أنبوب طرد مركزي آخر سعة خمسة ملليلترات. امزج الترشيح جيدا وافصل أليكوت سعة ملليلتر واحد في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 ملليلتر.قم بطرد جميع الأنابيب الموجودة على جهاز طرد مركزي صغير على مقاعد البدلاء لمدة خمس ثوان وتخلص من جهاز الطرد المركزي الفائق. قم بإجراء إعادة تعليق تسلسلي للكريات في الأنابيب باستخدام ملليلتر واحد من المخزن المؤقت للتروية. ماصة بلطف القلوب صعودا وهبوطا مرتين قبل إضافة قطرة للدراسات المقابلة بالنسبة للخلايا المعزولة من البصيلات الشريانية ، تم تأكيد خلايا العضلات الملساء الوعائية بواسطة tagln:EGFP التعبير.تظهر هنا آثار تمثيلية لتسجيلات نشاط قناة البوتاسيوم الحساسة ل ATP من الخلايا العضلية القلبية المعزولة. تم الحصول على تسجيلات ناجحة أحادية القناة في بقع تم استئصالها من القلوب الجنينية. أظهرت الخلايا العضلية البطينية إمكانات غشاء مفرطة الاستقطاب مستقرة ، وتم تحفيز إمكانات العمل عن طريق الحقن الحالي من خلال ماصة التصحيح.أظهرت الخلايا العضلية الأذينية إطلاق نار محتمل عفوي. يتم تلخيص خصائص العمل المحتملة هنا. أثناء استبدال المخازن المؤقتة أثناء تفكك الخلايا العضلية القلبية ، يجب توخي الحذر من عدم إزعاج الأنسجة الهضمية.يجب أن يتم تفتيت الأنسجة فقط عن طريق تريتوريون الماصة. أثناء هضم الكولاجين لأنسجة البصيل، افحص الأنسجة العائمة والموسعة والشفافة كل دقيقة. بمجرد ظهور تجزئة الأنسجة ، توقف عن الهضم.بمجرد عزل الخلايا ، يمكن الاحتفاظ بها على قيد الحياة لساعات واستخدامها للتحليل الكهروفسيولوجي باستخدام تقنيات مشبك التصحيح. وقد سمح لنا هذا ، على سبيل المثال ، بإظهار أن قنوات البوتاسيوم الحساسة ل ATP في أنسجة أسماك الزرد هذه متطابقة بشكل أساسي مع تلك الموجودة في الثدييات.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

عزل الحمض النووي الريبي من الجنينية التجميعي واسماك الزرد [كدنا] لتحليل الجينات

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

عزل الشريان السري الإنسان خلايا العضلات الملساء (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

الكبار والعضلات والهيكل العظمي الجنينية Microexplant الثقافة وعزل خلايا جذعية عضلية هيكلية

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

تشريح القلب في اليرقات ، اسماك الزرد الأحداث والكبار ، دانيو rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

الليزر بإلحاق الضرر من العضلات الهيكلية اسماك الزرد الجنينية

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

العزلة وثقافة فردية وMyofibers زنزاناتهم القمر الصناعي من العضلات الهيكلية الكبار

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

تحليل الجنينية واليرقات الزرد الهيكل العظمي Myofibers من الاستعدادات فصلها

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

عزل الشريان الرئوي خلايا العضلات الملساء من الفئران حديثي الولادة

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

عزل الفئران التاجي الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

عزل وتوصيف والتفريق في القلب من الخلايا الجذعية من قلب الماوس الكبار

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...