Name: isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies
Uploaded: 2022-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse HL140024 an CGN und HL150277 an CMC unterstützt. Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden mit BioRender.com erstellt.

Alle Zebrafische (Wildtypstamm AB, sowohl männlich als auch weiblich) wurden gemäß den Richtlinien des Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aufgezogen, gepflegt und für die Experimente behandelt.
1. Isolierung von Vorhof, Ventrikel und knolligem Arteriosus aus adulten, juvenilen und larven Zebrafischen
<ol><li>Euthanasieren Sie Fische mit Kälteschock, d.h. durch Eintauchen in 4 °C warmes Wasser, für ~10 s.</li>
	<li>Mit einer gebog...

<ol>
	<li>Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish's+swim+to+fame+as+an+experimental+model+in+biology.">The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).</li><li>Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+for+high-throughput+screens:+The+present+and+future+using+zebrafish.">Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).</li><li>Ke&#223;ler, M., Rottbauer, W., Just, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+use+of+zebrafish+for+novel+cardiac+drug+discovery.">Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).</li><li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+dissection+in+larval,+juvenile+and+adult+zebrafish,+Danio+rerio.">Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).</li><li>Brette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isolated+ventricular+myocytes+from+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).</li><li>Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+primary+cardiomyocytes+from+adult+zebrafish+hearts.">Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts.</a> Nature protocol. 8, 800-809 (2013).</li><li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart?+An+electrophysiological+study.">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+consequences+of+KATP+overactivity+in+Cantu+syndrome.">Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome.</a> JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).</li><li>Singareddy, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-sensitive+potassium+channels+in+zebrafish+cardiac+and+vascular+smooth+muscle.">ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).</li><li>Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+intestinal+smooth+muscle+development+using+a+novel+sm22&#945;-b+promoter.">Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22&#945;-b promoter.</a> Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).</li><li>Yang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+amount+in+situ+hybridization+and+transgene+via+microinjection+in+zebrafish.">Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).</li><li>Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenanthrene+impacts+zebrafish+cardiomyocyte+excitability+by+inhibiting+IKr+and+shortening+action+potential+duration.">Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration.</a> The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).</li><li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li></ol>

Frühere Methoden zur Isolierung ventrikulärer Myozyten5,6 von Zebrafischen, die darauf abzielten, Myozyten für Kultur- oder elektrophysiologische Studien zu erzeugen, lieferten Zellen mit geringerer Ausbeute und beinhalteten langwierige Schritte mehrerer Zentrifugationen, die die Zellqualität und Lebensfähigkeit beeinträchtigten. Die hier beschriebenen Protokolle sind zuverlässig, decken jedes der signifikanten kardiovaskulären Gewebe (Ventrikel, Vorhöfe...

Zebrafische sind kleine Teleostfische, die seit langem als Modell-Wirbeltierorganismus1 verwendet werden und in jüngster Zeit als lebensfähiges Wirbeltiersystem für das Hochdurchsatz-Screening von Genen und Medikamenten bekannt gewordensind 2,3. Die physiologische Analyse von Zebrafischgeweben ist jedoch nicht gut entwickelt. Im kardiovaskulären System wurden Methoden zur Dissektion von Zebrafischherzen4 und zur Isolierung von ventrikulären kardialen Myozyten 5,6,7 beschrieben. Es gibt nur wenige detaillierte Beschreibungen der effektiven Isolierung von Vorhofmyozyten und keine Berichte über Präparate der glatten Vaskulärmuskulatur (VSM) für Patch-Clamp-Studien.
Die aktuelle Arbeit beschreibt Methoden zur Isolierung von Herz- und Gefäßmyozyten von Zebrafischen, die für elektrophysiologische und funktionelle Studien geeignet sind. Dieser Ansatz umfasst Modifikationen der zuvor berichteten Protokolle für die ventrikuläre Myozytenisolierung von Zebrafischen5,6 und adaptiert Methoden aus VSM-Zellisolierungen von Säugetieren8, wodurch die Isolierung von glatten Zebrafisch-Gefäßmuskelzellen aus dem bauchigen Arteriosus (BA) ermöglicht wird. Die Protokolle führen zu effizienten Ausbeuten von isolierten atrialen, ventrikulären und VSM-Zellen aus Zebrafischen, die zuverlässig in Patch-Clamp-Studien für bis zu 8 h9 verwendet werden können.
Trotz ihrer nahezu transparenten Larven, die sich vollständig außerhalb des elterlichen Organismus entwickeln, war die Erforschung ihres versprochenen ontogenetischen Potenzials bei der Untersuchung der kardiovaskulären Entwicklung durch Herausforderungen bei der Extraktion und Analyse von Geweben in jungen Jahren begrenzt. Der aktuelle Artikel befasst sich mit dieser Einschränkung, indem er Patch-Clamp-Experimente an Zebrafischherzen demonstriert, die bereits 3 Tage nach der Befruchtung (dpf) unter Verwendung einer angepassten, veröffentlichten Extraktionsmethode isoliert wurden10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 Guage Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119479</td>
			<td>For embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Used for action potential recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Mini Centrifuge</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>MLX-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Strainer Sieve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06336-71</td>
			<td>100 &#956;m sieve for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type H</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #5</td>
			<td>Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981</td>
			<td>For dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Hematocrit Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>41A2502</td>
			<td>Soda lime glass for patch pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td>100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>For adult and juvenile zebrafish decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #SF</td>
			<td>For isolating larval CV tissues (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13687711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate (MS222)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For anaesthetizing zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies

Zebrafische werden seit langem als Modell-Wirbeltierorganismus in der Herz-Kreislauf-Forschung eingesetzt. Die technischen Schwierigkeiten, einzelne Zellen aus dem kardiovaskulären Gewebe des Zebrafischs zu isolieren, schränkten die Untersuchung ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften ein. Frühere Methoden wurden für die Dissektion von Zebrafischherzen und die Isolierung von ventrikulären Herzmyozyten beschrieben. Die Isolierung von Zebrafisch-Vorhof- und Gefäßmyozyten zur elektrophysiologischen Charakterisierung war jedoch nicht detailliert. Diese Arbeit beschreibt neue und modifizierte enzymatische Protokolle, die routinemäßig isolierte juvenile und adulte Zebrafisch-Ventrikel- und Vorhof-Kardiomyozyten sowie vaskuläre glatte Muskelzellen (VSM) aus dem bauchigen Arteriosus bereitstellen, die für Patch-Clamp-Experimente geeignet sind. Es gibt keine literarischen Beweise für elektrophysiologische Studien an kardiovaskulärem Gewebe von Zebrafischen, die in embryonalen und larven Entwicklungsstadien isoliert wurden. Partielle Dissoziationstechniken, die Patch-Clamp-Experimente an einzelnen Zellen aus Larven- und embryonalen Herzen ermöglichen, werden demonstriert.

Die oben genannten Protokolle liefern zuverlässig und routinemäßig ausreichend kardiale und vaskuläre Myozyten von gleichbleibender Qualität, die für Patch-Clamp-Studien geeignet sind, wie kürzlich in umfangreichen Studien von ATP-sensitiven Kaliumkanälen (KATP) in Wildtyp- und mutierten Zebrafisch-Kardiovaskulatur berichtetwurde 9. Repräsentative Spuren von Aufzeichnungen einer solchenK-ATP-Kanalaktivität von isolierten Kardiomyozyten sind in A...

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Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Das vorliegende Protokoll beschreibt die akute Isolierung lebensfähiger kardialer und vaskulärer glatter Muskelzellen aus adulten, juvenilen, larven und embryonalen Zebrafischen (Danio rerio), die für elektrophysiologische Untersuchungen geeignet sind.

Isolierung von kardialen und vaskulären glatten Muskelzellen aus adulten, juvenilen, Larven und embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Die Untersuchung nativer Ionenkanaleigenschaften mittels Patch-Clamp-Elektrophysiologie erfordert den Zugang zu akut isolierten Zellen. Dieses Protokoll beschreibt Methoden für den Zugang zu einzelnen kardiovaskulären Myozyten von Zebrafischen in verschiedenen Altersstufen. Dieses Protokoll ist robust, einfach, leicht reproduzierbar und isoliert kardiovaskuläre Myozyten aus Zebrafischen in ihrem nativen Zustand mit relativ hohem Ertrag und Lebensfähigkeit.Um zu beginnen, geben Sie den Fisch in eine große Petrischale, die teilweise mit Perfusionspuffer gefüllt ist, und legen Sie ihn unter ein Seziermikroskop. Halten Sie den Fisch in der nicht dominanten Hand, wobei die ventrale Seite dem Sezierbereich zugewandt ist. Mit der feinen Pinzette in der dominanten Hand reißen Sie vorsichtig die Brustmuskeln und Flossen des Fisches auf, um das kardiovaskuläre Gewebe einschließlich Vorhof, Ventrikel und Bulbus arteriosus freizulegen.Ziehen Sie den Bulbus arteriosus vorsichtig an der sich kreuzenden Spitze des Bulbus arteriosus und der ventralen Aorta. Trennen Sie den Bulbus arteriosus vorsichtig von der Aorta, indem Sie die Pinzette kneifen und die Spitze des Vorhofs in die mehreren Venenäste einordnen, die zusammenlaufen. Dann zupfen Sie die Spitze des Atriums vom Sinus venosus, um das kardiovaskuläre Gewebe vom Rest des Körpers zu isolieren.Um Kardiomyozyten zu sezieren, zupfen Sie den Vorhof und den Ventrikel aus dem kardiovaskulären Gewebe. Machen Sie einen sanften Riss in den Ventrikel mit feinen Pinzetten, um überschüssiges Blut abzulassen, was sichergestellt werden kann, wenn das Herzgewebe von leuchtend rot zu einer blassen Lachsfarbe wird. Poolen Sie das isolierte Atrium und den Ventrikel in einem separaten 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit Perfusionspuffer.Ersetzen Sie den Perfusionspuffer in den Röhrchen durch 750 Mikroliter Verdauungspuffer. Legen Sie die Schläuche auf einen Thermoshaker bei 37 Grad Celsius und 800 Umdrehungen pro Minute. Lassen Sie die Verdauung der Gewebe zu, bis sie durchscheinend werden.Beenden Sie die Verdauung, indem Sie das Gewebe in einer Tisch-Minizentrifuge bei 2.000 Mal G für drei bis fünf Sekunden vorsichtig herunterdrehen und den überstehenden Verdauungspuffer durch 750 Mikroliter Stopppuffer ersetzen. Ersetzen Sie den Stopppuffer vorsichtig durch 500 bis 750 Mikroliter Perfusionspuffer und trituieren Sie das Gewebe 30 Mal mit einer flammpolierten Pasteur-Pipette, um die Zellen zu dispergieren. Dann trituieren Sie sanft die Ventrikel.Für eine gleichmäßige Probenahme pipetten Sie die Zellen vorsichtig ein paar Mal nach oben und unten, um sie zu resuspendieren, bevor Sie einen Tropfen von ihnen für entsprechende Studien hinzufügen. Zupfen Sie den erwachsenen Bulbus arteriosus aus dem Herz-Kreislauf-Gewebe und fassen Sie fünf Bulbus arteriosus in ein 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit S1-Puffer. Ersetzen Sie S1 durch 400 Mikroliter S2-Puffer und lassen Sie die Papain-Verdauung des Bulbus arteriosus auf einem Thermoshaker bei 37 Grad Celsius und 800 Umdrehungen pro Minute für 20 Minuten zu.Lassen Sie den teilweise verdauten Bulbus arteriosus für eine Minute ruhen und ersetzen Sie den S2-Überstand durch 500 Mikroliter S3-Puffer mit Kollagenase. Verdauen Sie das Gewebe auf einem Thermoshaker bei 37 Grad Celsius und 800 Umdrehungen pro Minute für drei bis fünf Minuten. Beenden Sie die Verdauung, indem Sie das Gewebe in einer Tisch-Minizentrifuge bei 2.000 Mal G für drei bis fünf Sekunden vorsichtig herunterdrehen und den S3-Überstand durch 500 Mikroliter S1 ersetzen. Trituieren Sie das pelletierte Gewebe sanft, um die glatten Gefäßmuskelzellen zu verteilen.Platte verteilte vaskuläre glatte Muskelzellen auf Glasabdeckungsgläser geeigneter Größe. Bewahren Sie die Deckgläser 30 Minuten lang bei Raumtemperatur auf, damit die Zellen sie anbringen können, und verwenden Sie sie innerhalb der nächsten sechs Stunden. Betäuben Sie die Embryonen.Dann konzentrieren Sie die Embryonen, indem Sie sie in ein Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen übertragen und dann überschüssiges Medium entfernen. Waschen Sie die Embryonen zweimal mit drei Milliliter kaltem Perfusionspuffer und resuspendieren Sie sie dann in zwei Milliliter Perfusionspuffer. Mit dem embryonalen Herzisolierungsapparat einen Milliliter der Embryonen in die Nadel ziehen und sofort wieder in die Röhre ausstoßen.Führen Sie die fragmentierten Embryonen durch ein 100-Mikrometer-Zellsieb, das in einem Trichter platziert ist. Sammeln Sie die gefilterten Herzen in einem weiteren Fünf-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Mischen Sie das Filtrat gut und trennen Sie Ein-Milliliter-Aliquots in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.Zentrifugieren Sie alle Röhrchen fünf Sekunden lang auf einer Tisch-Minizentrifuge und entsorgen Sie den Überstand. Führen Sie eine serielle Resuspension der Pellets in den Röhrchen mit einem Milliliter Perfusionspuffer durch. Pipettieren Sie die Herzen vorsichtig zweimal auf und ab, bevor Sie einen Tropfen für entsprechende Studien hinzufügen Für Zellen, die aus Bulbus arteriosus isoliert wurden, wurden die vaskulären glatten Muskelzellen durch tagln:EGFP-Expression bestätigt.Repräsentative Spuren von Aufzeichnungen der ATP-sensitiven Kaliumkanalaktivität aus isolierten Kardiomyozyten sind hier dargestellt. Erfolgreiche Einkanalaufnahmen wurden in Pflastern erhalten, die aus den embryonalen Herzen herausgeschnitten wurden. Ventrikuläre Myozyten zeigten stabile hyperpolarisierte Membranpotentiale, und Aktionspotentiale wurden durch Strominjektion durch die Pflasterpipette stimuliert.Vorhofmyozyten zeigten ein spontanes Aktionspotential. Aktionspotenzialeigenschaften sind hier zusammengefasst. Beim Austausch der Puffer während der Kardiomyozytendissoziation sollte darauf geachtet werden, dass das Verdauungsgewebe nicht gestört wird.Die Gewebefragmentierung sollte nur durch Pipettenverreibung erreicht werden. Während der kollagenen Verdauung des Bulbusgewebes jede Minute auf schwimmendes, erweitertes und durchscheinendes Gewebe untersuchen. Sobald die Gewebefragmentierung offensichtlich ist, beenden Sie die Verdauung.Sobald die Zellen isoliert sind, können sie stundenlang am Leben erhalten und für elektrophysiologische Analysen mit Patch-Clamp-Techniken verwendet werden. So konnten wir beispielsweise zeigen, dass ATP-empfindliche Kaliumkanäle in diesen Zebrafischgeweben im Wesentlichen identisch mit denen von Säugetieren sind.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

RNA Isolation aus embryonalen Zebrafisch und cDNA-Synthese für die Genexpressionsanalyse

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Forschung

Biologie

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolierung humaner Nabelschnur arteriellen glatten Muskelzellen (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulten und embryonalen Skelettmuskel Microexplant Kultur und Isolation der Skelettmuskulatur Stem Cells

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Herz Dissection in Larven, juvenile und adulte Zebrafisch, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-Schädigung der Zebrafisch Embryonale Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analyse der embryonalen Zebrafisch-Larven-und Skelett Muskelfasern aus Dissoziierte Vorbereitungen

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolation der Lungenarterie glatten Muskelzellen aus neugeborenen Mäusen

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Die Isolierung von murinen Coronary glatten Gefäßmuskelzellen

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolierung, Charakterisierung und Differenzierung von kardialen Stammzellen von Erwachsenen Maus Herzen

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...