Name: isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies
Uploaded: 2022-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af NIH-tilskud HL140024 til CGN og HL150277 til CMC. Figur 1 og figur 2 blev oprettet med BioRender.com.

Alle zebrafisk (vildtypestamme AB, både mandlige og kvindelige) blev opdrættet, vedligeholdt og håndteret til forsøgene efter retningslinjerne fra Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Isolering af atrium, ventrikel og bulbøs arteriosus fra voksen, ung og larve zebrafisk
<ol><li>Afliv fisk ved hjælp af kuldechok, dvs. ved at nedsænke i 4 ° C vand i ~ 10 s.</li>
	<li>Ved hjælp af buede tang overføres fisk til en stor petriskå...

<ol>
	<li>Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish's+swim+to+fame+as+an+experimental+model+in+biology.">The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).</li><li>Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+for+high-throughput+screens:+The+present+and+future+using+zebrafish.">Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).</li><li>Ke&#223;ler, M., Rottbauer, W., Just, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+use+of+zebrafish+for+novel+cardiac+drug+discovery.">Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).</li><li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+dissection+in+larval,+juvenile+and+adult+zebrafish,+Danio+rerio.">Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).</li><li>Brette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isolated+ventricular+myocytes+from+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).</li><li>Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+primary+cardiomyocytes+from+adult+zebrafish+hearts.">Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts.</a> Nature protocol. 8, 800-809 (2013).</li><li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart?+An+electrophysiological+study.">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+consequences+of+KATP+overactivity+in+Cantu+syndrome.">Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome.</a> JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).</li><li>Singareddy, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-sensitive+potassium+channels+in+zebrafish+cardiac+and+vascular+smooth+muscle.">ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).</li><li>Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+intestinal+smooth+muscle+development+using+a+novel+sm22&#945;-b+promoter.">Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22&#945;-b promoter.</a> Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).</li><li>Yang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+amount+in+situ+hybridization+and+transgene+via+microinjection+in+zebrafish.">Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).</li><li>Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenanthrene+impacts+zebrafish+cardiomyocyte+excitability+by+inhibiting+IKr+and+shortening+action+potential+duration.">Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration.</a> The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).</li><li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li></ol>

Tidligere metoder til isolering af zebrafiskventrikulære myocytter5,6, der havde til formål at generere myocytter til dyrkning eller elektrofysiologiske undersøgelser, gav celler med lavere udbytte og involverede lange trin med flere centrifugeringer, der påvirkede cellekvaliteten og levedygtigheden negativt. De protokoller, der er beskrevet her, er pålidelige, dækker hvert af de betydelige kardiovaskulære væv (ventrikel, atria og VSM), og vigtigere er re...

Zebrafisk er små teleostfisk, der længe har været brugt som en model hvirveldyrorganisme1 og for nylig er blevet fremtrædende som et levedygtigt hvirveldyrsystem til screening af gener og lægemidler med høj kapacitet 2,3. Fysiologisk analyse af zebrafiskvæv er imidlertid ikke veludviklet. I det kardiovaskulære system er der beskrevet metoder til dissektion af zebrafiskhjerter4 og isolering af ventrikulære hjertemyocytter 5,6,7. Der er få detaljerede beskrivelser af den effektive isolering af atriemyocytter og ingen rapporter om vaskulære glatte muskelpræparater (VSM) til patch-clamp-undersøgelser.
Det nuværende arbejde beskriver metode til isolering af zebrafisk hjerte- og vaskulære myocytter, der er levedygtige til elektrofysiologiske og funktionelle undersøgelser. Denne fremgangsmåde omfatter ændringer af tidligere rapporterede protokoller for zebrafiskventrikulær myocytisolering5,6 og tilpasser metoder fra pattedyrs VSM-celleisolationer8, hvilket muliggør isolering af zebrafiskkarformede glatte muskelceller fra bulbous arteriosus (BA). Protokollerne resulterer i effektive udbytter af isolerede atrie-, ventrikulære og VSM-celler fra zebrafisk, der pålideligt kan bruges i patch-clamp-undersøgelser i op til 8 timer9.
På trods af deres næsten gennemsigtige larver, der udvikler sig helt uden for forældreorganismen, har udforskning af deres lovede ontogenetiske potentiale i studiet af kardiovaskulær udvikling været begrænset af udfordringer med at udvinde og analysere væv i en ung alder. Den nuværende artikel adresserer denne begrænsning ved at demonstrere patch-clamp eksperimenter på zebrafisk hjerter isoleret så tidligt som 3 dage efter befrugtning (dpf) ved hjælp af en tilpasset, offentliggjort ekstraktionsmetode10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 Guage Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119479</td>
			<td>For embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Used for action potential recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Mini Centrifuge</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>MLX-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Strainer Sieve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06336-71</td>
			<td>100 &#956;m sieve for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type H</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #5</td>
			<td>Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981</td>
			<td>For dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Hematocrit Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>41A2502</td>
			<td>Soda lime glass for patch pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td>100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>For adult and juvenile zebrafish decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #SF</td>
			<td>For isolating larval CV tissues (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13687711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate (MS222)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For anaesthetizing zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies

Zebrafisk har længe været brugt som en model hvirveldyr organisme i hjerte-kar-forskning. De tekniske vanskeligheder ved at isolere individuelle celler fra zebrafiskens kardiovaskulære væv har været begrænsende i studiet af deres elektrofysiologiske egenskaber. Tidligere metoder er beskrevet til dissektion af zebrafiskhjerter og isolering af ventrikulære hjertemyocytter. Imidlertid var isoleringen af zebrafisk atriale og vaskulære myocytter til elektrofysiologisk karakterisering ikke detaljeret. Dette arbejde beskriver nye og modificerede enzymatiske protokoller, der rutinemæssigt giver isolerede unge og voksne zebrafisk ventrikulære og atriale kardiomyocytter samt vaskulære glatte muskelceller (VSM) fra bulbous arteriosus, egnet til patch-clamp eksperimenter. Der har ikke været noget litterært bevis for elektrofysiologiske undersøgelser af zebrafisk kardiovaskulært væv isoleret på embryonale og larvestadier af udvikling. Delvise dissociationsteknikker, der tillader patch-clamp eksperimenter på individuelle celler fra larve- og embryonale hjerter, demonstreres.

Ovennævnte protokoller giver pålideligt og rutinemæssigt tilstrækkelige hjerte- og vaskulære myocytter af ensartet kvalitet, der kan bruges til patch-clamp-undersøgelser som for nylig rapporteret i omfattende undersøgelser af ATP-følsomme kaliumkanaler (KATP) i vildtype og mutant zebrafisk kardiovaskulatur9. Repræsentative spor af optagelser af sådan KATP-kanalaktivitet fra isolerede kardiomyocytter er vist i figur 3A-C...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Den nuværende protokol beskriver den akutte isolering af levedygtige hjerte- og vaskulære glatte muskelceller fra voksne, unge, larver og embryonale zebrafisk (Danio rerio), der er egnede til elektrofysiologiske undersøgelser.

Isolering af hjerte- og vaskulære glatte muskelceller fra voksne, unge, larve- og embryonale zebrafisk til elektrofysiologiske undersøgelser

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

At studere native ionkanalegenskaber ved hjælp af patch clamp elektrofysiologi kræver adgang til akut isolerede celler. Denne protokol beskriver metoder til at få adgang til individuelle kardiovaskulære myocytter fra zebrafisk i forskellige aldre. Denne protokol er robust, enkel, let reproducerbar og isolerer kardiovaskulære myocytter fra zebrafisk i deres oprindelige tilstand med relativt højt udbytte og levedygtighed.Til at begynde med overføres fisken til en stor petriskål delvist fyldt med perfusionsbuffer og læg den under et dissekerende mikroskop. Hold fisken i den ikke-dominerende hånd med den ventrale side vendt mod dissektionsomfanget. Med den fine tang i den dominerende hånd skal du forsigtigt rive fiskens brystmuskler og finner op for at afsløre det kardiovaskulære væv, herunder atrium, ventrikel og bulbus arteriosus.Træk forsigtigt bulbus arteriosus ved den skærende spids af bulbus arteriosus og ventral aorta. Adskil forsigtigt bulbus arteriosus fra aorta ved at klemme tangen og lokalisere atriumets spids i de mange venøse grene, der konvergerer. Pluk derefter spidsen af atriumet af sinus venosus for at isolere det kardiovaskulære væv fra resten af kroppen.For at dissekere kardiomyocytter skal du plukke atrium og ventrikel ud af det kardiovaskulære væv. Lav en blid tåre i ventriklen ved hjælp af fine tang for at dræne overskydende blod, hvilket kan sikres, når hjertevævet bliver fra lyse rødt til en lys laksefarve. Saml det isolerede atrium og ventrikel i et separat 1,5 milliliter centrifugerør indeholdende perfusionsbuffer.Udskift perfusionsbufferen i rørene med 750 mikroliter fordøjelsesbuffer. Placer rørene på en termoshaker ved 37 grader Celsius og 800 omdrejninger pr. Minut. Tillad fordøjelse af vævene, indtil de bliver gennemskinnelige.Afslut fordøjelsen ved forsigtigt at dreje vævene ned i en minicentrifuge på bænken ved 2.000 gange G i tre til fem sekunder, og udskift den supernatante fordøjelsesbuffer med 750 mikroliter stopbuffer. Udskift forsigtigt stopbufferen med 500 til 750 mikroliter perfusionsbuffer, og triturer vævene 30 gange ved hjælp af en flammepoleret Pasteur-pipette for at sprede cellerne. Derefter tritureres ventriklerne forsigtigt.For ensartet prøveudtagning pipetteres cellerne forsigtigt op og ned et par gange for at resupusere, før du tilføjer en dråbe af dem til tilsvarende undersøgelser. Pluk den voksne bulbus arteriosus fra det kardiovaskulære væv og pool fem bulbus arteriosus i et 1,5 milliliter centrifugerør indeholdende S1-buffer. Udskift S1 med 400 mikroliter S2-buffer og lad papainfordøjelsen af bulbus arteriosus på en termoshaker ved 37 grader Celsius og 800 omdrejninger i minuttet i 20 minutter.Lad den delvist fordøjede bulbus arteriosus slå sig ned i et minut og udskift S2-supernatanten med 500 mikroliter S3-buffer indeholdende collagenase. Fordøje vævene på en termoshaker ved 37 grader Celsius og 800 omdrejninger i minuttet i tre til fem minutter. Afslut fordøjelsen ved forsigtigt at dreje vævene ned i en minicentrifuge på 2.000 gange G i tre til fem sekunder, og udskift S3-supernatanten med 500 mikroliter S1. Triturere forsigtigt det pelleterede væv for at sprede vaskulære glatte muskelceller.Plade dispergerede vaskulære glatte muskelceller på glasdæksler af passende størrelse. Opbevar dækslerne ved stuetemperatur i 30 minutter, så cellerne kan fastgøres, og brug dem inden for de næste seks timer. Anæstetik embryonerne.Koncentrer derefter embryonerne ved at overføre dem til et fem milliliter centrifugerør, og fjern derefter overskydende medier. Embryonerne vaskes med tre milliliter kold perfusionsbuffer to gange, og suspenderer dem derefter i to milliliter perfusionsbuffer. Brug det embryonale hjerteisoleringsapparat til at trække en milliliter af embryonerne ind i nålen og straks udvise dem tilbage i røret.Før de fragmenterede embryoner gennem en 100 mikrometer celle silsigte placeret i en tragt. Saml de filtrerede hjerter i et andet fem-milliliter centrifugerør. Bland filtratet godt og adskil en milliliter aliquoter i 1,5 milliliter centrifugerør.Centrifuge alle rørene på en minicentrifuge på en bænk i fem sekunder, og kassér supernatanten. Udfør seriel resuspension af pellets i rørene ved hjælp af en milliliter perfusionsbuffer. Pipetter forsigtigt hjerterne op og ned to gange, før der tilføjes en dråbe til tilsvarende undersøgelser For celler isoleret fra bulbus arteriosus blev de vaskulære glatte muskelceller bekræftet af tagln: EGFP-ekspression.Repræsentative spor af optagelser af ATP-følsom kaliumkanalaktivitet fra isolerede kardiomyocytter er vist her. Succesfulde enkeltkanalsoptagelser blev opnået i patches udskåret fra de embryonale hjerter. Ventrikulære myocytter udviste stabile hyperpolariserede membranpotentialer, og handlingspotentialer blev stimuleret via strøminjektion gennem plasterpipetten.Atriale myocytter udviste spontan handling potentiel fyring. Handlingspotentiale egenskaber er opsummeret her. Mens du udskifter bufferne under kardiomyocytdissociation, skal man sørge for, at fordøjelsesvævene ikke forstyrres.Vævsfragmentering bør kun opnås ved pipettetriturering. Under den kollagenøse fordøjelse af bulbusvævene undersøges for flydende, udvidet og gennemskinneligt væv hvert minut. Når vævsfragmenteringen er tydelig, ophører fordøjelsen.Når cellerne er isoleret, kan de holdes i live i timevis og bruges til elektrofysiologisk analyse ved hjælp af patch clamp teknikker. Dette har f.eks. gjort det muligt for os at vise, at ATP-følsomme kaliumkanaler i disse zebrafiskvæv i det væsentlige er identiske med dem hos pattedyr.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-Påført skade af zebrafisk Embryonale skeletmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering og dyrkning af individuelle myofibre og deres satellit celler fra voksne skeletmuskler

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse af embryonale og larvestadiet Zebrafisk Skeletal myofibre fra Dissocierede Forberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolering af pulmonal glatte muskelceller fra Neonatal Mus

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering af murint koronar vaskulær glat muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolation, karakterisering og differentiering af Cardiac stamceller fra voksne mus hjerte

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...