Name: isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies
Uploaded: 2022-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NIH-bidrag HL140024 till CGN och HL150277 till CMC. Figur 1 och figur 2 skapades med BioRender.com.

Alla zebrafiskar (vild stam AB, både hane och hona) föddes, underhålls och hanterades för experimenten enligt riktlinjerna från Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Isolering av atrium, ventrikel och bulbous arteriosus från vuxen, juvenil och larv zebrafisk
<ol><li>Avliva fisk med kallchock, dvs genom att nedsänka i 4 °C vatten, i ~ 10 s.</li>
	<li>Använd böjda pincett och överför fisk till en stor petriskål delvis fylld ...

<ol>
	<li>Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish's+swim+to+fame+as+an+experimental+model+in+biology.">The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).</li><li>Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+for+high-throughput+screens:+The+present+and+future+using+zebrafish.">Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).</li><li>Ke&#223;ler, M., Rottbauer, W., Just, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+use+of+zebrafish+for+novel+cardiac+drug+discovery.">Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).</li><li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+dissection+in+larval,+juvenile+and+adult+zebrafish,+Danio+rerio.">Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).</li><li>Brette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isolated+ventricular+myocytes+from+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).</li><li>Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+primary+cardiomyocytes+from+adult+zebrafish+hearts.">Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts.</a> Nature protocol. 8, 800-809 (2013).</li><li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart?+An+electrophysiological+study.">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+consequences+of+KATP+overactivity+in+Cantu+syndrome.">Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome.</a> JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).</li><li>Singareddy, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-sensitive+potassium+channels+in+zebrafish+cardiac+and+vascular+smooth+muscle.">ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).</li><li>Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+intestinal+smooth+muscle+development+using+a+novel+sm22&#945;-b+promoter.">Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22&#945;-b promoter.</a> Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).</li><li>Yang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+amount+in+situ+hybridization+and+transgene+via+microinjection+in+zebrafish.">Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).</li><li>Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenanthrene+impacts+zebrafish+cardiomyocyte+excitability+by+inhibiting+IKr+and+shortening+action+potential+duration.">Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration.</a> The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).</li><li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li></ol>

Tidigare metoder för att isolera zebrafiskkammarmyocyter5,6, som syftade till att generera myocyter för odling eller elektrofysiologiska studier, gav celler med lägre utbyte och involverade långa steg med flera centrifugeringar som påverkade cellkvaliteten och livskraften negativt. Protokollen som beskrivs här är tillförlitliga, täcker var och en av de signifikanta kardiovaskulära vävnaderna (ventrikel, atria och VSM), och viktigare är ganska praktisk...

Zebrafisk är små teleostfiskar som länge har använts som modell ryggradsdjurorganism1 och har nyligen blivit framträdande som ett livskraftigt ryggradsdjursystem för screening med hög genomströmning av gener och läkemedel 2,3. Fysiologisk analys av zebrafiskvävnader är emellertid inte välutvecklad. I hjärt-kärlsystemet har metoder beskrivits för dissektion av zebrafiskhjärtan4 och isolering av ventrikulära hjärtmyocyter 5,6,7. Det finns få detaljerade beskrivningar av den effektiva isoleringen av förmaksmyocyter och inga rapporter om vaskulära glattmuskelpreparat (VSM) för patch-clamp-studier.
Det aktuella arbetet beskriver metodik för isolering av zebrafiskhjärtade och vaskulära myocyter, livskraftiga för elektrofysiologiska och funktionella studier. Detta tillvägagångssätt inkluderar modifieringar av tidigare rapporterade protokoll för zebrafiskventrikelmyocytisolering5,6 och anpassar metoder från däggdjurs VSM-cellisoleringar8, vilket möjliggör isolering av zebrafiskvaskulära glattmuskelceller från bulbous arteriosus (BA). Protokollen resulterar i effektiva utbyten av isolerade förmaks-, ventrikulära och VSM-celler från zebrafiskar som på ett tillförlitligt sätt kan användas i patch-clamp-studier i upp till 8 h9.
Trots deras nästan transparenta larver som utvecklas helt utanför föräldraorganismen har utforskandet av deras utlovade ontogenetiska potential för att studera kardiovaskulär utveckling begränsats av utmaningar med att extrahera och analysera vävnader i ung ålder. Den aktuella artikeln behandlar denna begränsning genom att demonstrera patch-clamp-experiment på zebrafiskhjärtan isolerade så tidigt som 3 dagar efter befruktning (dpf), med hjälp av en anpassad, publicerad extraktionsmetod10.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 Guage Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119479</td>
			<td>For embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Used for action potential recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Mini Centrifuge</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>MLX-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Strainer Sieve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06336-71</td>
			<td>100 &#956;m sieve for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type H</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #5</td>
			<td>Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981</td>
			<td>For dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Hematocrit Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>41A2502</td>
			<td>Soda lime glass for patch pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td>100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>For adult and juvenile zebrafish decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #SF</td>
			<td>For isolating larval CV tissues (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13687711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate (MS222)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For anaesthetizing zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies

Zebrafisk har länge använts som en modell ryggradsdjur organism i kardiovaskulär forskning. De tekniska svårigheterna att isolera enskilda celler från zebrafiskens kardiovaskulära vävnader har varit begränsande för att studera deras elektrofysiologiska egenskaper. Tidigare metoder har beskrivits för dissektion av zebrafiskhjärtan och isolering av ventrikulära hjärtmyocyter. Isoleringen av zebrafiskförmaks- och vaskulära myocyter för elektrofysiologisk karakterisering var emellertid inte detaljerad. Detta arbete beskriver nya och modifierade enzymatiska protokoll som rutinmässigt tillhandahåller isolerade juvenila och vuxna zebrafiskkammare och förmakskardiomyocyter, liksom vaskulära glattmuskelceller (VSM) från bulbous arteriosus, lämpliga för patch-clamp-experiment. Det har inte funnits några litterära bevis för elektrofysiologiska studier på zebrafiskens kardiovaskulära vävnader isolerade vid embryonala och larvala utvecklingsstadier. Partiella dissociationstekniker som möjliggör patch-clamp-experiment på enskilda celler från larv- och embryonala hjärtan demonstreras.

Ovanstående protokoll tillhandahåller på ett tillförlitligt och rutinmässigt tillräckligt med hjärt- och vaskulära myocyter av konsekvent kvalitet som är mottagliga för patch-clamp-studier som nyligen rapporterats i omfattande studier av ATP-känsliga kaliumkanaler (KATP) i vildtyp och mutant zebrafisk kardiovaskulatur9. Representativa spår av inspelningar av sådan KATP-kanalaktivitet från isolerade kardiomyocyter visas i figur 3A-C<...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Detta protokoll beskriver den akuta isoleringen av livskraftiga hjärt- och vaskulära glattmuskelceller från vuxna, juvenila, larviska och embryonala zebrafiskar (Danio rerio), lämpliga för elektrofysiologiska studier.

Isolering av hjärt- och vaskulära glattmuskelceller från vuxna, juvenila, larviga och embryonala zebrafiskar för elektrofysiologiska studier

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Att studera inbyggda jonkanalegenskaper med hjälp av patchklämma elektrofysiologi kräver tillgång till akut isolerade celler. Detta protokoll beskriver metoder för att komma åt enskilda kardiovaskulära myocyter från zebrafisk i olika åldrar. Detta protokoll är robust, enkelt, lätt reproducerbart och isolerar kardiovaskulära myocyter från zebrafisk i sitt ursprungliga tillstånd med relativt högt utbyte och livskraft.För att börja, överför fisken till en stor petriskål delvis fylld med perfusionsbuffert och placera den under ett dissekerande mikroskop. Håll fisken i den icke-dominerande handen med den ventrala sidan vänd mot dissektionsomfånget. Med de fina tångarna i den dominerande handen, riv försiktigt upp bröstmusklerna och fenorna på fisken för att avslöja kardiovaskulära vävnader inklusive atrium, ventrikel och bulbus arteriosus.Dra försiktigt bulbus arteriosus vid den skärande spetsen av bulbus arteriosus och ventral aorta. Separera försiktigt bulbus arteriosus från aortan genom att klämma tången och placera atriumets spets i de flera venösa grenarna som konvergerar. Plocka sedan spetsen av atriumet från sinus venosus för att isolera hjärt-kärlvävnaderna från resten av kroppen.För att dissekera kardiomyocyter, plocka atriumet och ventrikeln ur hjärt-kärlvävnaden. Gör en mild rivning i ventrikeln med fina pincett för att tömma överskott av blod, vilket kan säkerställas när hjärtvävnaden förvandlas från ljusröd till en blek laxfärg. Slå samman det isolerade atriumet och ventrikeln i ett separat 1,5-milliliter centrifugrör innehållande perfusionsbuffert.Byt ut perfusionsbufferten i rören med 750 mikroliter matsmältningsbuffert. Placera rören på en termoshaker vid 37 grader Celsius och 800 varv per minut. Tillåt matsmältning av vävnaderna tills de blir genomskinliga.Avsluta matsmältningen genom att försiktigt snurra ner vävnaderna i en bänkminicentrifug vid 2 000 gånger G i tre till fem sekunder och ersätt den supernatanta matsmältningsbufferten med 750 mikroliter stoppbuffert. Byt försiktigt ut stoppbufferten med 500 till 750 mikroliter perfusionsbuffert och trituera vävnaderna 30 gånger med en flampolerad Pasteur-pipett för att sprida cellerna. Trituera sedan försiktigt ventriklarna.För enhetlig provtagning, pipettera försiktigt cellerna upp och ner ett par gånger för att återuppliva, innan du lägger till en droppe av dem för motsvarande studier. Plocka den vuxna bulbus arteriosus från hjärt-kärlvävnaderna och slå samman fem bulbus arteriosus i ett 1,5-milliliter centrifugrör som innehåller S1-buffert. Byt ut S1 med 400 mikroliter S2-buffert och tillåt papain digestion av bulbus arteriosus på en termoshaker vid 37 grader Celsius och 800 varv per minut i 20 minuter.Låt den delvis smälta bulbus arteriosus sätta sig ner i en minut och ersätt S2-supernatanten med 500 mikroliter S3-buffert innehållande kollagenas. Smält vävnaderna på en termoshaker vid 37 grader Celsius och 800 varv per minut i tre till fem minuter. Avsluta matsmältningen genom att försiktigt snurra ner vävnaderna i en bänkminicentrifug vid 2 000 gånger G i tre till fem sekunder och ersätt S3-supernatanten med 500 mikroliter S1. Triturate försiktigt de pelleterade vävnaderna för att sprida vaskulära glattmuskelceller.Platta dispergerade vaskulära glattmuskelceller på glasskydd glider av lämplig storlek. Håll locket glidande vid rumstemperatur i 30 minuter så att cellerna kan fästas och använd dem inom de närmaste sex timmarna. Bedöva embryona.Koncentrera sedan embryona genom att överföra dem till ett centrifugrör på fem milliliter och ta sedan bort överflödiga medier. Tvätta embryona med tre milliliter kall perfusionsbuffert två gånger och återupptäck dem sedan i två milliliter perfusionsbuffert. Använd den embryonala hjärtisoleringsapparaten, dra en milliliter av embryona i nålen och utvisa dem omedelbart tillbaka i röret.För de fragmenterade embryona genom en 100-mikrometer cellsilsikt placerad i en tratt. Samla de filtrerade hjärtan i ett annat fem milliliter centrifugrör. Blanda filtratet väl och separera en milliliter alikvoter i 1,5 ml centrifugrör.Centrifugera alla rör på en bänkminicentrifug i fem sekunder och kassera supernatanten. Utför seriell resuspension av pellets i rören med en milliliter perfusionsbuffert. Pipettera försiktigt hjärtan upp och ner två gånger innan du lägger till en droppe för motsvarande studier För celler isolerade från bulbus arteriosus bekräftades de vaskulära glattmuskelcellerna med tagln: EGFP-uttryck.Representativa spår av inspelningar av ATP-känslig kaliumkanalaktivitet från isolerade kardiomyocyter visas här. Framgångsrika enkanalsinspelningar erhölls i fläckar som skärs ut från de embryonala hjärtan. Ventrikulära myocyter uppvisade stabila hyperpolariserade membranpotentialer, och åtgärdspotentialer stimulerades via ströminjektion genom plåsterpipetten.Förmaksmyocyter uppvisade spontan åtgärdspotentialbränning. Åtgärdspotentialegenskaper sammanfattas här. Vid byte av buffertar under kardiomyocytdissociation bör man se till att matsmältningsvävnaderna inte störs.Vävnadsfragmentering bör endast åstadkommas genom pipetttriturering. Under den kollagenösa matsmältningen av bulbusvävnaderna, undersök för flytande, dilaterade och genomskinliga vävnader varje minut. När vävnadsfragmenteringen är uppenbar, upphör med matsmältningen.När cellerna är isolerade kan de hållas vid liv i timmar och användas för elektrofysiologisk analys med hjälp av patchklämtekniker. Detta har till exempel gjort det möjligt för oss att visa att ATP-känsliga kaliumkanaler i dessa zebrafiskvävnader i huvudsak är identiska med dem hos däggdjur.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

RNA Isolering från embryonala Zebrafish och cDNA syntes för Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

Isolering av mänskliga Umbilical arteriella glatta muskelceller (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Adulta och embryonala skelettmuskler Microexplant Kultur och Isolering av skelettet muskelceller Stem

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Hjärta Dissection i Larvernas, unga och vuxna Zebrafish, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Laser-vållad skada av Zebrafish embryonala skelettmuskulatur

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Isolering och odling av individuella Myofibers och deras satellit celler från vuxna skelettmuskulatur

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Analys av embryonala och Larvernas Zebrafish Skelett myofibers från Dissocierade Förberedelser

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Isolering av lungartären glatta muskelceller från neonatala möss

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Isolering av murin Coronary vaskulära glatta muskelceller

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Isolering, karakterisering och differentiering av hjärt stamceller från vuxna mus hjärtat

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...