Name: isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies
Uploaded: 2022-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies HL140024 aan CGN en HL150277 aan CMC. Figuur 1 en figuur 2 zijn gemaakt met BioRender.com.

Alle zebravissen (wild type stam AB, zowel mannelijk als vrouwelijk) werden grootgebracht, onderhouden en behandeld voor de experimenten volgens de richtlijnen van de Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Isolatie van atrium, ventrikel en bolvormige arteriosus van volwassen, juveniele en larvale zebravissen
<ol><li>Euthanaseer vissen met behulp van koude shock, d.w.z. door onder te dompelen in water van 4 °C, gedurende ~ 10 s.</li>
	<...

<ol>
	<li>Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish's+swim+to+fame+as+an+experimental+model+in+biology.">The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).</li><li>Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+for+high-throughput+screens:+The+present+and+future+using+zebrafish.">Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).</li><li>Ke&#223;ler, M., Rottbauer, W., Just, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+use+of+zebrafish+for+novel+cardiac+drug+discovery.">Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).</li><li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+dissection+in+larval,+juvenile+and+adult+zebrafish,+Danio+rerio.">Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).</li><li>Brette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isolated+ventricular+myocytes+from+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).</li><li>Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+primary+cardiomyocytes+from+adult+zebrafish+hearts.">Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts.</a> Nature protocol. 8, 800-809 (2013).</li><li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart?+An+electrophysiological+study.">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+consequences+of+KATP+overactivity+in+Cantu+syndrome.">Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome.</a> JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).</li><li>Singareddy, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-sensitive+potassium+channels+in+zebrafish+cardiac+and+vascular+smooth+muscle.">ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).</li><li>Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+intestinal+smooth+muscle+development+using+a+novel+sm22&#945;-b+promoter.">Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22&#945;-b promoter.</a> Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).</li><li>Yang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+amount+in+situ+hybridization+and+transgene+via+microinjection+in+zebrafish.">Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).</li><li>Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenanthrene+impacts+zebrafish+cardiomyocyte+excitability+by+inhibiting+IKr+and+shortening+action+potential+duration.">Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration.</a> The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).</li><li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li></ol>

Eerdere methoden voor het isoleren van zebravisventrikelmyocyten 5,6, gericht op het genereren van myocyten voor kweek- of elektrofysiologische studies, leverden cellen met een lagere opbrengst en omvatten lange stappen van meerdere centrifugaties die de celkwaliteit en levensvatbaarheid nadelig beïnvloedden. De hier beschreven protocollen zijn betrouwbaar, bestrijken elk van de belangrijke cardiovasculaire weefsels (ventrikel, boezems en VSM) en zijn belangrijk...

Zebravissen zijn kleine teleostvissen die al lang worden gebruikt als een model gewerveld organisme1 en onlangs op de voorgrond zijn gekomen als een levensvatbaar gewerveld systeem voor high throughput screening van genen en geneesmiddelen 2,3. Fysiologische analyse van zebravisweefsels is echter niet goed ontwikkeld. In het cardiovasculaire systeem zijn methoden beschreven voor dissectie van zebravisharten4 en isolatie van ventriculaire cardiale myocyten 5,6,7. Er zijn weinig gedetailleerde beschrijvingen van de effectieve isolatie van atriale myocyten en geen meldingen van vasculaire gladde spieren (VSM) preparaten voor patch-clamp studies.
Het huidige werk beschrijft de methodologie voor de isolatie van zebravis cardiale en vasculaire myocyten, levensvatbaar voor elektrofysiologische en functionele studies. Deze aanpak omvat wijzigingen van eerder gerapporteerde protocollen voor zebravisventrikelmyocytenisolatie 5,6 en past methoden aan van VSM-celisolaties van zoogdieren8, waardoor de isolatie van zebravis vasculaire gladde spiercellen uit de bolvormige arteriosus (BA) mogelijk wordt. De protocollen resulteren in efficiënte opbrengsten van geïsoleerde atriale, ventriculaire en VSM-cellen van zebravissen die betrouwbaar kunnen worden gebruikt in patchklemstudies tot 8 uur9.
Ondanks hun bijna transparante larven die zich volledig buiten het ouderlijk organisme ontwikkelen, is het verkennen van hun beloofde ontogenetische potentieel bij het bestuderen van cardiovasculaire ontwikkeling beperkt door uitdagingen bij het extraheren en analyseren van weefsels op jonge leeftijd. Het huidige artikel behandelt deze beperking door patch-clamp experimenten te demonstreren op zebravisharten die al 3 dagen na de bevruchting (dpf) zijn geïsoleerd, met behulp van een aangepaste, gepubliceerde extractiemethode10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 Guage Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119479</td>
			<td>For embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Used for action potential recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Mini Centrifuge</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>MLX-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Strainer Sieve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06336-71</td>
			<td>100 &#956;m sieve for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type H</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #5</td>
			<td>Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981</td>
			<td>For dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Hematocrit Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>41A2502</td>
			<td>Soda lime glass for patch pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td>100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>For adult and juvenile zebrafish decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #SF</td>
			<td>For isolating larval CV tissues (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13687711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate (MS222)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For anaesthetizing zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies

Zebravissen worden al lang gebruikt als een model gewerveld organisme in cardiovasculair onderzoek. De technische problemen bij het isoleren van individuele cellen uit de cardiovasculaire weefsels van zebravissen zijn beperkend geweest bij het bestuderen van hun elektrofysiologische eigenschappen. Eerdere methoden zijn beschreven voor dissectie van zebravisharten en isolatie van ventriculaire cardiale myocyten. De isolatie van zebravis atriale en vasculaire myocyten voor elektrofysiologische karakterisering was echter niet gedetailleerd. Dit werk beschrijft nieuwe en gemodificeerde enzymatische protocollen die routinematig geïsoleerde juveniele en volwassen zebravisventrikel- en atriale cardiomyocyten bieden, evenals vasculaire gladde spiercellen (VSM) van de bolvormige arteriosus, geschikt voor patch-clamp experimenten. Er is geen literair bewijs van elektrofysiologische studies op cardiovasculaire weefsels van zebravissen geïsoleerd in embryonale en larvale ontwikkelingsstadia. Gedeeltelijke dissociatietechnieken die patch-clamp experimenten op individuele cellen van larvale en embryonale harten mogelijk maken, worden gedemonstreerd.

De bovenstaande protocollen bieden betrouwbaar en routinematig voldoende cardiale en vasculaire myocyten van consistente kwaliteit die vatbaar zijn voor patch-clamp-studies zoals onlangs gerapporteerd in uitgebreide studies van ATP-gevoelige kalium (KATP) kanalen in wild-type en mutante zebravis cardiovasculatuur9. Representatieve sporen van opnames van dergelijke KATP-kanaalactiviteit van geïsoleerde cardiomyocyten zijn weergegeven in figuur 3A-C</stron...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Het huidige protocol beschrijft de acute isolatie van levensvatbare cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen (Danio rerio), geschikt voor elektrofysiologische studies.

Isolatie van cardiale en vasculaire gladde spiercellen van volwassen, juveniele, larvale en embryonale zebravissen voor elektrofysiologische studies

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Het bestuderen van inheemse ionkanaaleigenschappen met behulp van patchklem elektrofysiologie vereist toegang tot acuut geïsoleerde cellen. Dit protocol beschrijft methoden om toegang te krijgen tot individuele cardiovasculaire myocyten van zebravissen op verschillende leeftijden. Dit protocol is robuust, eenvoudig, gemakkelijk reproduceerbaar en isoleert cardiovasculaire myocyten van zebravissen in hun geboortestaat met een relatief hoge opbrengst en levensvatbaarheid.Breng de vis om te beginnen over in een grote petrischaal die gedeeltelijk gevuld is met perfusiebuffer en plaats deze onder een ontleedmicroscoop. Houd de vis in de niet-dominante hand met de ventrale kant naar de dissectiekijker gericht. Met de fijne tang in de dominante hand, scheur voorzichtig de borstspieren en vinnen van de vis open om de cardiovasculaire weefsels te onthullen, waaronder atrium, ventrikel en bulbus arteriosus.Trek voorzichtig aan de bulbus arteriosus aan de kruisende punt van de bulbus arteriosus en de ventrale aorta. Scheid de bulbus arteriosus voorzichtig van de aorta door in de tang te knijpen en de punt van het atrium te lokaliseren in de meerdere veneuze takken die samenkomen. Pluk vervolgens de punt van het atrium van de sinus venosus om de cardiovasculaire weefsels van de rest van het lichaam te isoleren.Om cardiomyocyten te ontleden, pluk u het atrium en de ventrikel uit het cardiovasculaire weefsel. Maak een zachte scheur in de ventrikel met behulp van een fijne tang om overtollig bloed af te voeren, wat kan worden verzekerd wanneer het hartweefsel verandert van felrood naar een bleke zalmkleur. Bundel het geïsoleerde atrium en de ventrikel in een aparte centrifugebuis van 1,5 milliliter met perfusiebuffer.Vervang de perfusiebuffer in de buizen door 750 microliter digestiebuffer. Plaats de buizen op een thermoshaker bij 37 graden Celsius en 800 omwentelingen per minuut. Laat de vertering van de weefsels toe totdat ze doorschijnend worden.Beëindig de spijsvertering door de weefsels voorzichtig naar beneden te draaien in een bench-top minicentrifuge op 2.000 keer G gedurende drie tot vijf seconden en vervang de supernatantverteringsbuffer door 750 microliter stopbuffer. Vervang de stopbuffer voorzichtig door 500 tot 750 microliter perfusiebuffer en trurateer de weefsels 30 keer met behulp van een vlamgepolijste Pasteur-pipet om de cellen te verspreiden. Trituur vervolgens voorzichtig de ventrikels.Voor uniforme bemonstering pipet u de cellen een paar keer voorzichtig op en neer om te resuspenderen, voordat u er een druppel van toevoegt voor overeenkomstige onderzoeken. Pluk de volwassen bulbus arteriosus uit de cardiovasculaire weefsels en pool vijf bulbus arteriosus in een 1,5 milliliter centrifugebuis met S1-buffer. Vervang S1 door 400 microliter S2-buffer en laat papaïnevertering van de bulbus arteriosus op een thermoshaker bij 37 graden Celsius en 800 omwentelingen per minuut gedurende 20 minuten.Laat de gedeeltelijk verteerde bulbus arteriosus een minuut bezinken en vervang het S2-supernatant door 500 microliter S3-buffer met collagenase. Verteer de weefsels op een thermoshaker bij 37 graden Celsius en 800 omwentelingen per minuut gedurende drie tot vijf minuten. Beëindig de spijsvertering door de weefsels voorzichtig naar beneden te draaien in een bench-top minicentrifuge op 2.000 keer G gedurende drie tot vijf seconden en vervang het S3-supernatant door 500 microliter S1. Trituur de gepelletiseerde weefsels voorzichtig om vasculaire gladde spiercellen te verspreiden.Plaat gedispergeerde vasculaire gladde spiercellen op glazen afdek slips van de juiste grootte. Houd de afdeksel slips op kamertemperatuur gedurende 30 minuten voor de cellen om te hechten, en gebruik ze binnen de komende zes uur. Verdoof de embryo's.Concentreer vervolgens de embryo's door ze over te brengen naar een centrifugebuis van vijf milliliter en verwijder vervolgens overtollige media. Was de embryo's tweemaal met drie milliliter koude perfusiebuffer en resuspenseer ze vervolgens in twee milliliter perfusiebuffer. Trek met behulp van het embryonale hartisolatieapparaat een milliliter van de embryo's in de naald en verdrijft ze onmiddellijk terug in de buis.Laat de gefragmenteerde embryo's door een zeef van 100 micrometer in een trechter gaan. Verzamel de gefilterde harten in een andere centrifugebuis van vijf milliliter. Meng het filtraat goed en scheid aliquots van één milliliter in centrifugebuizen van 1,5 milliliter.Centrifugeer alle buizen gedurende vijf seconden op een bench-top minicentrifuge en gooi het supernatant weg. Voer seriële resuspensie van de pellets in de buizen uit met behulp van één milliliter perfusiebuffer. Pipetteer de harten twee keer voorzichtig op en neer voordat u een druppel toevoegt voor overeenkomstige studies Voor cellen geïsoleerd uit bulbus arteriosus werden de vasculaire gladde spiercellen bevestigd door tagln: EGFP-expressie.Representatieve sporen van opnames van ATP-gevoelige kaliumkanaalactiviteit van geïsoleerde cardiomyocyten worden hier getoond. Succesvolle eenkanaalsopnamen werden verkregen in patches die uit de embryonale harten werden weggesneden. Ventriculaire myocyten vertoonden stabiele hyperpolariseerde membraanpotentialen en actiepotentialen werden gestimuleerd via stroominjectie door de patchpipet.Atriale myocyten vertoonden spontane actie potentiële vuren. Actiepotentiaaleigenschappen worden hier samengevat. Bij het vervangen van de buffers tijdens cardiomyocytendissociatie, moet ervoor worden gezorgd dat de spijsverteringsweefsels niet worden verstoord.Weefselfragmentatie mag alleen worden bereikt door pipettrituratie. Onderzoek tijdens de collageenachtige vertering van de bulbusweefsels elke minuut op zwevende, verwijde en doorschijnende weefsels. Zodra de weefselfragmentatie zichtbaar is, stop dan met de spijsvertering.Zodra de cellen zijn geïsoleerd, kunnen ze urenlang in leven worden gehouden en worden gebruikt voor elektrofysiologische analyse met behulp van patchklemtechnieken. Dit heeft ons bijvoorbeeld in staat gesteld om aan te tonen dat ATP-gevoelige kaliumkanalen in deze zebravisweefsels in wezen identiek zijn aan die bij zoogdieren.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

RNA isolatie van embryonale zebravis en cDNA synthese voor de analyse van genexpressie

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolatie van de Mens Umbilical arteriële gladde spiercellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Volwassen en embryonale skeletspier Microexplant Cultuur en isolatie van de skeletspieren Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Hart Dissection in larvale, jeugdige en volwassen zebravis, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser toegebrachte schade van zebravis Embryonale skeletspier

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolatie en Cultuur van individuele myovezels en hun satelliet cellen van volwassen skeletspier

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse van de embryonale en larvale zebravis Skeletal myovezels van Gedissocieerde Voorbereidingen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolatie van longslagader gladde spiercel van Neonatale Muizen

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolatie van muizen coronaire vasculaire gladde spiercellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolatie, karakterisering en differentiatie van cardiale stamcellen van het hart volwassen muis

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...