Name: isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies
Uploaded: 2022-02-09T14:30:00
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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH HL140024 a CGN e HL150277 a CMC. La Figura 1 e la Figura 2 sono state create con BioRender.com.

Tutti i pesci zebra (ceppo AB di tipo selvatico, sia maschio che femmina) sono stati allevati, mantenuti e gestiti per gli esperimenti seguendo le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Washington University (IACUC).
1. Isolamento dell'atrio, del ventricolo e dell'arterioso bulboso da zebrafish adulti, giovani e larvali
<ol><li>Eutanasia del pesce usando lo shock a freddo, cioè immergendolo in acqua a 4 °C, per ~10 s.</li>
	<li>Usand...

<ol>
	<li>Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish's+swim+to+fame+as+an+experimental+model+in+biology.">The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).</li><li>Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+for+high-throughput+screens:+The+present+and+future+using+zebrafish.">Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).</li><li>Ke&#223;ler, M., Rottbauer, W., Just, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+use+of+zebrafish+for+novel+cardiac+drug+discovery.">Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).</li><li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+dissection+in+larval,+juvenile+and+adult+zebrafish,+Danio+rerio.">Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).</li><li>Brette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isolated+ventricular+myocytes+from+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).</li><li>Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+primary+cardiomyocytes+from+adult+zebrafish+hearts.">Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts.</a> Nature protocol. 8, 800-809 (2013).</li><li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart?+An+electrophysiological+study.">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+consequences+of+KATP+overactivity+in+Cantu+syndrome.">Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome.</a> JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).</li><li>Singareddy, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-sensitive+potassium+channels+in+zebrafish+cardiac+and+vascular+smooth+muscle.">ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).</li><li>Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+intestinal+smooth+muscle+development+using+a+novel+sm22&#945;-b+promoter.">Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22&#945;-b promoter.</a> Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).</li><li>Yang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+amount+in+situ+hybridization+and+transgene+via+microinjection+in+zebrafish.">Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).</li><li>Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenanthrene+impacts+zebrafish+cardiomyocyte+excitability+by+inhibiting+IKr+and+shortening+action+potential+duration.">Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration.</a> The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).</li><li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li></ol>

I precedenti metodi per isolare i miociti ventricolari 5,6 del pesce zebra, volti a generare miociti per studi di coltura o elettrofisiologici, hanno fornito cellule di resa inferiore e hanno comportato lunghi passaggi di centrifugazioni multiple che hanno influito negativamente sulla qualità e sulla vitalità cellulare. I protocolli qui descritti sono affidabili, coprono ciascuno dei tessuti cardiovascolari significativi (ventricolo, atri e VSM) e, soprattutto,...

I pesci zebra sono piccoli pesci teleostei che sono stati a lungo utilizzati come organismo vertebrato modello1 e recentemente sono venuti alla ribalta come un sistema vertebrato vitale per lo screening ad alto rendimento di geni e farmaci 2,3. Tuttavia, l'analisi fisiologica dei tessuti zebrafish non è ben sviluppata. Nel sistema cardiovascolare sono stati descritti metodi per la dissezione dei cuori di zebrafish4 e l'isolamento dei miociti cardiaci ventricolari 5,6,7. Ci sono poche descrizioni dettagliate dell'efficace isolamento dei miociti atriali e nessuna segnalazione di preparazioni di muscolatura liscia vascolare (VSM) per studi patch-mord.
Il lavoro attuale descrive la metodologia per l'isolamento dei miociti cardiaci e vascolari del pesce zebra, praticabile per studi elettrofisiologici e funzionali. Questo approccio include modifiche dei protocolli precedentemente riportati per l'isolamento dei miociti ventricolari 5,6 del pesce zebra e adatta i metodi dagli isolamenti delle cellule VSM dei mammiferi8, consentendo l'isolamento delle cellule muscolari lisce vascolari del pesce zebra dall'arterioso bulboso (BA). I protocolli si traducono in rese efficienti di cellule atriali, ventricolari e VSM isolate da zebrafish che possono essere utilizzate in modo affidabile negli studi patch-clamp per un massimo di 8 ore9.
Nonostante le loro larve quasi trasparenti si sviluppino interamente al di fuori dell'organismo parentale, esplorare il loro potenziale ontogenetico promesso nello studio dello sviluppo cardiovascolare è stato limitato dalle sfide nell'estrazione e nell'analisi dei tessuti in giovane età. L'articolo attuale affronta questa limitazione dimostrando esperimenti patch-clamp su cuori di zebrafish isolati già 3 giorni dopo la fecondazione (dpf), utilizzando un metodo di estrazione adattato e pubblicato10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 Guage Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119479</td>
			<td>For embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Used for action potential recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Mini Centrifuge</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>MLX-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Strainer Sieve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06336-71</td>
			<td>100 &#956;m sieve for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type H</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #5</td>
			<td>Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981</td>
			<td>For dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Hematocrit Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>41A2502</td>
			<td>Soda lime glass for patch pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td>100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>For adult and juvenile zebrafish decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #SF</td>
			<td>For isolating larval CV tissues (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13687711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate (MS222)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For anaesthetizing zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies

I pesci zebra sono stati a lungo utilizzati come organismo vertebrato modello nella ricerca cardiovascolare. Le difficoltà tecniche di isolare le singole cellule dai tessuti cardiovascolari del pesce zebra sono state limitanti nello studio delle loro proprietà elettrofisiologiche. Sono stati descritti metodi precedenti per la dissezione dei cuori di zebrafish e l'isolamento dei miociti cardiaci ventricolari. Tuttavia, l'isolamento dei miociti atriali e vascolari del pesce zebra per la caratterizzazione elettrofisiologica non è stato dettagliato. Questo lavoro descrive protocolli enzimatici nuovi e modificati che forniscono abitualmente cardiomiociti ventricolari e atriali giovanili e adulti isolati, nonché cellule di muscolo liscio vascolare (VSM) dall'arterioso bulboso, adatte per esperimenti patch-clamp. Non ci sono state prove letterarie di studi elettrofisiologici su tessuti cardiovascolari di zebrafish isolati negli stadi di sviluppo embrionale e larvale. Vengono dimostrate tecniche di dissociazione parziale che consentono esperimenti patch-clamp su singole cellule di cuori larvali ed embrionali.

I suddetti protocolli forniscono in modo affidabile e di routine sufficienti miociti cardiaci e vascolari di qualità costante suscettibili di studi patch-clamp come recentemente riportato in studi approfonditi sui canali del potassio (K ATP) sensibiliall'ATP nella cardiovascolarizzazione del pesce zebra wild-type e mutante9. Tracce rappresentative di registrazioni di tale attività del canale KATP da cardiomiociti isolati sono mostrate nella Figura 3A-C<...

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Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Il presente protocollo descrive l'isolamento acuto di cellule muscolari lisce cardiache e vascolari vitali da pesci zebra adulti, giovanili, larvali ed embrionali (Danio rerio), adatti per studi elettrofisiologici.

Isolamento di cellule muscolari lisce cardiache e vascolari da pesci zebra adulti, giovanili, larvali ed embrionali per studi elettrofisiologici

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Lo studio delle proprietà native dei canali ionici utilizzando l'elettrofisiologia patch clamp richiede l'accesso a cellule gravemente isolate. Questo protocollo descrive i metodi per accedere ai singoli miociti cardiovascolari dal pesce zebra in età diverse. Questo protocollo è robusto, semplice, facilmente riproducibile e isola i miociti cardiovascolari dai pesci zebra nel loro stato nativo con una resa e una vitalità relativamente elevate.Per iniziare, trasferire il pesce in una grande capsula di Petri parzialmente riempita con tampone di perfusione e metterlo sotto un microscopio da dissezione. Tenere il pesce nella mano non dominante con il lato ventrale rivolto verso l'oscilloscopio di dissezione. Con la pinza sottile nella mano dominante, aprire delicatamente i muscoli pettorali e le pinne del pesce per rivelare i tessuti cardiovascolari tra cui atrio, ventricolo e bulbo arterioso.Tirare delicatamente il bulbo arterioso sulla punta intersecante del bulbo arterioso e dell'aorta ventrale. Separare con cura il bulbo arterioso dall'aorta pizzicando la pinza, localizzando la punta dell'atrio nei rami venosi multipli che convergono. Quindi, strappare la punta dell'atrio dal seno venoso per isolare i tessuti cardiovascolari dal resto del corpo.Per sezionare i cardiomiociti, estrarre l'atrio e il ventricolo dal tessuto cardiovascolare. Fai una leggera lacrima nel ventricolo usando una pinza fine per drenare il sangue in eccesso, che può essere assicurato quando il tessuto cardiaco passa dal rosso vivo al colore del salmone pallido. Raggruppare l'atrio isolato e il ventricolo in un tubo da centrifuga separato da 1,5 millilitri contenente tampone di perfusione.Sostituire il tampone di perfusione nei tubi con 750 microlitri di tampone di digestione. Posizionare i tubi su un termoshaker a 37 gradi Celsius e 800 giri al minuto. Consentire la digestione dei tessuti fino a quando non diventano traslucidi.Terminare la digestione ruotando delicatamente i tessuti in una minicentrifuga da banco a 2.000 volte G per tre-cinque secondi e sostituire il tampone di digestione surnatante con 750 microlitri di tampone di arresto. Sostituire delicatamente il tampone di arresto con 500-750 microlitri di tampone di perfusione e triturare i tessuti 30 volte utilizzando una pipetta Pasteur lucidata a fiamma per disperdere le cellule. Quindi, triturare delicatamente i ventricoli.Per un campionamento uniforme, pipettare delicatamente le cellule su e giù un paio di volte per risospendere, prima di aggiungerne una goccia per gli studi corrispondenti. Prelevare il bulbo arterioso adulto dai tessuti cardiovascolari e raggruppare cinque bulbo arterioso in un tubo da centrifuga da 1,5 millilitri contenente tampone S1. Sostituire S1 con 400 microlitri di tampone S2 e consentire la digestione della papaina del bulbo arterioso su un termoshaker a 37 gradi Celsius e 800 giri al minuto per 20 minuti.Lasciare che il bulbo arterioso parzialmente digerito si stabilizzi per un minuto e sostituire il surnatante S2 con 500 microlitri di tampone S3 contenente collagenasi. Digerire i tessuti su un termoshaker a 37 gradi Celsius e 800 giri al minuto per tre-cinque minuti. Terminare la digestione facendo ruotare delicatamente i tessuti in una minicentrifuga da banco a 2.000 volte G per tre-cinque secondi e sostituire il surnatante S3 con 500 microlitri di S1. Triturare delicatamente i tessuti pellettati per disperdere le cellule muscolari lisce vascolari.Piastra dispersa cellule muscolari lisce vascolari su vetrini di copertura di dimensioni adeguate. Tenere i vetrini di copertura a temperatura ambiente per 30 minuti affinché le celle si attacchino e utilizzarli entro le prossime sei ore. Anestetizzare gli embrioni.Quindi, concentrare gli embrioni trasferendoli in una provetta da centrifuga da cinque millilitri, quindi rimuovere i mezzi in eccesso. Lavare gli embrioni con tre millilitri di tampone di perfusione fredda due volte, quindi risospenderli in due millilitri di tampone di perfusione. Utilizzando l'apparato di isolamento cardiaco embrionale, aspirare un millilitro di embrioni nell'ago ed espellerli immediatamente nel tubo.Far passare gli embrioni frammentati attraverso un setaccio a filtro cellulare di 100 micrometri posto in un imbuto. Raccogliere i cuori filtrati in un altro tubo da centrifuga da cinque millilitri. Mescolare bene il filtrato e separare le aliquote da un millilitro in provette da centrifuga da 1,5 millilitri.Centrifugare tutti i tubi su una minicentrifuga da banco per cinque secondi ed eliminare il surnatante. Effettuare la risospensione seriale dei pellet nei tubi utilizzando un millilitro di tampone di perfusione. Pipettare delicatamente i cuori su e giù due volte prima di aggiungere una goccia per gli studi corrispondenti Per le cellule isolate dal bulbo arterioso, le cellule muscolari lisce vascolari sono state confermate dall'espressione di tagln:EGFP.Qui sono mostrate tracce rappresentative di registrazioni dell'attività dei canali del potassio sensibili all'ATP da cardiomiociti isolati. Le registrazioni a canale singolo di successo sono state ottenute in cerotti asportati dai cuori embrionali. I miociti ventricolari hanno mostrato potenziali di membrana iperpolarizzati stabili e i potenziali d'azione sono stati stimolati tramite iniezione di corrente attraverso la pipetta patch.I miociti atriali hanno mostrato un potenziale di azione spontanea. Le proprietà del potenziale d'azione sono riassunte qui. Durante la sostituzione dei tamponi durante la dissociazione dei cardiomiociti, è necessario prestare attenzione che i tessuti digestivi non siano disturbati.La frammentazione tissutale deve essere ottenuta solo mediante triturazione con pipette. Durante la digestione collagenosa dei tessuti bulbosi, esaminare i tessuti galleggianti, dilatati e traslucidi ogni minuto. Una volta che la frammentazione del tessuto è evidente, cessare la digestione.Una volta isolate, le cellule possono essere mantenute in vita per ore e utilizzate per l'analisi elettrofisiologica utilizzando tecniche di patch mors. Questo ci ha permesso, ad esempio, di dimostrare che i canali del potassio sensibili all'ATP in questi tessuti zebrafish sono essenzialmente identici a quelli dei mammiferi.

Research

JoVE Journal

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