Name: analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
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该研究得到了AMED的部分支持，资助号为21gm0810011h0005（N.I.和Y.S.），JSPS KAKENHI（JP19H03223，N.I.）和JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists（JP19K16258，T.M.），大阪不治之症医学研究基金会（T.M.）和NAIST下一代跨学科研究项目（Y.S.）。

作者没有什么可透露的。

本研究中描述的协议使用所有实验室，研究所和大学中常见的商业可用材料和显微镜设备。因此，研究人员可以在他们的研究中轻松采用目前的单斑点成像和牵引力显微镜。
斑点成像可以分析肌动蛋白聚合和离合器耦合。此外，斑点成像可以监测离合器分子（如shootin1和cortactin）的逆行流动，它们与F-肌动蛋白逆行流动相互作用。通过使用TIRF显微镜，还可以监测细胞粘附分子L1-CAM的逆行流动23，41;L1-CAM的抓地力和滑动行为反映了离合器耦合效率23，41。虽然本研究采用TMR-HaloTag系统进行斑点成像，但其他荧光蛋白，如EGFP和单体红色荧光蛋白，也可以在分析中使用16，18，20，23，24，27，39。可视化肌动蛋白斑点的基本要素是荧光肌动蛋白的低表达水平和最小面积的照明（图2）。在该协议中，Lifeact和HaloTag-actin信号依次获得。由于肌动蛋白逆行流相对较慢（4.5 ± 0.1 μm/min）24，因此F-肌动蛋白逆行流和肌动蛋白聚合的分析不受不同荧光通道（~1 s间隔）的顺序图像采集的影响。Lifeact是一种广泛使用的F-肌动蛋白标志物，但可以与肌动蛋白结合蛋白竞争47。更重要的是，Lifeact可以改变肌动蛋白动力学，从而影响F-肌动蛋白结构和细胞形态47，48，49。
牵引力显微镜可以检测驱动生长锥前进的力。通过将神经元安装在细胞外基质中，研究人员还可以分析半3D环境中产生的力11。高倍率成像对于牵引力的准确量化非常重要，因为生长锥会产生微弱的牵引力7。虽然其他具有纳米柱或应力敏感生物传感器的方法也用于测量牵引力50，51，但基于PAA凝胶的方法具有高度的适应性，并且允许通过改变丙烯酰胺和双丙烯酰胺的浓度来调整底物刚度41，44，52。在该协议中，PAA凝胶以终浓度为3.75%丙烯酰胺和0.03%双丙烯酰胺制备;杨氏模量约为270 Pa22 ，该刚度在脑组织（100-10，000 Pa）53，54，55的范围内。由于PAA凝胶的厚度（~100μm），这种方法限制了显微镜下高倍率透镜的使用。为了获得高倍率图像，研究人员应在激光扫描共聚焦显微镜中使用变焦功能。
总之，目前的斑点成像和牵引力显微镜能够对力生成中的关键事件进行定量分析。这些信息对于提高对生长锥推进和导航基础机制的理解将是无价的。

在发育中的脊椎动物大脑中，神经元经历精心组织的迁移，并将轴突投射到适当的突触伙伴，以建立功能性神经元网络1，2，3。生长锥体是位于神经突尖端的感觉和运动结构，决定了神经元迁移和轴突生长的速度和方向3，4，5。由于神经元被紧密堆积的环境所包围，生长锥体必须对其环境施加力才能向前移动6，7。为了理解神经元迁移和轴突引导背后的机制，分析生长锥体推进的分子力学是必不可少的。
几十年的分析表明，驱动生长锥体前进的牵引力是由"离合器"机构产生的;这种机制被认为不仅在轴突生长锥中起作用，而且在迁移神经元的引导过程生长锥中起作用8，9，10，11，12。也就是说，生长锥中的肌动蛋白细丝（F-肌动蛋白）在前缘聚合并在近端解聚，推出前缘膜13，14，15。由此产生的力与肌动蛋白收缩相结合，诱导称为逆行流的F-肌动蛋白的向后运动7，11，16，17，18，19，20，21。离合器和细胞粘附分子介导F-肌动蛋白逆行流与粘合基底之间的机械耦合，并将F-肌动蛋白流动的力传递到底物上，从而产生生长锥前进的牵引力7，8，9，11，12，22.同时，肌动蛋白-底物偶联降低了F-肌动蛋白流速，并将肌动蛋白聚合转化为突出前缘膜的力9，10。
轴突生长锥感知局部化学线索，并将其转化为生长锥导航的方向驱动力3，23，24，25。例如，轴突引导分子netrin-1刺激其在结直肠癌（DCC）中缺失的受体，并激活三磷酸鸟苷（GTP）结合蛋白细胞分裂控制蛋白42（Cdc42）和Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1（Rac1），以及它们的下游激酶p21激活的激酶1（Pak1）26。Cdc42和Rac1促进1）肌动蛋白聚合，Pak1磷酸化离合器分子shotin122，26。Shootin1通过肌动蛋白结合蛋白cortactin27与F-肌动蛋白逆行流动相互作用。Shootin1还与L1细胞粘附分子（L1-CAM）20，24相互作用。Shootin1磷酸化增加了皮质蛋白和L1-CAM的结合亲和力，并增强了shootin1介导的2）离合器耦合24，27。在生长锥内，肌动蛋白聚合和离合器耦合的不对称活化增加了3）netrin-1源侧面的牵引力，从而为生长锥体转动产生定向驱动力（图1）24。过去几十年来，关于神经元迁移和轴突引导的深入研究增强了对引导分子，其受体以及相关的下游信号级联的理解2，10，28，29，30。然而，产生生长锥推进力的分子机制才刚刚开始被阐明;这可能归因于用于机械生物学分析的协议的有限使用。
本研究描述了通过单点斑点成像监测F-肌动蛋白逆行流动的详细方案16，18。使用超分辨率显微镜、旋转盘共聚焦显微镜和全干涉反射荧光 （TIRF） 显微镜广泛监测 F-肌动蛋白逆行流25、31、32、33、34、35、36、37、38.然而，本研究中的方案使用标准的落射荧光显微镜，因此易于采用11，16，18，20，22，23，24，27，39，40，41，42。当与Lifeact43的F-肌动蛋白标记结合使用时，单点斑点成像可以量化蜀动蛋白聚合速率和F-肌动蛋白逆行流与粘合剂基材之间的离合器耦合效率39，42。本研究进一步描述了使用荧光珠包埋聚丙烯酰胺（PAA）凝胶11，22，23，24，27，39，41，42，44的牵引力显微镜的详细方案。该方法通过监测力引起的磁珠运动来检测和量化生长锥下的牵引力44，45。本文提供了一种开源的牵引力分析代码，并详细解释了在生长锥迁移过程中量化牵引力的方法。借助单点成像和牵引力显微镜，将促进了解生长锥迁移和导航背后的分子力学。这些技术也适用于分析树突状脊柱肿大背后的分子力学，已知树突状脊柱肿大在学习和记忆中很重要42。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% trypan blue stain solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00809-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albmine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421787-9970-799</td>
			<td>Objective lens (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (diameter 18 mm)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C018001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16806-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open source software package</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>carboxylate-modified microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (14 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1130H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (27 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882-10X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBO103 W/2</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300382128</td>
			<td>Mercury lamp (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution from mouse EHS tumor</td>
			<td>Wako</td>
			<td>120-05751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16919-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Conforcal laser microscope (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB2018a</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse C57BL/6</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse neuron nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>22402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>AAD-1001</td>
			<td>Electroporation apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td>CMOS camera (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26036-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parallel Computing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>1528177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFN21A-HaloTag-actin</td>
			<td>(Minegishi et al., 2018)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420790-9901-000</td>
			<td>Objective lens (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td>
			<td>(Kastian et al., 2021)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slulfo-SAMPHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08933-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrate (NaOH)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>Sako tekkou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2009</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (single speckle imaging)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance

为了建立功能网络，神经元必须迁移到适当的目的地，然后将轴突延伸到它们的靶细胞。这些过程取决于位于神经突起尖端的生长锥的进展。轴突生长锥通过感知其局部微环境并调节细胞骨架动力学和肌动蛋白粘附耦合（离合器耦合）来产生驱动力。数十年的研究已经导致鉴定出引导分子，其受体和下游信号级联，用于调节神经元迁移和轴突引导;然而，产生力以驱动生长锥体前进和导航所需的分子机制才刚刚开始被阐明。在神经元生长锥的前缘，肌动蛋白丝经历逆行流动，其由肌动蛋白聚合和肌动蛋白收缩提供动力。F-肌动蛋白逆行流和粘合基材之间的离合器耦合产生牵引力，用于生长锥体的推进。本研究描述了通过单点斑点成像监测F-肌动蛋白逆行血流的详细方案。重要的是，当与F-肌动蛋白标记物Lifeact结合使用时，该技术可以量化1）F-肌动蛋白聚合速率和2）F-肌动蛋白逆行流和粘合剂基材之间的离合器耦合效率。两者都是产生生长锥前进和导航力的关键变量。此外，本研究描述了牵引力显微镜的详细方案，其可以量化3）生长锥产生的牵引力。因此，通过耦合单斑点成像和牵引力显微镜的分析，研究人员可以监测生长锥前进和导航背后的分子力学。

单点斑点成像可量化肌动蛋白聚合速率和离合器耦合效率 高生命力表达允许在生长锥内可视化F-肌动蛋白;低卤代肌动蛋白表达允许监测F-肌动蛋白逆行流（图3， 补充文件2）。追踪肌动蛋白斑点可以测量F-肌动蛋白流速（图3C，D）。由于F-肌动蛋白逆行流和粘合剂基材的机械耦合降低了F-肌动蛋白流速，因此可以从速度估计离合器耦合效率。此外，使用Lifeact标记F-肌动蛋白有助于F-肌动蛋白延伸的可视化，并且有助于量化肌动蛋白聚合速率（图3E，F）。
牵引力的定量分析 严格遵守这里介绍的方法将揭示荧光珠在生长锥下的运动（图6C， 补充文件4）。F-肌动蛋白逆行流向底物产生牵引力，导致荧光珠在生长锥下向后移动。牵引力分析代码估计荧光珠位移的牵引力，并将计算出的牵引力表示为力矢量。牵引力的方向和大小由力矢量的x和y分量确定（图8C，D）。 图8D 中的红色框表示力矢量的x和y分量; 图8C 描绘了相应的生长锥。就x-y坐标而言，矢量指向相对于x轴的-93.8°;该方向朝向生长锥的后部（图8C）。牵引力 F 的大小计算如下：
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg">
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg"> 图1：用于力生成和生长锥导航的生长锥机械。 netrin-1化学引诱剂梯度诱导其受体DCC在轴突生长锥体上的不对称刺激。这激活了Rac1和Cdc42，以及它们的下游激酶Pak1。Rac1 和 Cdc42 促进 （1） 肌动蛋白聚合，而 Pak1 磷酸化 shootin1，增强 shootin1 介导的 （2） 离合器耦合。肌动蛋白动力学的不对称激活和生长锥内的离合器耦合增加了（3）netrin-1源侧面的牵引力，从而产生生长锥吸引的方向驱动力。这里介绍的协议允许量化生长锥导航的关键变量（1）-（3）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg"> 图2：在完全打开和变窄的隔膜下神经元生长锥的荧光图像。生长锥体表达Lifeact和HaloTag-actin。 （A）高生命力表达允许可视化生长锥形形态。另一方面，HaloTag-actin表达水平非常低，当隔膜完全打开时，信号会变暗。（B）当隔膜适当变窄时，背景信号减弱，生长锥中出现单个肌动蛋白斑点。比例尺：5 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">。请单击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg"> 图3：使用图像处理和分析软件斐济量化F-肌动蛋白流速和肌动蛋白聚合速率的步骤。（1）查找并选择在F-肌动蛋白束中流动的肌动蛋白斑点（箭头）。（2）选择 图像 > 变换 > 旋转。（3）设置角度，使F-肌动蛋白束向上定向。（4）图像的角度将被改变。（B）划分区域，包括肌动蛋白斑点和F-肌动蛋白束。（1）单击工具栏上的矩形。（2） 在图像上描绘一个区域。图像的亮度和对比度增加，以允许清晰地可视化肌动蛋白斑点和F-肌动蛋白束的尖端。（3）选择 图像 > 复制。（4）输入显示F-肌动蛋白束中肌动蛋白斑点流动的五个时间范围。（5） 选定的堆栈图像将出现在屏幕上。（C）肌动蛋白斑点上的叠加圆圈。（1）单击工具栏上的椭圆形。（2）在肌动蛋白斑点上画一个圆圈。（3）选择 图像>叠加 > 添加选择。（4） 圆圈被覆盖。5）重复将圆圈叠加在剩余的肌动蛋白斑点上。（D）测量五个时间范围内肌动蛋白斑点的易位距离。（1）单击工具栏上的"直线"。（2）画一条连接圆心的线。（3） 选择分析>度量。结果，由参数高度（红色框）表示，中继肌动蛋白斑点易位距离。（E）测量F-肌动蛋白突起长度在五个时间范围内的变化。（1）画一条连接F-肌动蛋白突起尖端的线。（2） 选择分析>度量。结果（红色框）高度表示F-肌动蛋白束的延伸长度。（F）肌动蛋白聚合速率是根据F-肌动蛋白流速和延伸速率之和计算得出的。另请参见补充文件 2。补充文件3帮助调查人员实践上述方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg"> 图4：PAA凝胶制备步骤。 有关详细说明，请参阅步骤 7.1。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg"> 图5：PAA凝胶刚度的测定。（A）一种微球压痕法。当微球被放置在荧光珠包埋的PAA凝胶上时，微球的重量会导致凝胶中的压痕。压痕深度是通过从微球（B，C）微球底部减去PAA凝胶表面的z位置来计算的，PAA凝胶被微球缩进并含有荧光珠的荧光图像。使用激光扫描共聚焦显微镜捕获凝胶表面（B）和微球底部（C）的图像。来自荧光珠的信号在凝胶表面的缩进区域（B，圆形）中不可见。然而，它们可以在微球的底部观察到。比例尺：50 μm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">。请单击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg"> 图6：神经元生长锥的力映射。 （A-C）嵌入PAA凝胶中的珠子的荧光图像和用EGFP可视化的神经生长锥。在采集延时图像（A）后，通过应用SDS溶液将神经元从凝胶底物中释放出来，并捕获未训练底物中珠子的图像（B）。（C）未受约束基材中的珠子的图像显示珠子处于其原始（绿色）和位移（红色）位置。生长锥体的EGFP信号以蓝色显示。运动记录仪（右）显示了珠子在147秒的持续时间内以3秒的间隔运动，由盒装区域1和2中的箭头表示。区域2中的珠子是参考珠。比例尺：（A）、（B）和（C，左）为2 μm，（C，中间）为1 μm。另请参见补充文件 4。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg"> 图 7：使用 Fiji 校正未训练基板中磁珠图像 x-y 位置的步骤。（A） 将未训练基板中的磁珠图像与荧光磁珠的延时堆栈图像连接起来。（1） 选择 图像>堆栈 > 工具 > 连接。（2）分别选择未受约束基板中的微珠图像和Image1和Image2中荧光微球的延时堆叠图像。单击"确定"。（3）将未受约束基板中的珠状图像添加到延时堆叠图像中。（B）校正荧光珠图像的x-y位置。（1）使用滚动条（红色框）选择图像堆栈中的第二帧（红色箭头）。（2） 选择插件> StackReg。（3）选择 刚体 从下拉列表（红色框）中，然后单击 OK。将开始更正 x-y 位置。（C） 保存 x-y 位置校正的珠子图像。选择 x-y 位置校正堆栈图像的第一帧后，（1） 选择"图像>复制"。（2） 在"范围"中输入 1，然后取消选择"重复堆栈"。然后单击"确定"。（3）未受约束基材中的x-y位置校正珠子图像将出现在屏幕上。将此图像另存为 tiff 文件。补充文件6帮助调查人员实践上述方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg"> 图 8：使用开源牵引力分析代码分析神经元生长锥下的牵引力。GUI上选择的延时图像可以从下拉列表中确认，并指示滑块（红色框）。（B） 选择包含生长锥的区域。（1） 单击 GUI 上的 ROI。使用鼠标光标，在单元格图像上指定两个点（箭头）。（2）单元格图像上将出现一个红色框。单击两下即可确定两个角的位置。（C）选择生长锥下检测到的珠子（白点）。（1） 在 GUI 上，单击"选择珠子"，然后单击以划分包含生长锥的多边形区域。按回车键。（2） 多边形区域内的白点将变为红色。（四）牵引力方向和幅度的计算结果。电子表格中的红色框表示力矢量的 x 和 y 分量，通过牵引力分析进行估计。在右侧面板中的x-y坐标上，生长锥产生的力矢量指向相对于x轴的-93.8°;该方向朝向（C）中生长锥体的后部。补充文件6帮助调查人员实践上述方法。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
补充文件1：本研究中使用的溶液和培养基的配方。 有关详细用法，请参阅文本。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%201-63227R1.xlsx" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件2：Lifeact的荧光成像和神经生长锥中HaloTag-actin的荧光斑点成像。 Lifeact（绿色）和HaloTag-actin（洋红色）。每3秒采集一次图像，总持续时间为147秒。比例尺：2 μm。另请参阅图 3。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%202.mp4" target="_blank">请单击此处下载此文件。</a>
补充文件3：量化F-肌动蛋白流速和肌动蛋白聚合速率的实践数据。 Lifeact（绿色）和HaloTag-actin（洋红色）的多通道延时堆栈图像。另请参见 图 3。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental%20file%203.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件4：检测神经元生长锥处牵引力的力映射视频。 珠子的原始（绿色）和移位（红色）位置。生长锥中的EGFP信号以蓝色显示。每3秒采集一次图像，持续147秒。比例尺：2 μm。另请参见 图 6。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%204.mp4" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件5：牵引力分析代码。 有关详细用法，请参阅步骤 8.12。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%205.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>
补充文件6：量化牵引力的实践数据。 未受训练的底物中微珠的单通道RGB图像和生长锥，EGFP和明场下荧光珠的单通道延时堆叠RGB图像。另请参见 图 7 和 图 8。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%206.zip" target="_blank">请点击此处下载此文件。</a>

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Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video (Video) | JoVE

为了进步，生长锥体必须对外部环境施加牵引力。牵引力的产生取决于肌动蛋白动力学和离合器联轴器。本研究描述了分析肌动蛋白动力学，离合器耦合和生长锥推进牵引力的方法。

肌动蛋白动力学、离合器耦合和牵引力分析，促进生长锥体前进

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

单斑点成像和牵引力显微镜的耦合分析可以分析生长锥前进和导航的分子机械。由于这些技术使用市售材料和标准显微镜。研究人员可以从字面上适应他们研究中的技术。首先在体外用培养基中以1至2000的稀释度用四甲基罗丹明或TMR配体处理神经元3。然后将神经元保持在37摄氏度，其中5%二氧化碳一小时。孵育后，用预热的PBS洗涤TMR配体三次。在将0.5毫升温热的Leibovitz的L-15培养基加入神经元之前，先取出PBS。将神经元保持在37摄氏度一小时。接下来，打开落射荧光显微镜，将状态顶部培养箱设置为37摄氏度。然后将TMR配体处理的神经元放在加热的舞台顶部培养箱上的玻璃底皿中。将图像采集参数（例如 Lifeact 和 HaloTag-actin 荧光通道的曝光时间设置为 500 毫秒），以及以 3 秒的时间间隔（50 帧）将像素 0.065 微米 x 0.065 微米的分档设置为 50 帧。在选择强烈表达Lifeact并每周表达HaloTag-actin的生长锥体后。关闭隔膜上的磁场以照亮包括生长锥在内的最小区域，并获取延时图像。在体外3的一天，用0.5毫升温热的Leibovitz的L-15培养基替换培养基，并将神经元保持在37摄氏度下一小时。对于牵引力显微镜，打开激光扫描共聚焦显微镜，并将载物台顶部培养箱设置为37摄氏度。将神经元放在预先警告的阶段顶部培养箱上的玻璃底培养皿上。按照菜单脚本中所述设置图像采集参数，并选择强烈表达增强型绿色荧光蛋白或EGFP的生长锥。聚焦在凝胶表面并获取延时图像。完成后，使用图像处理软件生成单通道延时RGB图像堆栈。然后将图像另存为 tiff 文件。接下来，将100微升体积10%体积的十二烷基硫酸钠或溶解在蒸馏水中的SDS施加到玻璃底皿中，通过从底物中释放神经元来放松凝胶底物。然后将培养皿在37摄氏度的舞台顶部培养箱中孵育五分钟以稳定温度。在激光扫描共聚焦显微镜中，聚焦在凝胶表面上，以获取未受训练基板中微珠的图像。在未受训的基材中生成磁珠的单通道RGB图像，并将此图像另存为tiff文件。下载牵引力分析代码 TFM2021 并在 MATLAB 中打开 TFM2021。打开主。m在TFM2021中运行它。当图形用户界面出现在屏幕上时。单击加载未训练的基板图像，然后在未训练的基板中选择X-Y位置校正的珠子图像。转到加载荧光珠图像，然后选择图像磁珠的延时堆栈。然后单击加载明场图像以选择明场的延时堆栈图像，并使用加载GFP图像选择EGFP的延时堆栈图像。在图形用户界面的下拉列表中，单击 ROI 以指定感兴趣的矩形区域（包括生长锥），方法是单击显示的单元格图像上的两个点，从而选择 GFP。完成后，单击图形用户界面上的保存按钮，将选定的堆栈图像与ROI一起保存在mat文件中。接下来，单击现场检测并在对话框中输入所需值，以确定磁珠检测的阈值。点击确定开始计算。完成计算后，单击绘图轨迹以放大之前选择的区域，并将检测到的珠子显示为白点。使用选择磁珠来划分在生长锥下包含正确点的多边形区域。然后，通过按键盘上的 Enter 键，多边形区域内的白点将变为红色。单击图形用户界面中的估计力。然后输入像素大小和杨氏模量的值，如手稿中所述。将泊松比率的值设置为 0.3，然后执行估计力以启动计算。该软件会将计算结果保存在电子表格格式文件中。神经元生长锥的荧光图像显示出高Lifeact表达，允许在完全开放和狭窄的隔膜下可视化生长锥形形态。HaloTag-actin表达水平非常低，信号微弱。当隔膜适当变窄时，背景信号减弱，生长锥中出现斑点中的单一作用。适当实现所有步骤的研究人员将观察到生长锥中的F-肌动蛋白逆行流动。聚丙烯酰胺凝胶的刚度是通过计算由于微球的重量引起的压痕深度来确定的。使用激光扫描共聚焦显微镜捕获凝胶表面和微球底部的图像。来自荧光珠的信号在缩进区域的凝胶表面不可见。嵌入聚丙烯酰胺凝胶和神经生长锥中的珠子的荧光图像显示了珠子的起源和位移位置。还观察到生长锥体的EGFP信号。运动记录仪显示了与参考珠相比珠子的运动。当进行单个斑点成像时，重要的事情是选择每周表达如何在两个最小面积下肌动蛋白的神经元。在进行牵引力显微镜检查时，高倍率成像对于牵引力的准确集中非常重要。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones Video (Video) | JoVE

罗丹明-肌动蛋白标记F -肌动蛋白在通透的神经生长锥刺完

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

科研

神经科学

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric Analyses of Retinal Sections Video (Video) | JoVE

视网膜节的形态分析

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses Video (Video) | JoVE

transretinal ERG的录音，从小鼠视网膜杆和锥光反应

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish Video (Video) | JoVE

自由游泳弱电鱼的长期行为跟踪

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types Video (Video) | JoVE

神经细胞类型的流式细胞仪协议的表面和细胞内抗原分析

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina Video (Video) | JoVE

成像钙<sup&gt; 2+</sup&gt;在小鼠视网膜锥光感受器轴突终末动态

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons Video (Video) | JoVE

大鼠皮层神经元丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）泪点的量化

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy Video (Video) | JoVE

在脑核糖凝视与原子力显微镜

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography Video (Video) | JoVE

静止状态脑电图的微状态和欧米茄复杂性分析

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid Î² Effects in Cultured Mouse Neurons Video (Video) | JoVE

在培养的小鼠神经元中可视化轴突生长锥塌陷和早期淀粉样β效应

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...