Name: isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies
Uploaded: 2022-02-09T14:30:00
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이 작업은 CGN에 대한 NIH 보조금 HL140024 및 CMC에 HL150277에 의해 지원되었습니다. 그림 1과 그림 2는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

모든 제브라피쉬(야생형 균주 AB, 수컷과 암컷 모두)는 워싱턴 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 지침에 따라 실험을 위해 사육, 유지 및 처리되었습니다.
1. 성체, 청소년 및 유충 제브라 피쉬에서 심방, 심실 및 구근 동맥의 분리
<ol><li>냉 충격, 즉 4°C의 물에 ~10초 동안 담가 물고기를 안락사시킵니다.</li>
	<li>구부러진 집게를 사용하여 생선을 관류 ?...

<ol>
	<li>Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish's+swim+to+fame+as+an+experimental+model+in+biology.">The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).</li><li>Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+for+high-throughput+screens:+The+present+and+future+using+zebrafish.">Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).</li><li>Ke&#223;ler, M., Rottbauer, W., Just, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+use+of+zebrafish+for+novel+cardiac+drug+discovery.">Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).</li><li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+dissection+in+larval,+juvenile+and+adult+zebrafish,+Danio+rerio.">Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).</li><li>Brette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isolated+ventricular+myocytes+from+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).</li><li>Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+primary+cardiomyocytes+from+adult+zebrafish+hearts.">Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts.</a> Nature protocol. 8, 800-809 (2013).</li><li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart?+An+electrophysiological+study.">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+consequences+of+KATP+overactivity+in+Cantu+syndrome.">Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome.</a> JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).</li><li>Singareddy, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-sensitive+potassium+channels+in+zebrafish+cardiac+and+vascular+smooth+muscle.">ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).</li><li>Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+intestinal+smooth+muscle+development+using+a+novel+sm22&#945;-b+promoter.">Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22&#945;-b promoter.</a> Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).</li><li>Yang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+amount+in+situ+hybridization+and+transgene+via+microinjection+in+zebrafish.">Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).</li><li>Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenanthrene+impacts+zebrafish+cardiomyocyte+excitability+by+inhibiting+IKr+and+shortening+action+potential+duration.">Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration.</a> The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).</li><li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li></ol>

배양 또는 전기 생리 학적 연구를 위해 근육 세포를 생성하는 것을 목표로하는 제브라 피쉬 심실 근육 세포 5,6을 분리하기위한 이전 방법은 낮은 수율의 세포를 제공하고 세포 품질 및 생존력에 악영향을 미치는 다중 원심 분리의 긴 단계를 포함했습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 신뢰할 수 있으며 중요한 심혈관 조직 (심실, 심방 및 VSM) 각각을 다루...

제브라피쉬는 오랫동안 모델 척추동물 유기체1로 사용되어 왔으며 최근에는 유전자 및 약물 2,3의 고처리량 스크리닝을 위한 실행 가능한 척추동물 시스템으로 두각을 나타내고 있는 작은 텔레오스트 물고기입니다. 그러나 제브라 피쉬 조직의 생리 학적 분석은 잘 발달되어 있지 않습니다. 심장 혈관계에서 제브라 피쉬 심장4의 해부와 심실 심장 근육 세포의 분리 5,6,7에 대한 방법이 설명되었습니다. 심방 근육 세포의 효과적인 분리에 대한 자세한 설명은 거의 없으며 패치 클램프 연구를위한 혈관 평활근 (VSM) 준비에 대한보고는 없습니다.
현재의 연구는 전기 생리 학적 및 기능적 연구에 적합한 제브라 피쉬 심장 및 혈관 근육 세포의 분리 방법론을 설명합니다. 이 접근법은 제브라피쉬 심실 근세포 분리 5,6에 대해 이전에 보고된 프로토콜의 수정을 포함하고 포유류 VSM 세포 분리8의 방법을 적용하여 구근 동맥(BA)에서 제브라피쉬 혈관 평활근 세포를 분리할 수 있습니다. 이 프로토콜은 최대 8 h9 동안 패치 클램프 연구에 안정적으로 사용할 수있는 제브라 피쉬에서 분리 된 심방, 심실 및 VSM 세포의 효율적인 수율을 제공합니다.
부모 유기체 외부에서 완전히 발달하는 거의 투명한 유충에도 불구하고 심혈관 발달을 연구하는 데있어 약속 된 개체 유전 학적 잠재력을 탐구하는 것은 어린 나이에 조직을 추출하고 분석하는 데 어려움을 겪었습니다. 현재 기사는 적응되고 발표 된 추출 방법10을 사용하여 수정 후 3 일 (dpf)에 분리 된 제브라 피쉬 심장에 대한 패치 클램프 실험을 시연함으로써 이러한 한계를 해결합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 Guage Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119479</td>
			<td>For embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Used for action potential recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Mini Centrifuge</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>MLX-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Strainer Sieve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06336-71</td>
			<td>100 &#956;m sieve for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type H</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #5</td>
			<td>Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981</td>
			<td>For dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Hematocrit Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>41A2502</td>
			<td>Soda lime glass for patch pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td>100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>For adult and juvenile zebrafish decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #SF</td>
			<td>For isolating larval CV tissues (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13687711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate (MS222)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For anaesthetizing zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies

제브라피쉬는 오랫동안 심혈관 연구에서 모델 척추동물 유기체로 사용되어 왔습니다. 제브라 피쉬 심혈관 조직에서 개별 세포를 분리하는 기술적 어려움은 전기 생리 학적 특성을 연구하는 데 제한적이었습니다. 이전의 방법은 제브라 피쉬 심장의 해부와 심실 심장 근육 세포의 분리에 대해 설명되었습니다. 그러나, 전기 생리 학적 특성화를위한 제브라 피쉬 심방 및 혈관 근육 세포의 분리는 상세하지 않았다. 이 연구는 패치 클램프 실험에 적합한 구근 동맥의 혈관 평활근 (VSM) 세포뿐만 아니라 분리 된 청소년 및 성인 제브라 피쉬 심실 및 심방 심근 세포를 일상적으로 제공하는 새롭고 수정 된 효소 프로토콜을 설명합니다. 배아 및 애벌레 발달 단계에서 분리 된 제브라 피쉬 심혈관 조직에 대한 전기 생리 학적 연구에 대한 문헌적 증거는 없습니다. 유충 및 배아 심장의 개별 세포에 대한 패치 클램프 실험을 허용하는 부분 해리 기술이 시연됩니다.

상기 프로토콜은 야생형 및 돌연변이 제브라피쉬 심혈관구조에서 ATP 민감성 칼륨(KATP) 채널에 대한 광범위한 연구에서 최근에 보고된 바와 같이 패치 클램프 연구에 적합한 일관된 품질의 충분한 심장 및 혈관 근세포를 안정적이고 일상적으로 제공합니다9. 단리된 심근세포로부터의 이러한K ATP 채널 활성의 기록의 대표적인 흔적이 도 3A-C<s...

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Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

본 프로토콜은 전기생리학적 연구에 적합한 성체, 청소년, 유충 및 배아 제브라피쉬(Danio rerio)로부터 생존가능한 심장 및 혈관 평활근 세포의 급성 단리를 기술한다.

전기 생리 학적 연구를위한 성체, 청소년, 애벌레 및 배아 제브라 피쉬에서 심장 및 혈관 평활근 세포 분리

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

패치 클램프 전기 생리학을 사용하여 네이티브 이온 채널 특성을 연구하려면 급성으로 분리된 세포에 접근해야 합니다. 이 프로토콜은 다른 연령대의 제브라 피쉬에서 개별 심혈관 근육 세포에 접근하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 강력하고 간단하며 쉽게 재현 할 수 있으며 상대적으로 높은 수확량과 생존력으로 제브라 피쉬의 심혈관 근육 세포를 원래 상태로 분리합니다.시작하려면 물고기를 관류 완충액으로 부분적으로 채워진 큰 페트리 접시에 옮기고 해부 현미경 아래에 놓습니다. 복부 쪽이 해부 범위를 향하도록 지배적이지 않은 손에 물고기를 잡으십시오. 주로 사용하는 손에 가는 집게를 들고 물고기의 가슴 근육과 지느러미를 부드럽게 찢어 심방, 심실 및 동맥 구근을 포함한 심혈관 조직을 드러냅니다.구근 동맥과 복부 대동맥의 교차 끝에서 구근 동맥을 부드럽게 당깁니다. 집게를 꼬집어 대동맥에서 동맥 구근을 조심스럽게 분리하고 심방의 끝을 수렴하는 여러 정맥 가지에 위치시킵니다. 그런 다음 정맥동에서 심방 끝을 뽑아 심혈관 조직을 신체의 나머지 부분과 분리합니다.심근 세포를 해부하려면 심방과 심실을 심혈관 조직에서 뽑아 내십시오. 미세한 집게를 사용하여 심실을 부드럽게 찢어 과도한 혈액을 배출하면 심장 조직이 밝은 빨간색에서 옅은 연어 색으로 변할 때 보장 할 수 있습니다. 분리된 아트리움과 심실을 관류 완충액이 포함된 별도의 1.5밀리리터 원심분리 튜브에 모읍니다.튜브의 관류 버퍼를 750 마이크로 리터의 소화 버퍼로 교체하십시오. 튜브를 섭씨 37도 및 분당 800 회전으로 열 셰이커에 놓습니다. 조직이 반투명해질 때까지 소화를 허용하십시오.벤치 탑 미니 원심 분리기에서 조직을 2, 000 배 G에서 3 내지 5 초 동안 부드럽게 회전시켜 소화를 종료하고 상청액 소화 완충액을 750 마이크로 리터의 정지 완충액으로 교체하십시오. 정지 완충액을 500 내지 750 마이크로리터의 관류 완충액으로 부드럽게 교체하고, 세포를 분산시키기 위해 화염 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 조직을 30회 분쇄한다. 그런 다음 심실을 부드럽게 분쇄하십시오.균일한 샘플링을 위해 세포를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 재현탁시킨 후 해당 연구를 위해 한 방울 떨어뜨립니다. 심혈관 조직에서 성인 동맥 구근을 뽑고 S1 완충액이 들어있는 1.5 밀리리터 원심 분리 튜브에 5 개의 구근 동맥을 풀링합니다. S1을 400 마이크로 리터의 S2 버퍼로 교체하고 섭씨 37도 및 분당 800 회전의 열 셰이커에서 20 분 동안 구근 동맥의 파파인 소화를 허용합니다.부분적으로 소화 된 동맥 구근을 1 분 동안 가라 앉히고 S2 상청액을 콜라게나 제가 함유 된 S3 완충액 500 마이크로 리터로 교체하십시오. 섭씨 37도, 분당 800 회전의 열 셰이커에서 조직을 3-5 분 동안 소화하십시오. 벤치 탑 미니 원심 분리기에서 조직을 2, 000 배 G에서 3-5 초 동안 부드럽게 회전시켜 소화를 끝내고 S3 상청액을 500 마이크로 리터의 S1로 교체하십시오. 펠렛 조직을 부드럽게 분쇄하여 혈관 평활근 세포를 분산시킵니다.분산된 혈관 평활근 세포를 적절한 크기의 유리 커버 슬립에 플레이트화합니다. 셀이 부착될 때까지 커버 슬립을 실온에서 30분 동안 보관하고 다음 6시간 이내에 사용하십시오. 배아를 마취하십시오.그런 다음 배아를 5 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮겨 농축 한 다음 여분의 배지를 제거합니다. 3 밀리리터의 냉 관류 완충액으로 배아를 두 번 씻은 다음 2 밀리리터의 관류 완충액에 다시 현탁시킵니다. 배아 심장 격리 장치를 사용하여 배아 1 밀리리터를 바늘에 넣고 즉시 튜브로 다시 배출하십시오.조각난 배아를 깔때기에 놓인 100 마이크로 미터 세포 여과기 체를 통과시킵니다. 여과 된 하트를 다른 5 밀리리터 원심 분리기 튜브에 모으십시오. 여과액을 잘 혼합하고 1밀리리터 분취량을 1.5밀리리터 원심분리 튜브로 분리합니다.벤치탑 미니원심분리기의 모든 튜브를 5초 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 1 밀리리터의 관류 버퍼를 사용하여 튜브에서 펠릿의 연속 재현탁을 수행하십시오. 해당 연구를 위해 한 방울을 추가하기 전에 심장을 위아래로 부드럽게 두 번 피펫팅합니다. 동맥 구근에서 분리 된 세포의 경우 혈관 평활근 세포를 tagln : EGFP 발현으로 확인했습니다.분리 된 심근 세포에서 ATP에 민감한 칼륨 채널 활성의 기록의 대표적인 흔적이 여기에 표시됩니다. 성공적인 단일 채널 녹음은 배아 심장에서 절제된 패치에서 얻어졌다. 심실 근세포는 안정적인 과분극 막 전위를 나타내었고, 활동 전위는 패치 피펫을 통한 전류 주입을 통해 자극되었습니다.심방 근세포는 자발적인 활동 전위 발화를 나타내었다. 활동 전위 속성은 여기에 요약되어 있습니다. 심근 세포 해리 중에 완충액을 교체하는 동안 소화 조직이 방해받지 않도록주의해야합니다.조직 단편화는 피펫 분쇄에 의해서만 수행되어야합니다. 구근 조직의 콜라겐 소화 과정에서 매분마다 부유, 팽창 및 반투명 조직을 검사하십시오. 조직 단편화가 분명해지면 소화를 중단하십시오.세포가 분리되면 몇 시간 동안 생존 상태를 유지하고 패치 클램프 기술을 사용하여 전기 생리 학적 분석에 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 이것은 우리가 이러한 제브라 피쉬 조직의 ATP에 민감한 칼륨 채널이 포유류의 칼륨 채널과 본질적으로 동일하다는 것을 보여줄 수있었습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

연구

생물학

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

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인간의 탯줄 아티 평활근 세포 절연 (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

성인 및 배아 골격근의 Microexplant 문화 및 골격 근육 줄기 세포의 분리

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

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애벌레의 심장 해부, 소년과 성인 Zebrafish, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

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Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

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