Name: isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies
Uploaded: 2022-02-09T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Bu çalışma, NIH'nin CGN'ye HL140024 ve CMC'ye HL150277 hibeleri ile desteklenmiştir. Şekil 1 ve Şekil 2, BioRender.com ile oluşturulmuştur.

Tüm zebra balıkları (hem erkek hem de dişi vahşi tip AB suşu), Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (IACUC) yönergelerini izleyerek deneyler için yetiştirildi, muhafaza edildi ve ele alındı.
1. Atriyum, ventrikül ve soğanlı arteriyozusun yetişkin, genç ve larva zebra balıklarından izolasyonu
<ol><li>Balıkları soğuk şok kullanarak, yani ~ 10 s için 4 ° C suya batırarak ötenazileştirin.</li>
	<li>Kavisli forse...

<ol>
	<li>Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish's+swim+to+fame+as+an+experimental+model+in+biology.">The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology.</a> Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).</li><li>Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Technology+for+high-throughput+screens:+The+present+and+future+using+zebrafish.">Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish.</a> Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).</li><li>Ke&#223;ler, M., Rottbauer, W., Just, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+use+of+zebrafish+for+novel+cardiac+drug+discovery.">Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).</li><li>Singleman, C., Holtzman, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+dissection+in+larval,+juvenile+and+adult+zebrafish,+Danio+rerio.">Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio.</a> Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).</li><li>Brette, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+isolated+ventricular+myocytes+from+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).</li><li>Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+culture+of+primary+cardiomyocytes+from+adult+zebrafish+hearts.">Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts.</a> Nature protocol. 8, 800-809 (2013).</li><li>Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+heart+as+a+model+for+human+heart?+An+electrophysiological+study.">Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).</li><li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+consequences+of+KATP+overactivity+in+Cantu+syndrome.">Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome.</a> JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).</li><li>Singareddy, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-sensitive+potassium+channels+in+zebrafish+cardiac+and+vascular+smooth+muscle.">ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. , (2021).</li><li>Burns, C. G., MacRae, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+hearts+from+zebrafish+embryos.">Purification of hearts from zebrafish embryos.</a> BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).</li><li>Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+zebrafish+intestinal+smooth+muscle+development+using+a+novel+sm22&#945;-b+promoter.">Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22&#945;-b promoter.</a> Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).</li><li>Yang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+amount+in+situ+hybridization+and+transgene+via+microinjection+in+zebrafish.">Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish.</a> Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).</li><li>Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenanthrene+impacts+zebrafish+cardiomyocyte+excitability+by+inhibiting+IKr+and+shortening+action+potential+duration.">Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration.</a> The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).</li><li>Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blebbistatin+effectively+uncouples+the+excitation-contraction+process+in+zebrafish+embryonic+heart.">Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).</li></ol>

Zebra balığı ventrikülermiyositleri izole etmek için önceki yöntemler, kültür veya elektrofizyolojik çalışmalar için miyositler üretmeyi amaçlayan, daha düşük verime sahip hücreler sağladı ve hücre kalitesini ve canlılığını olumsuz yönde etkileyen çoklu santrifüjlemelerin uzun adımlarını içeriyordu. Burada açıklanan protokoller güvenilirdir, önemli kardiyovasküler dokuların (ventrikül, atriyum ve VSM) her birini kapsar ve ...

Zebra balığı, uzun zamandır model omurgalı organizma1 olarak kullanılan ve son zamanlarda genlerin ve ilaçların yüksek verimli taranması için uygulanabilir bir omurgalı sistemi olarak öne çıkan küçük teleost balıklarıdır 2,3. Bununla birlikte, zebra balığı dokularının fizyolojik analizi iyi gelişmemiştir. Kardiyovasküler sistemde, zebra balığı kalplerinin diseksiyonu4 ve ventriküler kardiyak miyositlerin izolasyonu 5,6,7 için yöntemler tanımlanmıştır. Atriyal miyositlerin etkili izolasyonunun birkaç ayrıntılı açıklaması vardır ve yama-kelepçe çalışmaları için vasküler düz kas (VSM) preparatları bildirilmemiştir.
Mevcut çalışma, elektrofizyolojik ve fonksiyonel çalışmalar için uygun olan zebra balığı kardiyak ve vasküler miyositlerinin izolasyonu için metodolojiyi açıklamaktadır. Bu yaklaşım, zebra balığı ventriküler miyosit izolasyonu 5,6 için daha önce bildirilen protokollerin modifikasyonlarını içerir ve zebra balığı vasküler düz kas hücrelerinin soğanlı arteriyozustan (BA) izole edilmesine izin veren memeli VSM hücre izolasyonlarından8 yöntemleri uyarlar. Protokoller, zebra balığından izole atriyal, ventriküler ve VSM hücrelerinin verimli bir şekilde elde edilmesini sağlar ve bu da yama kelepçesi çalışmalarında 8 saate kadar9 saate kadar güvenilir bir şekilde kullanılabilir.
Tamamen ebeveyn organizmanın dışında gelişen neredeyse şeffaf larvalarına rağmen, kardiyovasküler gelişimi incelemede vaat edilen ontogenetik potansiyellerini keşfetmek, genç yaşta dokuların çıkarılması ve analiz edilmesindeki zorluklarla sınırlandırılmıştır. Mevcut makale, uyarlanmış, yayınlanmış bir ekstraksiyon yöntemi10 kullanarak, döllenmeden 3 gün sonra (dpf) izole edilen zebra balığı kalpleri üzerinde yama kelepçesi deneylerini göstererek bu sınırlamayı ele almaktadır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-459</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>19 Guage Needle</td>
			<td>BD</td>
			<td>305187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione Monoxime (BDM)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Centrifuge Tubes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EP0030119479</td>
			<td>For embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td></td>
			<td>Used for action potential recordings</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Mini Centrifuge</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>MLX-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blebbistatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>203390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell-Strainer Sieve</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>EW-06336-71</td>
			<td>100 &#956;m sieve for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type H</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C8051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type II</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase Type IV</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS004188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved Forceps</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>16-100-110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>324626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #5</td>
			<td>Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I2643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5981</td>
			<td>For dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Hematocrit Capillary Tubes</td>
			<td>Kimble Chase</td>
			<td>41A2502</td>
			<td>Soda lime glass for patch pipettes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington</td>
			<td>LS003118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur Pipettes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-6A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5606</td>
			<td>100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>806552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>For adult and juvenile zebrafish decapitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super Fine Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>Style #SF</td>
			<td>For isolating larval CV tissues (Need two)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermoshaker</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>13687711</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine Methanesulfonate (MS222)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For anaesthetizing zebrafish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T6522</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cardiac and vascular smooth muscle cells from adult, juvenile, larval and embryonic zebrafish for electrophysiological studies

Zebra balığı uzun zamandır kardiyovasküler araştırmalarda model bir omurgalı organizma olarak kullanılmaktadır. Zebra balığı kardiyovasküler dokularından bireysel hücreleri izole etmenin teknik zorlukları, elektrofizyolojik özelliklerinin incelenmesinde sınırlayıcı olmuştur. Zebra balığı kalplerinin diseksiyonu ve ventriküler kardiyak miyositlerin izolasyonu için önceki yöntemler tanımlanmıştır. Bununla birlikte, zebra balığı atriyal ve vasküler miyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyon için izolasyonu ayrıntılı olarak belirtilmemiştir. Bu çalışma, rutin olarak izole edilmiş genç ve yetişkin zebra balığı ventriküler ve atriyal kardiyomiyositlerin yanı sıra soğanlı arteriyozustan vasküler düz kas (VSM) hücreleri sağlayan, yama-kelepçe deneyleri için uygun olan yeni ve modifiye enzimatik protokolleri açıklamaktadır. Gelişimin embriyonik ve larva aşamalarında izole edilen zebra balığı kardiyovasküler dokuları üzerinde elektrofizyolojik çalışmalara dair edebi bir kanıt yoktur. Larva ve embriyonik kalplerden bireysel hücreler üzerinde yama-kelepçe deneylerine izin veren kısmi ayrışma teknikleri gösterilmiştir.

Yukarıdaki protokoller, vahşi tip ve mutant zebra balığı kardiyovaskülatür9'da ATP'ye duyarlı potasyum (KATP) kanallarının kapsamlı çalışmalarında yakın zamanda bildirildiği gibi, yama-kelepçe çalışmaları için uygun tutarlı kalitede yeterli kardiyak ve vasküler miyositleri güvenilir ve rutin olarak sağlar. İzole kardiyomiyositlerden bu tür KATP kanal aktivitesinin kayıtlarının temsili izleri Şekil 3A-C'de<...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies at JoVE.com

Isolation of Cardiac and Vascular Smooth Muscle Cells from Adult, Juvenile, Larval and Embryonic Zebrafish for Electrophysiological Studies

Bu protokol, elektrofizyolojik çalışmalar için uygun, yetişkin, genç, larval ve embriyonik zebra balıklarından (Danio rerio) canlı kardiyak ve vasküler düz kas hücrelerinin akut izolasyonunu tanımlamaktadır.

Kardiyak ve Vasküler Düz Kas Hücrelerinin Elektrofizyolojik Çalışmalar İçin Yetişkin, Genç, Larva ve Embriyonik Zebra Balıklarından İzolasyonu

Zebrafish have long been used as a model vertebrate organism in cardiovascular research. The technical difficulties of isolating individual cells from the ...

Yama kelepçesi elektrofizyolojisini kullanarak doğal iyon kanalı özelliklerini incelemek, akut olarak izole edilmiş hücrelere erişim gerektirir. Bu protokol, farklı yaşlarda zebra balıklarından bireysel kardiyovasküler miyositlere erişme yöntemlerini açıklar. Bu protokol sağlam, basit, kolayca tekrarlanabilir ve kardiyovasküler miyositleri zebra balıklarından doğal hallerinde nispeten yüksek verim ve canlılık ile izole eder.Başlamak için, balıkları kısmen perfüzyon tamponu ile doldurulmuş büyük bir Petri kabına aktarın ve diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Balıkları, ventral tarafı diseksiyon kapsamına bakacak şekilde baskın olmayan elinizde tutun. Baskın eldeki ince forsepslerle, atriyum, ventrikül ve bulbus arteriyozus dahil olmak üzere kardiyovasküler dokuları ortaya çıkarmak için balığın pektoral kaslarını ve yüzgeçlerini yavaşça yırtın.Bulbus arteriyozusu bulbus arteriyozus ve ventral aortun kesişen ucundan yavaşça çekin. Forsepsleri sıkıştırarak bulbus arteriyozusu aorttan dikkatlice ayırın, atriyumun ucunu yakınsayan çoklu venöz dallara yerleştirin. Daha sonra, kardiyovasküler dokuları vücudun geri kalanından izole etmek için atriyumun ucunu sinüs venozusundan ayırın.Kardiyomiyositleri diseke etmek için, atriyumu ve ventrikülü kardiyovasküler dokudan çıkarın. Fazla kanı boşaltmak için ince forseps kullanarak ventriküle nazik bir yırtılma yapın, bu da kalp dokusu parlak kırmızıdan soluk somon rengine dönüştüğünde sağlanabilir. İzole edilmiş atriyum ve ventrikülü perfüzyon tamponu içeren ayrı bir 1.5 mililitrelik santrifüj tüpünde havuzlayın.Tüplerdeki perfüzyon tamponunu 750 mikrolitre sindirim tamponu ile değiştirin. Tüpleri bir termoshaker üzerine 37 santigrat derece ve dakikada 800 devirde yerleştirin. Yarı saydam hale gelene kadar dokuların sindirimine izin verin.Dokuları tezgah üstü bir mini santrifüjde üç ila beş saniye boyunca 2.000 kez G'de yavaşça döndürerek sindirimi sonlandırın ve süpernatant sindirim tamponunu 750 mikrolitre durdurma tamponu ile değiştirin. Durdurma tamponunu nazikçe 500 ila 750 mikrolitre perfüzyon tamponu ile değiştirin ve hücreleri dağıtmak için alevle parlatılmış bir Pasteur pipet kullanarak dokuları 30 kez tritüre edin. Ardından, ventrikülleri yavaşça tritüre edin.Düzgün örnekleme için, karşılık gelen çalışmalar için bir damla eklemeden önce, hücreleri yeniden askıya almak için birkaç kez yukarı ve aşağı doğru hafifçe pipetleyin. Yetişkin bulbus arteriyozusunu kardiyovasküler dokulardan kesin ve beş bulbus arteriyozusu S1 tamponu içeren 1.5 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. S1'i 400 mikrolitre S2 tamponu ile değiştirin ve bulbus arteriyozusun bir termoshaker üzerinde 37 santigrat derecede ve 20 dakika boyunca dakikada 800 devirde papain sindirimine izin verin.Kısmen sindirilmiş bulbus arteriyozusun bir dakika boyunca yerleşmesine izin verin ve S2 süpernatantını kollajenaz içeren 500 mikrolitre S3 tamponu ile değiştirin. Dokuları bir termoshaker üzerinde 37 santigrat derecede ve üç ila beş dakika boyunca dakikada 800 devirde sindirin. Dokuları tezgah üstü bir minisantrifüjde üç ila beş saniye boyunca 2.000 kez G'de yavaşça döndürerek sindirimi sonlandırın ve S3 süpernatantını 500 mikrolitre S1 ile değiştirin. Vasküler düz kas hücrelerini dağıtmak için peletlenmiş dokuları nazikçe tritüre edin.Plaka dağılmış vasküler düz kas hücreleri cam kapak üzerine uygun büyüklükte kaymalar. Hücrelerin takılması için kapak fişlerini oda sıcaklığında 30 dakika tutun ve sonraki altı saat içinde kullanın. Embriyoları anestezi altına alır.Daha sonra, embriyoları beş mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktararak konsantre edin, ardından fazla ortamı çıkarın. Embriyoları üç mililitre soğuk perfüzyon tamponu ile iki kez yıkayın, ardından iki mililitre perfüzyon tamponunda tekrar askıya alın. Embriyonik kalp izolasyon aparatını kullanarak, embriyoların bir mililitresini iğneye çekin ve hemen tüpe geri atın.Parçalanmış embriyoları bir huni içine yerleştirilmiş 100 mikrometrelik bir hücre süzgeci eleğinden geçirin. Filtrelenmiş kalpleri başka bir beş mililitrelik santrifüj tüpünde toplayın. Filtrat iyice karıştırın ve bir mililitrelik alikotları 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine ayırın.Tüm tüpleri tezgah üstü bir mini santrifüjde beş saniye boyunca santrifüj yapın ve süpernatanı atın. Bir mililitre perfüzyon tamponu kullanarak tüplerdeki peletlerin seri olarak yeniden süspansiyonunu gerçekleştirin. İlgili çalışmalar için bir damla eklemeden önce kalpleri iki kez yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyin Bulbus arteriyozustan izole edilen hücreler için, vasküler düz kas hücreleri tagln: EGFP ekspresyonu ile doğrulandı.İzole kardiyomiyositlerden ATP'ye duyarlı potasyum kanal aktivitesinin kayıtlarının temsili izleri burada gösterilmiştir. Embriyonik kalplerden eksize edilen yamalarda başarılı tek kanallı kayıtlar elde edildi. Ventriküler miyositler stabil hiperpolarize membran potansiyelleri sergiledi ve aksiyon potansiyelleri yama pipeti yoluyla akım enjeksiyonu yoluyla uyarıldı.Atriyal miyositler spontan aksiyon potansiyeli ateşlemesi sergiledi. Eylem potansiyeli özellikleri burada özetlenmiştir. Kardiyomiyosit ayrışması sırasında tamponlar değiştirilirken, sindirim dokularının bozulmamasına dikkat edilmelidir.Doku parçalanması sadece pipet tritürasyonu ile yapılmalıdır. Bulbus dokularının kollajenöz sindirimi sırasında, her dakika yüzen, genişlemiş ve yarı saydam dokuları inceleyin. Doku parçalanması belirgin olduğunda, sindirimi durdurun.Hücreler izole edildikten sonra, saatlerce canlı tutulabilir ve yama kelepçesi teknikleri kullanılarak elektrofizyolojik analiz için kullanılabilir. Bu, örneğin, bu zebra balığı dokularındaki ATP'ye duyarlı potasyum kanallarının esasen memelilerdekilerle aynı olduğunu göstermemize izin verdi.

Research

JoVE Journal

Biology

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Gen İfadesi Analizi Embriyonik Zebra balığı ve cDNA Sentezi RNA İzolasyon

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

İnsan Umblikal Arter düz kas hücrelerinin izolasyonu (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Adult and Embryonic Skeletal Muscle Microexplant Culture and Isolation of Skeletal Muscle Stem Cells

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Cultured embryonic and adult skeletal muscle cells have a number of different uses. The micro-dissected explants technique described in this chapter is a ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Larvaların Kalp Diseksiyon, Çocuk ve Yetişkin Zebra balığı, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Zebra balığı Embriyonik İskelet Kası Lazer-yaralama

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Yetişkin İskelet Kası gelen bireysel Myofibers ve Uydu Hücre İzolasyonu ve Kültür

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

Disosiye Müstahzarlar gelen Embriyonik ve larval Zebra balığı İskelet myofibers Analizi

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter Düz Kas Hücre İzolasyonu

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Yalıtım, karakterizasyonu ve yetişkin fare kalp kalp kök hücre farklılaşma

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...