Name: analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video at JoVE.com

Denne forskning blev delvist støttet af AMED under bevillingsnummer 21gm0810011h0005 (N.I. og Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) og JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Uhelbredelige Sygdomme (T.M.) og NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).

Forfatterne har intet at afsløre.

De protokoller, der er beskrevet i denne undersøgelse, bruger kommercielt tilgængelige materialer og mikroskopiudstyr, der rutinemæssigt findes i alle laboratorier, institutter og universiteter. Derfor kan efterforskere nemt vedtage den nuværende enkelt speckle imaging og trækkraft mikroskopi i deres undersøgelser.
Speckle imaging kan analysere actin polymerisering og kobling kobling. Derudover kan speckle imaging overvåge retrograd strømmen af kobling molekyler såsom shootin1 og cortactin, som interagerer med F-actin retrograd flow. Ved hjælp af et TIRF-mikroskop kan tilbageskridtet af celle vedhæsionsmolekylet L1-CAM også overvåges23,41; L1-CAM gennemgår greb og slip adfærd, der afspejler kobling kobling effektivitet23,41. Selv om denne undersøgelse anvender TMR-HaloTag-systemet til speckle imaging, andre fluorescerende proteiner, såsom EGFP og monomerisk rød fluorescerende protein, er også tilgængelige i analysen16,18,20,23,24,27,39. Det væsentlige for visualisering af actin speckles er et lavt udtryksniveau af fluorescerende actin og belysning af et minimumsområde (figur 2). I denne protokol, Lifeact og HaloTag-actin signaler er sekventielt erhvervet. Fordi actin retrograd flow er relativt langsom (4,5 ± 0,1 μm/min)24, analyse af F-actin retrograd flow og actin polymerisering er upåvirket af sekventiel billedopsamling af forskellige fluorescerende kanaler (~ 1 s interval). Lifeact er en meget udbredt F-actin markør, men kan konkurrere med actin bindende proteiner47. Af yderligere betydning kan Lifeact ændre actin dynamikken og derved påvirke F-actin strukturer og cellemorfologi47,48,49.
Trækkraft mikroskopi kan opdage kræfter til at drive vækst kegle forhånd. Ved at montere neuronerne i en ekstracellulær matrix kan efterforskere også analysere kræfter genereret i et semi-3D-miljø11. Høj forstørrelse billeddannelse er vigtig for præcis kvantificering af trækkraft, fordi vækst kegler generere svage trækkraft7. Selv om andre metoder med nanopillars eller stress-følsomme biosensorer også anvendes til at måle trækkraft50,51, PAA gel-baseret metode er meget tilpasningsdygtig og giver mulighed for justering af substrat stivhed ved at variere koncentrationerne af acrylamid og bis-acrylamid41,44,52. I denne protokol fremstilles PAA gelen i en endelig koncentration på 3,75% acrylamid og 0,03% bis-acrylamid; Young's modulus er ~ 270 Pa22 og denne stivhed er inden for området hjernevæv (100-10.000 Pa)53,54,55. På grund af tykkelsen af PAA gel (~ 100 μm), denne metode begrænser brugen af høj forstørrelse linser under mikroskopi. For at opnå billeder med høj forstørrelse skal efterforskerne bruge zoomfunktionen i et laserscanningsmikroskop.
Afslutningsvis vil jeg sige, at den nuværende speckle imaging og traction force mikroskopi muliggør kvantitative analyser af de vigtigste begivenheder i kraft generationer. Disse oplysninger vil være uvurderlige for at forbedre forståelsen af de mekanismer, der ligger til grund for vækst kegle avancement og navigation.

I den udviklende hvirveldyrhjerne gennemgår neuroner kunstfærdigt organiserede migrationer og projektakser mod passende synaptiske partnere for at etablere funktionelle neuronale netværk1,2,3. Vækst kegler, som er sensoriske og motile strukturer placeret på spidsen af neurites, bestemme hastigheden og retningen af neuronal migration og axon udvækst3,4,5. Da neuroner er omgivet af tætpakkede miljøer, må vækstke udøve kræfter mod deres miljø for at komme videre6,7. For at forstå de mekanismer, der ligger til grund for neuronal migration og axonal vejledning, er analyser af molekylær mekanik for vækstkeglefremrykning afgørende.
Årtiers analyse har vist, at trækkraft til at drive vækst kegle forhånd er genereret af 'kobling' mekanisme; denne mekanisme menes at fungere ikke kun i den axonale vækstkegle, men også i den førende procesvækstkegle af migrerende neuroner8,9,10,11,12. Nemlig actin filamenter (F-actins) i vækst kegler polymerisere på forkant og depolymerize proximally, skubbe ud den førende membran13,14,15. Den resulterende kraft, i forbindelse med actomyosin sammentrækning, fremkalder bagudgående bevægelse af F-actins kaldet retrograd flow7,11,16,17,18,19,20,21. Koblings- og celle vedhæftningsmolekyler formidler mekanisk kobling mellem F-actin retrograd flow og det klæbende substrat og overfører kraften af F-actin flow på substratet, hvorved trækkraften for vækstkegle forhånd7,8,9,11,12,22 . Samtidig reducerer actin-substratkoblingen F-actin-strømningshastigheden og konverterer actin polymerisering til kraften for at stikke den førende membran 9,10.
Axonal vækst kegler fornemme lokale kemiske signaler og transduce dem i en retningsbestemt drivkraft for vækst kegle navigation3,23,24,25. For eksempel stimulerer et axon-styremolekyle netrin-1 sin receptor slettet i kolorektal cancer (DCC) og aktiverer Rho guanosin triphosphat (GTP)-bindende proteiner celledelingskontrolprotein 42 (Cdc42) og Ras-relateret C3 botulinum toksin substrat 1 (Rac1) og deres downstream kinase p21-aktiveret kinase 1 (Pak1)26. Cdc42 og Rac1 fremme 1) actin polymerisering, og Pak1 fosforylerer en kobling molekyle shootin122,26. Shootin1 interagerer med F-actin retrograd flow via en actin-bindende protein cortactin27. Shootin1 interagerer også med L1 celle vedhæftning molekyle (L1-CAM)20,24. Shootin1 fosforylering øger de bindende tilhørsforhold til cortactin og L1-CAM, og forbedrer shootin1-medieret 2) kobling24,27. Inden for vækstkeglen øges asymmetriske aktiveringer af actin polymerisering og koblingskobling 3) trækkraft på siden af netrin-1-kilden, hvilket skaber retningsbestemt drivkraft for vækstkegledrejning (figur 1)24. Intensiv forskning i løbet af de sidste par årtier med hensyn til neuronal migration og axon vejledning har øget forståelsen af vejledning molekyler, deres receptorer, og tilhørende downstream signalering kaskader2,10,28,29,30. Men de molekylære bemaskiner til at generere kræfter til vækst kegle forhånd er lige begyndt at blive belyst; dette kan tilskrives den begrænsede anvendelse af protokollerne til mekanobiologiske analyser.
Den foreliggende undersøgelse beskriver en detaljeret protokol til overvågning af F-actin retrograd flow af enkelt speckle imaging16,18. Overvågning af F-actin retrograd flow er blevet udført i vid udstrækning ved hjælp af super-opløsning mikroskopi, spinning-disk konfokal mikroskopi og total interferens refleksion fluorescens (TIRF) mikroskopi25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Protokollen i denne undersøgelse bruger imidlertid et standard epifluorescencemikroskop og kan således let antages11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. Når det kombineres med F-actin mærkning af Lifeact43, enkelt speckle imaging giver mulighed for kvantificeringer af actin polymerisering sats og kobling kobling effektivitet mellem F-actin tilbagegradering flow og klæbemiddel substrat39,42. Denne undersøgelse beskriver endvidere en detaljeret protokol af trækkraftmikroskopi ved hjælp af en fluorescerende perle-indlejret polyacrylamid (PAA) gel11,22,23,24,27,39,41,42,44. Denne metode registrerer og kvantificerer trækkraft under vækstkeglen ved at overvåge kraftinducerede perlebevægelser44,45. Der leveres en open source traction force-analysekode, og metoden til kvantificering af trækkraft under migration af vækstkegle forklares i detaljer. Ved hjælp af enkelt speckle imaging og trækkraft mikroskopi, forståelse af molekylær mekanik underliggende vækst kegle migration og navigation vil blive lettet. Disse teknikker er også anvendelige til analyse af molekylær mekanik underliggende dendritiske rygsøjlen udvidelsen, som er kendt for at være vigtigt i læring og hukommelse42.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% trypan blue stain solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00809-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albmine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421787-9970-799</td>
			<td>Objective lens (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (diameter 18 mm)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C018001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16806-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open source software package</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>carboxylate-modified microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (14 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1130H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (27 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882-10X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBO103 W/2</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300382128</td>
			<td>Mercury lamp (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution from mouse EHS tumor</td>
			<td>Wako</td>
			<td>120-05751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16919-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Conforcal laser microscope (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB2018a</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse C57BL/6</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse neuron nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>22402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>AAD-1001</td>
			<td>Electroporation apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td>CMOS camera (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26036-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parallel Computing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>1528177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFN21A-HaloTag-actin</td>
			<td>(Minegishi et al., 2018)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420790-9901-000</td>
			<td>Objective lens (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td>
			<td>(Kastian et al., 2021)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slulfo-SAMPHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08933-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrate (NaOH)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>Sako tekkou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2009</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (single speckle imaging)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance

For at etablere funktionelle netværk skal neuroner migrere til deres relevante destinationer og derefter udvide axoner mod deres målceller. Disse processer afhænger af fremskridtene i vækst kegler, der ligger ved spidsen af neurites. Axonal vækst kegler generere drivkræfter ved at fornemme deres lokale mikromiljø og modulerende cytoskeletal dynamik og actin-adhesion kobling (kobling kobling). Årtiers forskning har ført til identifikation af vejledningsmolekyler, deres receptorer og downstream-signaleringskaskader til regulering af neuronal migration og axonal vejledning; men de molekylære maskiner, der kræves for at generere kræfter til at drive vækst kegle forhånd og navigation er lige begyndt at blive belyst. På forkant med neuronal vækst kegler, actin filamenter gennemgå tilbageskridt flow, som er drevet af actin polymerisering og actomyosin sammentrækning. En kobling kobling mellem F-actin retrograd flow og klæbende substrat genererer trækkraft kræfter for vækst kegle forhånd. Denne undersøgelse beskriver en detaljeret protokol til overvågning af F-actin retrograd flow af enkelt speckle imaging. Det er vigtigt, at når den kombineres med en F-actin-markør Lifeact, kan denne teknik kvantificere 1) F-actin polymeriseringshastigheden og 2) koblingskoblingens effektivitet mellem F-actin retrograd flow og klæbesubstratet. Begge er kritiske variabler for at generere kræfter til vækst kegle forhånd og navigation. Derudover beskriver denne undersøgelse en detaljeret protokol af trækkraftmikroskopi, som kan kvantificere 3) trækkraft genereret af vækst kegler. Således, ved at koble analyser af enkelt speckle imaging og trækkraft mikroskopi, kan efterforskere overvåge den molekylære mekanik underliggende vækst kegle forhånd og navigation.

Enkelt speckle imaging at kvantificere actin polymerisering sats og kobling kobling effektivitet En høj Lifeact udtryk tillader F-actin visualisering inden for vækst kegle; en lav HaloTag-actin udtryk gør det muligt at overvåge F-actin tilbageskridt flow (Figur 3, Supplerende Fil 2). Sporing af actin speckles gør det muligt at måle F-actin-strømningshastigheden (Figur 3C, D). Da den mekaniske kobling af F-actin retrograd flow og klæbende substrat reducerer F-actin flow hastighed, kobling koblingen effektivitet kan estimeres fra hastigheden. Desuden, F-actin mærkning med Lifeact hjælpemidler visualisering af F-actin udvidelse og er nyttig til kvantificering af actin polymerisering sats (Figur 3E, F).
Kvantitativ analyse af trækkraft Streng overholdelse af den metode, der præsenteres her, vil afsløre bevægelserne af fluorescerende perler under vækstkeglen (Figur 6C, supplerende fil 4). F-actin retrograd flow på substratet genererer trækkraft forårsager fluorescerende perler til at bevæge sig bagud under væksten kegle. Trækkraftanalysekoden estimerer trækkraften fra fluorescerende perleforskydning og udtrykker den beregnede trækkraft som en kraftvektor. Retningen og størrelsen af trækkraften bestemmes ud fra kraftvektorens x- og y-komponenter (Figur 8C,D). Den røde boks i figur 8D repræsenterer x- og y-komponenterne i en kraftvektor. Figur 8C skildrer den tilsvarende vækstkegle. Med hensyn til x-y koordinater peger vektoren på -93,8° mod x-aksen. denne orientering er rettet mod bagsiden af vækstkeglen (Figur 8C). Størrelsen af trækkraften F blev beregnet på følgende måde:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg">
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg"> Figur 1: En vækst kegle maskiner til kraft generation og vækst kegle navigation. En netrin-1 kemoattractant gradient inducerer asymmetrisk stimulering af sin receptor DCC på en axonal vækst kegle. Dette aktiverer Rac1 og Cdc42, og deres downstream kinase Pak1. Rac1 og Cdc42 fremme (1) actin polymerisering, mens Pak1 fosforylater shootin1, øge shootin1-medieret (2) kobling kobling. Den asymmetriske aktivering af actin dynamik og kobling koblingen i vækst kegle øger (3) trækkraft på siden af netrin-1 kilde, hvilket skaber en retningsbestemt drivkraft for vækst kegle attraktion. Protokollerne her giver mulighed for kvantificering af de vigtigste variabler (1)-(3) for vækst kegle navigation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg"> Figur 2: Fluorescensbilleder af en neuronal vækstkegle under et fuldt åbnet og indsnævret mellemgulv. Vækstkeglen udtrykker Lifeact og HaloTag-actin. (A) Et højt Lifeact udtryk tillader visualisering af vækst kegle morfologi. På den anden side er HaloTag-actin udtryksniveauer meget lave, med svage signaler, når mellemgulvet er fuldt åbnet. (B) Når mellemgulvet er korrekt indsnævret, aftager baggrundssignalerne, og der forekommer enkelte actin-pletter i vækstkeglen. Skalastænger: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg"> Figur 3: Trin til kvantificering af F-actin flowhastighed og actin polymeriseringshastighed ved hjælp af en billedbehandlings- og analysesoftware Fiji. (A) Juster billedets vinkel til analyse. (1) Find og vælg en actin speckle (pilespids), der flyder i en F-actin bundt. (2) Vælg billede > transformer > rotere. (3) Indstil vinklen, så F-actin-bundtet er rettet opad. (4) Billedets vinkel ændres. B) Afgrænse regionen, herunder actin speckle og F-actin-bundtet. (1) Klik på Rektangel på værktøjslinjen. (2) Afgræns et område på billedet. Billedets lysstyrke og kontrast øges for at muliggøre en klar visualisering af actin-speckle og spidsen af F-actin-bundtet. (3) Vælg billede > dupliker. (4) Input de fem tidsrammer, der viser actin speckle flow i F-actin bundt. (5) Det valgte stakbillede vises på skærmen. (C) Overlay cirkler på actin speckle. (1) Klik på Oval på værktøjslinjen. (2) Tegn en cirkel på en actin speckle. (3) Vælg billede > overlejring > Tilføj markering. (4) Cirklen er overlejret. 5) Gentag overlejring af cirklerne på de resterende actin speckles. D) Mål om omfordelingsafstanden for actin speckles i løbet af de fem tidsrammer. (1) Klik på lige på værktøjslinjen. (2) Tegn en linje, der forbinder cirklernes centre. (3) Vælg Analyser > målpunkt. Resultatet, angivet med parameteren Højde (rød boks), relæ actin speckle translokation afstand. E) Måle ændringen i længden af F-actin fremspring i løbet af de fem tidsrammer. (1) Tegn en linje, der forbinder spidsen af F-actin fremspring. (2) Vælg Analyser > målpunkt. Resultatet (rød boks), Højde, angiver forlængelseslængden på F-actin-bundtet. (F) Actin polymerisering sats beregnes ud fra summen af F-actin flow hastighed og forlængelseshastigheden. Se også Supplerende fil 2. Supplerende fil 3 hjælper efterforskere til at praktisere den metode, der er beskrevet ovenfor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg"> Figur 4: Trin til PAA gelpræparatet. Se trin 7.1 for en detaljeret beskrivelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg"> Figur 5: Bestemmelse af PAA gel stivhed. A) En indrykningsmetode for mikrosfæren. Når en mikrosfære er placeret på en fluorescerende perle-indlejret PAA gel, vægten af mikrosfæren forårsager en indrykning i gelen. Indrykningsdybden beregnes ved at trække paa geloverfladens z-positioner fra bunden af mikrosfæren (B,C) Fluorescensbilleder af en PAA gel indrykket af en mikrosfære og indeholdende fluorescerende perler. En laser scanning konfokale mikroskop blev brugt til at fange billeder af gel overflade (B) og bunden af mikrosfæren (C). Signaler fra lysstofrør perler er ikke synlige på geloverfladen i det indrykkede område (B, cirkel). De kan dog observeres i bunden af mikrosfæren. Skalastænger: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg"> Figur 6: Kraft kortlægning af en neuronal vækst kegle. (A-C) Fluorescensbilleder af perler indlejret i en PAA gel og en neural vækstkegle visualiseret med EGFP. Efter erhvervelsen af time-lapse billeder (A), neuron blev frigivet fra gel substratet ved at anvende SDS løsning, og et billede af perlerne i den ustræde substrat blev fanget (B). (C) Billedet af perlerne i det ustrænede substrat viser perlerne i deres oprindelige (grønne) og fordrevne (røde) positioner. EGFP-signalet fra vækstkeglen er vist med blåt. Kymografer (højre) viser bevægelser af perler med 3 s intervaller for en varighed på 147 s, angivet med pilene i boxed områder 1 og 2. Perlen i område 2 er en referenceperle. Skalastænger: 2 μm for (A), (B) og (C, til venstre) og 1 μm for (C, midten). Se også Supplerende fil 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg"> Figur 7: Trin til korrektion af perlebilledets x-y-position i utrænet substrat ved hjælp af Fiji. (A) Foren perlebilledet i ustrænet substrat med time-lapse stack-billedet af fluorescerende perler. (1) Vælg > > stakke > værktøjer > Sammenkæde. (2) Vælg perlerne billedet i ustrænet substrat og time-lapse stack billede af fluorescerende perler i billede1 og billede2, henholdsvis. Klik på OK. (3) Perlebilledet i det ustrænede substrat føjes til time-lapse stack-billedet. (B) Ret x-y-positionen af det fluorescerende perlebillede. (1) Brug rullepanelet (rød ramme) til at markere den anden ramme (rød pil) i billedstakken. (2) Vælg plugins > StackReg. (3) Vælg Stiv brødtekst på rullelisten (rød ramme), og klik på OK. Korrektionen af x-y-positionen begynder. (C) Gem x-y-positionskorrigeret perlebillede. Når du har valgt den første ramme i x-y-positionskorrigeret stakbillede, skal du (1) vælge Billede > Duplicate. (2) input 1 i området, og fjern markeringen af dubletstakken. Klik derefter på OK. (3) det x-y positionskorrigerede perlebillede i det utrænede underlag vises på skærmen. Gem dette billede som en tiff-fil. Supplerende fil 6 hjælper efterforskere med at praktisere den metode, der er beskrevet ovenfor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg"> Figur 8: Analyse af trækkraft under en neuronal vækstkegle ved hjælp af en open source traction force analysis code. (A) GUI til analyse af trækkraft. Time-lapse billeder valgt på GUI kan bekræftes fra rullelisten og med skyderen angivet (rød boks). (B) Vælg et område, der omfatter vækstkeglen. (1) Klik på ROI på GUI. Angiv to punkter (pilespidser) på cellebilledet med musemarkøren. (2) Der vises en rød boks på cellebilledet. To klik bestemmer placeringen af to hjørner. (C) Vælg de fundne perler (hvide prikker) under vækstkeglen. (1) På GUI skal du klikke på Vælg perler og afgrænse en polygonal region, der omfatter vækstkeglen ved at klikke. Tryk på Enter . (2) De hvide prikker i det polygonale område ændres til en rød farve. (D) Beregnede resultater af trækkraftens retning og størrelse. Den røde boks i regnearket repræsenterer x- og y-komponenterne i kraftvektoren, estimeret ved trækkraftanalyse. På x-y-koordinaten i højre panel peger kraftvektoren genereret af vækstkeglen på -93,8° mod x-aksen. denne orientering er rettet mod bagsiden af vækstkeglen i (C). Supplerende fil 6 hjælper efterforskere med at praktisere den metode, der er beskrevet ovenfor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende Fil 1: Opskrifter af løsninger og medier, der anvendes i denne undersøgelse. Se tekst for detaljeret brug. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%201-63227R1.xlsx" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende Fil 2: Fluorescens billeddannelse af Lifeact og fluorescerende speckle imaging af HaloTag-actin i en nerve vækst kegle. Lifeact (grøn) og HaloTag-actin (magenta). Billeder blev erhvervet hver 3 s for en samlet varighed på 147 s. Skalastang: 2 μm. Se også Figur 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%202.mp4" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 3: Praksis data til kvantificering af F-actin flow hastighed og actin polymerisering sats. En multikanal time-lapse stack billede af Lifeact (grøn) og HaloTag-actin (magenta). Se også Figur 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental%20file%203.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende Fil 4: En kraft-kortlægning video detektering trækkraft på en neuronal vækst kegle. Den oprindelige (grønne) og forskudte (røde) positioner af perlerne. EGFP-signalet i vækstkeglen er vist med blåt. Billeder blev erhvervet hver 3 s for 147 s. Skalastang: 2 μm. Se også figur 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%204.mp4" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 5: Trækkraft analyse kode. Se trin 8.12 for detaljeret brug. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%205.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>
Supplerende fil 6: Øv data til kvantificering af trækkraft. En enkelt-kanalS RGB billede af perlerne i utrænet substrat og single-kanal time-lapse stak RGB billeder af fluorescerende perler under en vækst kegle, EGFP, og lyse-felt. Se også Figur 7 og 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%206.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video at JoVE.com

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video (Video) | JoVE

For at fremme skal vækst kegler udøve trækkraft mod det ydre miljø. Generationen af trækkraft er afhængig af actin dynamik og kobling kobling. Den foreliggende undersøgelse beskriver metoder til analyse actin dynamik, kobling kobling og trækkraft kræfter for vækst kegle forhånd.

Analyser af Actin Dynamics, Kobling Kobling og Traction Force for Vækst Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

Koblingsanalyse af enkelt speckle imaging og trækkraft mikroskopiske kan analysere molekylære bemaskiner for vækst kegle forhånd og navigation. Da teknikkerne bruger kommercielt tilgængelige materialer og standardmikroskoper. Forskere kan bogstaveligt talt tilpasse sig teknikkerne i deres studier.Begynd med at behandle neuronerne med tetramethyl-rhodamin eller TMR ligand ved en fortynding af en til 2000 i kulturmedium på dagen in vitro 3. Derefter opretholde neuroner på 37 grader Celsius med 5% kuldioxid i en time. Efter inkubation vaskes TMR ligand tre gange med forvarmet PBS.Fjern PBS før du tilføjer 0,5 milliliter opvarmet Leibovitz's L-15 medium i neuronerne. Hold neuronerne ved 37 grader Celsius i en time. Tænd derefter et epifluorescencemikroskop og indstil statens top inkubator til 37 grader Celsius.Placer derefter TMR ligand behandlede neuroner i glasbunden på den opvarmede fase top inkubator. Indstil parametrene for billedopsamling, f.eks. eksponeringstid, til 500 millisekunder for en Lifeact- og HaloTag-actin-fluorescenskanaler og binning som 0,065 mikron med 0,065 mikron pr. pixel med tidsinterval på tre sekunder for 50 billeder. Efter at have valgt en vækst kegle, der stærkt udtrykker Lifeact og ugentlig udtrykker HaloTag-actin.Luk feltet på mellemgulvet for at belyse et minimumsområde, der omfatter vækstkeglen og få tid bortfalder billeder. På dagen in vitro 3, erstatte kulturmediet med 0,5 milliliter opvarmet Leibovitz's L-15 medium og opretholde neuroner i en time ved 37 grader Celsius. For trækkraft mikroskopi, tænde en laser scanning konfokale mikroskop og indstille fase top inkubator til 37 grader Celsius.Placer neuronerne på glasbundsskålen på den foradvarer fase top inkubator. Indstil billedopsamlingsparametrene som beskrevet i menuscriptet, og vælg en vækstkegle, der stærkt udtrykker forbedret grønt fluorescensprotein eller EGFP. Fokuser på geloverfladen og få time-lapse billeder.Når du er færdig bruge en billedbehandling software til at producere enkelt kanal time-lapses RGB billede stakke. Gem derefter billederne som tiff-filer. Dernæst anvende 100 mikroliter af 10% vægt efter volumen natrium dodecyl sulfat eller SDS opløst i destilleret vand til glasbunden parabol til at slappe af gel substratet ved at frigive neuroner fra substratet.Inkuber derefter skålen i fasetopinkubatoren i fem minutter ved 37 grader Celsius for at stabilisere temperaturen. I laserscanningskonfokalmikroskopet skal du fokusere på geloverfladen for at få et billede af perlerne i det utrænede substrat. Producere en enkelt kanal RGB billede af perlerne i den ustrænede substrat og gemme dette billede som en tiff fil.Download trækkraftanalysekoden TFM2021 og åbn TFM2021 i MATLAB. Åbn hoved. m i TFM2021 og køre det.Når der vises en grafisk brugergrænseflade på skærmen. Klik på belastning utrænet, substrat billede og vælg X-Y position korrigeret perle billede i den utrænede substrat. Gå til at indlæse fluorescerende perle billeder og vælg time-lapse stakken af billedperler.Klik derefter på indlæsse lyse feltbilleder for at vælge time-lapse stack-billedet af bright-field og bruge load GFP-billeder til at vælge det time-lapse stack-billede af EGFP. Vælg GFP på rullelisten på den grafiske brugergrænseflade, før du klikker på investeringsafkast for at angive rektangelområdet af interesse, herunder vækstkeglen, ved at klikke på to punkter på det viste cellebillede. Når det er gjort, skal du klikke på knappen Gem på den grafiske brugergrænseflade for at gemme de valgte stakbilleder sammen med investeringsafkast i en måttefil.Klik derefter på stedet for at registrere og indtaste en ønsket værdi i dialogboksen for at bestemme en tærskel for registrering af perle. Tryk okay for at starte beregningen. Når du har afsluttet beregningen, skal du klikke på plotsporet for at forstørre det område, der er valgt tidligere, og vise de fundne perler som hvide prikker.Brug udvalgte perler til at afgrænse et polygonalt område, der indeholder de korrekte prikker under vækstkeglen. Ved at trykke på Enter på tastaturet ændres de hvide prikker i det polygonale område til rødt. Klik på skønskraft i den grafiske brugergrænseflade.Indtast derefter værdier for pixelstørrelsen og Youngs modul som forklaret i manuskriptet. Sæt værdien for Poissons forhold som 0,3, og udfør skønskraft for at starte beregningen. Softwaren gemmer beregningsresultaterne i en regnearksformatfil.Fluorescensbillederne af en neuronal vækstkegle viste et højt Lifeact-udtryk, der tillader visualisering af vækstkeglemorfologi under en helt åben og smal membran. HaloTag-actin udtryksniveauer var meget lave med svage signaler. Når mellemgulvet er en passende indsnævret, baggrundssignaler mindskes og enkelt handling i pletter vises i vækst kegle.Forskere, der passende opnå alle de skridt vil observere F-actin tilbageskridt flow i væksten kegle. Stivheden af polyacrylamidgelen blev bestemt ved at beregne indrykningsdybden forårsaget på grund af mikrosfærens vægt. En laser scanning konfokale mikroskop blev brugt til at fange billeder af gel overflade og bunden af mikrosfæren.Signalerne fra fluorescerende perler var ikke synlige på geloverfladen i det indrykkede område. Fluorescens billeder af perlerne indlejret i polyacrylamid gel og neurale vækst kegle, viste perlerne i deres oprindelse og fordrevne positioner. EGFP-signalet fra vækstkeglen blev også observeret.Kymograferne viste perlens bevægelser i forhold til en referenceperle. Når du udfører en enkelt speckle imaging, vigtige ting at vælge en neuron, der ugentligt udtrykker, hvordan man actin under to et minimum område. Når du udfører en trækkraft mikroskopi, høj forstørrelse billeddannelse er vigtigt for præcis koncentration af trækkraft.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones Video (Video) | JoVE

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric Analyses of Retinal Sections Video (Video) | JoVE

Morfometriske Analyser af Retina Sektioner

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses Video (Video) | JoVE

Transretinal ERG Optagelser fra Mouse nethinden: Rod og Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish Video (Video) | JoVE

Langsigtet Behavioral Tracking af Frit Svømning Svagt Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types Video (Video) | JoVE

Flowcytometri Protokoller for Surface og intracellulære Antigen Analyser af neurale Cell Typer

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina Video (Video) | JoVE

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics i Cone Lysmodtageren Axon Terminals i Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons Video (Video) | JoVE

Kvantificering af Filamentøs actin (F-actin) puncta i Rat kortikale neuroner

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy Video (Video) | JoVE

Peering på Brain Polysomer med Atomic force mikroskopi

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography Video (Video) | JoVE

Mikrostaten og Omega kompleksitet analyser af Resting state electroencefalografi

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid Î² Effects in Cultured Mouse Neurons Video (Video) | JoVE

Visualisere cytoskeletale vækst kegle sammenbrud og tidlige Amyloid β effekter i kulturperler mus neuroner

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...