Name: isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies
Uploaded: 2022-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH HL140024 ל- CGN ו- HL150277 ל- CMC. איור 1 ואיור 2 נוצרו עם BioRender.com.

כל דגי הזברה (זן בר מסוג AB, זכר ונקבה כאחד) גודלו, תוחזקו וטופלו לניסויים בהתאם להנחיות הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת וושינגטון (IACUC).
1. בידוד של אטריום, חדר, ו bulbous arteriosus מן דגי זברה בוגרים, צעירים, זחל
<ol><li>להרדים דגים באמצעות הלם קר, כלומר, על ?...

<ol>
	<li>Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish's+swim+to+fame+as+an+experimental+model+in+biology.">The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).</li><li>Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+for+high-throughput+screens:+The+present+and+future+using+zebrafish.">Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).</li><li>Ke&#223;ler, M., Rottbauer, W., Just, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+use+of+zebrafish+for+novel+cardiac+drug+discovery.">Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).</li><li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+dissection+in+larval,+juvenile+and+adult+zebrafish,+Danio+rerio.">Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).</li><li>Brette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isolated+ventricular+myocytes+from+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).</li><li>Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+primary+cardiomyocytes+from+adult+zebrafish+hearts.">Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts.</a> Nature protocol. 8, 800-809 (2013).</li><li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart?+An+electrophysiological+study.">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+consequences+of+KATP+overactivity+in+Cantu+syndrome.">Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome.</a> JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).</li><li>Singareddy, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-sensitive+potassium+channels+in+zebrafish+cardiac+and+vascular+smooth+muscle.">ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).</li><li>Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+intestinal+smooth+muscle+development+using+a+novel+sm22&#945;-b+promoter.">Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22&#945;-b promoter.</a> Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).</li><li>Yang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+amount+in+situ+hybridization+and+transgene+via+microinjection+in+zebrafish.">Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).</li><li>Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenanthrene+impacts+zebrafish+cardiomyocyte+excitability+by+inhibiting+IKr+and+shortening+action+potential+duration.">Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration.</a> The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).</li><li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li></ol>

שיטות קודמות לבידוד מיוציטים חדריים של דגי זברה5,6, שמטרתן ליצור מיוציטים למחקרים תרבית או אלקטרופיזיולוגיים, סיפקו תאים בעלי תפוקה נמוכה יותר וכללו שלבים ארוכים של צנטריפוגות מרובות שהשפיעו לרעה על איכות התאים ועל כדאיותם. הפרוטוקולים המתוארים כאן אמינים...

דגי זברה הם דגי טלוסט קטנים המשמשים זה מכבר כאורגניזם מודל של בעלי חוליות1 ולאחרונה עלו לגדולה כמערכת בעלי חוליות בת קיימא לסינון תפוקה גבוהה של גנים ותרופות 2,3. עם זאת, ניתוח פיזיולוגי של רקמות דג זברה אינו מפותח היטב. במערכת הלב וכלי הדם תוארו שיטות לכריתה של לבבות דגי זברה4 ובידוד של מיוציטים לבביים חדריים 5,6,7. ישנם מעט תיאורים מפורטים של בידוד יעיל של מיוציטים פרוזדורים ואין דיווחים על תכשירים של שריר חלק וסקולרי (VSM) למחקרי מהדק טלאי.
העבודה הנוכחית מתארת מתודולוגיה לבידוד של מיוציטים לבביים וכלי דם של דגי זברה, בת קיימא למחקרים אלקטרופיזיולוגיים ותפקודיים. גישה זו כוללת שינויים בפרוטוקולים שדווחו בעבר לבידוד מיוציטים חדריים של דגי זברה 5,6 ומתאימה שיטות מבידודים של תאי VSM של יונקים8, מה שמאפשר בידוד של תאי שריר חלק של כלי דם של דגי זברה מה-bulbous arteriosus (BA). הפרוטוקולים מביאים לתפוקות יעילות של תאי פרוזדורים, חדרים ו-VSM מבודדים מדגי זברה, שניתן להשתמש בהם באופן אמין במחקרי מהדק טלאים עד 8 שעות9.
למרות הזחלים הכמעט שקופים שלהם המתפתחים לחלוטין מחוץ לאורגניזם ההורי, חקר הפוטנציאל האונטוגנטי המובטח שלהם בחקר התפתחות הלב וכלי הדם הוגבל על ידי אתגרים בחילוץ וניתוח רקמות בגיל צעיר. המאמר הנוכחי נותן מענה למגבלה זו על ידי הדגמת ניסויי הידוק טלאים על לבבות דגי זברה שבודדו כבר 3 ימים לאחר ההפריה (dpf), באמצעות שיטת מיצוימותאמת שפורסמה 10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 Guage Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119479</td>
			<td>For embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Used for action potential recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Mini Centrifuge</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>MLX-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Strainer Sieve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06336-71</td>
			<td>100 &#956;m sieve for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type H</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #5</td>
			<td>Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981</td>
			<td>For dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Hematocrit Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>41A2502</td>
			<td>Soda lime glass for patch pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td>100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>For adult and juvenile zebrafish decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #SF</td>
			<td>For isolating larval CV tissues (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13687711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate (MS222)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For anaesthetizing zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies

דגי זברה משמשים זה זמן רב כאורגניזם מודל של בעלי חוליות בחקר הלב וכלי הדם. הקשיים הטכניים של בידוד תאים בודדים מרקמות הלב וכלי הדם של דגי הזברה מגבילים בחקר התכונות האלקטרופיזיולוגיות שלהם. שיטות קודמות תוארו עבור דיסקציה של לבבות דגי זברה ובידוד של מיוציטים לבביים חדריים. עם זאת, הבידוד של דגי זברה פרוזדורים ומיוציטים וסקולריים לאפיון אלקטרופיזיולוגי לא היה מפורט. עבודה זו מתארת פרוטוקולים אנזימטיים חדשים ומותאמים המספקים באופן שגרתי קרדיומיוציטים חדריים ופרוזדורים מבודדים של דגי זברה צעירים ובוגרים, כמו גם תאי שריר חלק וסקולרי (VSM) מהעורק הבולבוסי, המתאימים לניסויים של מהדק טלאי. לא נמצאו עדויות ספרותיות למחקרים אלקטרופיזיולוגיים על רקמות לב וכלי דם של דגי זברה שבודדו בשלבי התפתחות עובריים וזחליים. הודגמו טכניקות דיסוציאציה חלקיות המאפשרות ניסויים של מהדקי טלאים על תאים בודדים מלב זחלים ועובריים.

הפרוטוקולים הנ"ל מספקים באופן אמין ושגרתי מספיק מיוציטים לבביים וכלי דם באיכות עקבית מקובלת למחקרי מהדק טלאי כפי שדווח לאחרונה במחקרים מקיפים של תעלות אשלגן רגיש ל-ATP (K ATP) בסוג בר ודגי זברה מוטנטיים קרדיווסקולטוריים9. עקבות מייצגים של הקלטות של פעילות ערוץK ATP כזו ?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בידוד חריף של תאי שריר לב וכלי דם חלקים בני קיימא מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים (Danio rerio), המתאימים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים.

בידוד תאי שריר חלק לבביים וכלי דם מדגי זברה בוגרים, צעירים, זחליים ועובריים למחקרים אלקטרופיזיולוגיים

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

חקר תכונות תעלת יונים טבעיות באמצעות אלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי דורש גישה לתאים שבודדו באופן חריף. פרוטוקול זה מתאר שיטות לגישה למיוציטים קרדיווסקולריים בודדים מדגי זברה בגילאים שונים. פרוטוקול זה הוא חזק, פשוט, ניתן לשחזור בקלות, ומבודד מיוציטים קרדיווסקולריים מדגי זברה במצבם הטבעי עם תפוקה וכדאיות גבוהות יחסית.כדי להתחיל, מעבירים את הדגים לתוך צלחת פטרי גדולה מלאה חלקית בחיץ פרפוזיה ומניחים אותה תחת מיקרוסקופ מנתח. החזיקו את הדג ביד הלא דומיננטית כשצד הגחון פונה להיקף הנתיחה. עם המלקחיים העדינים ביד הדומיננטית, יש לקרוע בעדינות את שרירי החזה והסנפירים של הדג כדי לחשוף את רקמות הלב וכלי הדם כולל אטריום, חדר ובולבוס עורקי.משכו בעדינות את הבולבוס ארטריוסוס בקצה המצטלב של הבולבוס ארטריוסוס ואבי העורקים הגחוני. הפרידו בזהירות את הבולבוס ארטריוסוס מאבי העורקים על ידי צביטה של המלקחיים, איתור קצה האטריום לענפים הוורידיים המרובים המתכנסים. לאחר מכן, מורטים את קצה האטריום מהסינוס ונוס כדי לבודד את רקמות הלב וכלי הדם משאר הגוף.כדי לנתח קרדיומיוציטים, למרוט את האטריום ואת החדר מתוך רקמת הלב וכלי הדם. בצע קרע עדין לתוך החדר באמצעות מלקחיים עדינים כדי לנקז דם עודף, אשר ניתן להבטיח כאשר רקמת הלב הופך מאדום בוהק לצבע סלמון חיוור. איחד את האטריום והחדר המבודדים לתוך צינור צנטריפוגה נפרד של 1.5 מיליליטר המכיל חיץ זליפה.החלף את חיץ הזלוף בצינורות עם 750 מיקרוליטר של חיץ עיכול. מניחים את הצינורות על תרמושייקר ב 37 מעלות צלזיוס ו 800 סיבובים לדקה. אפשר עיכול של הרקמות עד שהם הופכים שקופים.סיים את העיכול על ידי סיבוב עדין של הרקמות במיניצנטריפוגה על ספסל ב 2, 000 פעמים G במשך שלוש עד חמש שניות ולהחליף את חיץ העיכול supernatant עם 750 microliters של חיץ עצירה. החלף בעדינות את חיץ העצירה ב-500 עד 750 מיקרוליטרים של חיץ פרפוזיה וטריפ את הרקמות 30 פעמים באמצעות פיפטה פסטר מלוטשת להבה כדי לפזר את התאים. לאחר מכן, בעדינות triturate את החדרים.לדגימה אחידה, פיפטו בעדינות את התאים למעלה ולמטה כמה פעמים כדי לבצע החייאה, לפני הוספת טיפה מהם למחקרים מתאימים. מלקטים את הבולבוס הבוגר מרקמות הלב וכלי הדם ומאגדים חמישה בולבוס ארטריוסוס לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל חיץ S1. החלף את S1 ב-400 מיקרוליטרים של חיץ S2 ואפשר עיכול פפאין של עורקי הבולבוס על תרמושייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-800 סיבובים לדקה למשך 20 דקות.אפשרו לבולבוס המעוכל חלקית להתיישב למשך דקה אחת והחליפו את הסופרנטנט S2 ב-500 מיקרוליטרים של חיץ S3 המכיל קולגן. לעכל את הרקמות על תרמושייקר ב 37 מעלות צלזיוס ו 800 סיבובים לדקה במשך שלוש עד חמש דקות. סיים את העיכול על ידי סיבוב עדין של הרקמות במיניצנטריפוגה על הספסל ב 2, 000 פעמים G במשך שלוש עד חמש שניות, ולהחליף את S3 supernatant עם 500 microliters של S1. יש לטרפד בעדינות את הרקמות הכדוריות כדי לפזר תאי שריר חלקים של כלי הדם.צלחת פיזרה תאי שריר חלקים של כלי הדם על גבי כיסויי זכוכית בגודל מתאים. יש לשמור את תלושי הכיסוי בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כדי שהתאים יתחברו, ולהשתמש בהם בשש השעות הקרובות. מרדימים את העוברים.לאחר מכן, לרכז את העוברים על ידי העברתם לצינור צנטריפוגה של חמישה מיליליטר, ולאחר מכן להסיר מדיה עודפת. לשטוף את העוברים עם שלושה מיליליטר של חיץ פרפוזיה קר פעמיים, ולאחר מכן להשעות אותם בשני מיליליטר של חיץ perfusion. באמצעות מנגנון בידוד הלב העוברי, למשוך מיליליטר אחד של העוברים לתוך המחט מיד לגרש אותם בחזרה לתוך הצינור.מעבירים את העוברים המקוטעים דרך מסננת תאים בגודל 100 מיקרומטר המונחת במשפך. אסוף את הלבבות המסוננים בצינור צנטריפוגה נוסף של חמישה מיליליטר. מערבבים היטב את התסנין ומפרידים אליקוטים של מיליליטר אחד לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר.צנטריפוגה את כל הצינורות על ספסל העליון minicentrifuge במשך חמש שניות ולהשליך את supernatant. לבצע resuspension סדרתי של גלולות בצינורות באמצעות מיליליטר אחד של חיץ perfusion. פיפטה עדינה של הלבבות למעלה ולמטה פעמיים לפני הוספת טיפה למחקרים מתאימים עבור תאים שבודדו מ-bulbus arteriosus, תאי השריר החלק של כלי הדם אושרו על ידי ביטוי tagln:EGFP.עקבות מייצגים של הקלטות של פעילות תעלת אשלגן רגישה ל- ATP מקרדיומיוציטים מבודדים מוצגים כאן. הקלטות חד-ערוציות מוצלחות התקבלו במדבקות שנכרתו מהלבבות העובריים. מיוציטים חדריים הפגינו פוטנציאלים יציבים של ממברנה היפר-קוטבית, ופוטנציאלי פעולה היו מגורה באמצעות הזרקת זרם דרך פיפטה המדבקה.מיוציטים פרוזדורים הציגו פוטנציאל פעולה ספונטני לירות. מאפיינים פוטנציאליים של פעולה מסוכמים כאן. בעת החלפת המאגרים במהלך דיסוציאציה cardiomyocyte, יש להקפיד כי רקמות העיכול אינם מופרעים.פיצול רקמות צריך להתבצע רק על ידי טריטורציה פיפטה. במהלך העיכול הקולגן של רקמות הבולבוס, יש לבדוק רקמות צפות, מורחבות ושקופות בכל דקה. ברגע שפיצול הרקמות נראה לעין, להפסיק את העיכול.לאחר בידוד התאים, ניתן לשמור אותם בחיים במשך שעות ולהשתמש בהם לניתוח אלקטרופיזיולוגי באמצעות טכניקות של מהדק טלאי. זה אפשר לנו, למשל, להראות שתעלות אשלגן רגישות ל-ATP ברקמות דגי הזברה האלה זהות במהותן לאלה שביונקים.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

RNA סינתזה ניתוק מן דג הזברה cDNA עובריים עבור ניתוח ביטוי גנים

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

בידוד של האדם עורקי טבורי תאים שרירים חלקים (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

הלב Dissection ב הזחל, דג הזברה לנוער ו למבוגרים, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

פגיעת הליזר הביא על שריר שלד עוברי דג זברה

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

ניתוח של עוברי וזחל myofibers שלד דג הזברה מהכנות ניתקו

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

בידוד של תאי שריר חלקים עורק ריאה מעכברים ילודים

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

בידוד של תאי שריר חלק Murine כלילית דם

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...