Name: analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video at JoVE.com

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door AMED onder subsidienummer 21gm0810011h0005 (N.I. en Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) en JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), de Osaka Medical Research Foundation for Incurable Diseases (T.M.), en NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).

De auteurs hebben niets te onthullen.

De protocollen die in deze studie worden beschreven, maken gebruik van commercieel beschikbare materialen en microscopie-apparatuur die routinematig wordt aangetroffen in alle laboratoria, instituten en universiteiten. Daarom kunnen onderzoekers gemakkelijk de huidige enkele spikkelbeeldvorming en tractiekrachtmicroscopie in hun studies gebruiken.
De spikkelbeeldvorming kan actinepolymerisatie en koppelingskoppeling analyseren. Bovendien kan spikkelbeeldvorming de retrograde stroom van koppelingsmoleculen zoals shootin1 en cortactine volgen, die interageren met de retrograde stroom van F-actine. Met behulp van een TIRF-microscoop kan ook de retrograde stroom van het celadhesiemolecuul L1-CAM worden gevolgd23,41; De L1-CAM ondergaat grip- en slipgedrag dat de efficiëntie van de koppeling weerspiegelt23,41. Hoewel de huidige studie het TMR-HaloTag-systeem gebruikt voor spikkelbeeldvorming, zijn andere fluorescerende eiwitten, zoals EGFP en monomer rood fluorescerend eiwit, ook beschikbaar in de analyse16,18,20,23,24,27,39. De essentie voor het visualiseren van actine spikkels zijn een laag expressieniveau van fluorescerende actine en de verlichting van een minimaal gebied (figuur 2). In dit protocol worden Lifeact- en HaloTag-actinesignalen sequentieel verkregen. Omdat de actine retrograde stroom relatief langzaam is (4,5 ± 0,1 μm/min)24, wordt de analyse van de F-actine retrograde stroom en actinepolymerisatie niet beïnvloed door sequentiële beeldacquisitie van verschillende fluorescerende kanalen (interval ~1 s). Lifeact is een veelgebruikte F-actine marker, maar kan concurreren met actine bindende eiwitten47. Van verder belang is dat Lifeact de actinedynamiek kan veranderen, waardoor F-actinestructuren en de celmorfologie worden beïnvloed47,48,49.
Tractiekrachtmicroscopie kan krachten detecteren om de voortgang van de groeikegel te stimuleren. Door de neuronen in een extracellulaire matrix te monteren, kunnen onderzoekers ook krachten analyseren die zijn gegenereerd in een semi-3D-omgeving11. Beeldvorming met een hoge vergroting is belangrijk voor een nauwkeurige kwantificering van de tractiekracht omdat groeikegels zwakke tractiekrachten genereren7. Hoewel andere methoden met nanopillars of stressgevoelige biosensoren ook worden gebruikt om de tractiekracht50,51 te meten, is de op PAA-gel gebaseerde methode zeer aanpasbaar en maakt het mogelijk de substraatstijfheid aan te passen door de concentraties acrylamide en bisacryryxamide41 te variëren41,44,52. In dit protocol wordt de PAA-gel bereid in een eindconcentratie van 3,75% acrylamide en 0,03% bis-acrylamide; De modulus van Young is ~270 Pa22 en deze stijfheid ligt binnen het bereik van hersenweefsel (100-10.000 Pa)53,54,55. Vanwege de dikte van de PAA-gel (~100 μm) beperkt deze methode het gebruik van lenzen met een hoge vergroting tijdens microscopie. Om beelden met een hoge vergroting te verkrijgen, moeten onderzoekers de zoomfunctie gebruiken in een confocale microscoop voor laserscanning.
Kortom, de huidige spikkelbeeldvorming en tractiekrachtmicroscopie maken kwantitatieve analyses mogelijk van de belangrijkste gebeurtenissen in krachtgeneraties. Deze informatie zal van onschatbare waarde zijn voor het verbeteren van het begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de vooruitgang en navigatie van groeikegels.

In het zich ontwikkelende gewervelde brein ondergaan neuronen uitgebreid georganiseerde migraties en projecteren axonen naar geschikte synaptische partners om functionele neuronale netwerken tot stand te brengen1,2,3. Groeikegels, die sensorische en beweeglijke structuren zijn die zich aan het uiteinde van neurieten bevinden, bepalen de snelheid en richting van neuronale migratie en axonuitgroei3,4,5. Omdat neuronen worden omringd door dicht opeengepakte omgevingen, moeten groeikegels krachten uitoefenen tegen hun omgeving om vooruit te komen6,7. Om de mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan neuronale migratie en axonale begeleiding, zijn analyses van de moleculaire mechanica voor groeikegelvoortgang essentieel.
Tientallen jaren van analyse hebben aangetoond dat tractiekracht om de vooruitgang van de groeikegel te stimuleren, wordt gegenereerd door het 'koppelingsmechanisme'; men denkt dat dit mechanisme niet alleen functioneert in de axonale groeikegel, maar ook in de leidende procesgroeikegel van migrerende neuronen8,9,10,11,12. Actinefilamenten (F-actinen) in groeikegels polymeriseren namelijk aan de voorrand en depolymeriseren proximaal, waardoor het voorste membraan13,14,15 wordt uitgestoten. De resulterende kracht, in combinatie met actomyosinecontractie, induceert achterwaartse beweging van F-actinen genaamd retrograde flow7,11,16,17,18,19,20,21. Koppelings- en celadhesiemoleculen bemiddelen de mechanische koppeling tussen de F-actine retrograde stroom en het lijmsubstraat en geven de kracht van de F-actinestroom door aan het substraat, waardoor tractiekracht wordt gegenereerd voor groeikegelvooruitgang7,8,9,11,12,22 . Tegelijkertijd vermindert de actine-substraatkoppeling de F-actinestroomsnelheid en zet actinepolymerisatie om in de kracht om het toonaangevende membraan uit te steken9,10.
Axonale groeikegels detecteren lokale chemische signalen en transformeren deze in een directionele drijvende kracht voor groeikegelnavigatie3,23,24,25. Een axongeleidingsmolecuul netrin-1 stimuleert bijvoorbeeld zijn receptor verwijderd bij colorectale kanker (DCC) en activeert het Rho guanosinetrifosfaat (GTP)-bindende eiwitten celdelingscontrole-eiwit 42 (Cdc42) en Ras-gerelateerd C3 botulinetoxinesubstraat 1 (Rac1), en hun stroomafwaartse kinase p21-geactiveerd kinase 1 (Pak1)26. Cdc42 en Rac1 bevorderen 1) actinepolymerisatie en Pak1 fosforyleert een koppelingsmolecuul shootin122,26. Shootin1 interageert met F-actine retrograde stroom via een actine-bindend eiwit cortactin27. Shootin1 interageert ook met L1 celadhesie molecuul (L1-CAM)20,24. Shootin1 fosforylering verhoogt de bindingsaffiniteiten voor cortactine en L1-CAM, en verbetert shootin1-gemedieerde 2) koppelingskoppeling24,27. Binnen de groeikegel nemen asymmetrische activeringen van actinepolymerisatie en koppelingskoppeling toe 3) tractiekracht aan de zijkant van de netrin-1-bron, waardoor directionele drijvende kracht wordt gegenereerd voor het draaien van groeikegels (figuur 1)24. Intensief onderzoek in de afgelopen decennia met betrekking tot neuronale migratie en axongeleiding heeft het begrip van geleidingsmoleculen, hun receptoren en bijbehorende stroomafwaartse signaalcascades2,10,28,29,30 verbeterd. De moleculaire machines om krachten te genereren voor de vooruitgang van de groeikegel beginnen echter nog maar net te worden opgehelderd; dit kan worden toegeschreven aan het beperkte gebruik van de protocollen voor mechanobiologische analyses.
De huidige studie beschrijft een gedetailleerd protocol voor het monitoren van de F-actine retrograde stroom door middel van beeldvorming met enkele spikkel16,18. Monitoring van F-actine retrograde stroom is uitgebreid uitgevoerd met behulp van superresolutie microscopie, spinning-disk confocale microscopie en total interference reflection fluorescence (TIRF) microscopie25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Het protocol in deze studie maakt echter gebruik van een standaard epifluorescentiemicroscoop en is dus gemakkelijk over te nemen11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. In combinatie met F-actine-etikettering door Lifeact43 maakt beeldvorming met enkele spikkel kwantificeringen mogelijk van de actinepolymerisatiesnelheid en de koppelingskoppelingsefficiëntie tussen F-actine retrograde stroom en het lijmsubstraat39,42. De huidige studie beschrijft verder een gedetailleerd protocol van tractiekrachtmicroscopie met behulp van een fluorescerende in kralen ingebedde polyacrylamide (PAA) gel11,22,23,24,27,39,41,42,44. Deze methode detecteert en kwantificeert de trekkracht onder de groeikegel door het monitoren van door kracht geïnduceerde kraalbewegingen44,45. Er wordt een open-source tractiekrachtanalysecode verstrekt en de methode voor het kwantificeren van tractiekracht tijdens groeikegelmigratie wordt in detail uitgelegd. Met behulp van single spikkelbeeldvorming en tractiekrachtmicroscopie zal het begrijpen van de moleculaire mechanica die ten grondslag ligt aan groeikegelmigratie en navigatie worden vergemakkelijkt. Deze technieken zijn ook toepasbaar voor het analyseren van de moleculaire mechanica die ten grondslag ligt aan dendritische wervelkolomvergroting, waarvan bekend is dat deze belangrijk is bij het leren en geheugen42.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% trypan blue stain solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00809-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albmine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421787-9970-799</td>
			<td>Objective lens (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (diameter 18 mm)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C018001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16806-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open source software package</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>carboxylate-modified microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (14 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1130H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (27 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882-10X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBO103 W/2</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300382128</td>
			<td>Mercury lamp (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution from mouse EHS tumor</td>
			<td>Wako</td>
			<td>120-05751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16919-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Conforcal laser microscope (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB2018a</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse C57BL/6</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse neuron nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>22402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>AAD-1001</td>
			<td>Electroporation apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td>CMOS camera (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26036-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parallel Computing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>1528177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFN21A-HaloTag-actin</td>
			<td>(Minegishi et al., 2018)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420790-9901-000</td>
			<td>Objective lens (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td>
			<td>(Kastian et al., 2021)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slulfo-SAMPHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08933-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrate (NaOH)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>Sako tekkou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2009</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (single speckle imaging)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance

Om functionele netwerken tot stand te brengen, moeten neuronen migreren naar hun juiste bestemmingen en vervolgens axonen uitbreiden naar hun doelcellen. Deze processen zijn afhankelijk van de vooruitgang van groeikegels die zich aan de uiteinden van neurieten bevinden. Axonale groeikegels genereren drijvende krachten door hun lokale micro-omgeving te detecteren en cytoskeletdynamiek en actine-adhesiekoppeling (koppelingskoppeling) te moduleren. Tientallen jaren van onderzoek hebben geleid tot de identificatie van geleidingsmoleculen, hun receptoren en stroomafwaartse signaalcascades voor het reguleren van neuronale migratie en axonale begeleiding; de moleculaire machines die nodig zijn voor het genereren van krachten om de voortgang en navigatie van de groeikegel te stimuleren, beginnen echter net te worden opgehelderd. Aan de voorzijde van neuronale groeikegels ondergaan actinefilamenten een retrograde stroom, die wordt aangedreven door actinepolymerisatie en actomyosinecontractie. Een koppelingskoppeling tussen F-actine retrograde flow en lijmsubstraat genereert tractiekrachten voor groeikegelvooruitgang. De huidige studie beschrijft een gedetailleerd protocol voor het monitoren van de F-actine retrograde stroom door middel van beeldvorming met enkele spikkels. Belangrijk is dat deze techniek in combinatie met een F-actine marker Lifeact 1) de F-actine polymerisatiesnelheid en 2) de koppelingskoppelingsefficiëntie tussen F-actine retrograde stroom en het lijmsubstraat kan kwantificeren. Beide zijn kritische variabelen voor het genereren van krachten voor groeikegelvooruitgang en navigatie. Bovendien beschrijft de huidige studie een gedetailleerd protocol van tractiekrachtmicroscopie, dat 3) tractiekracht gegenereerd door groeikegels kan kwantificeren. Dus door de analyses van single spikkelbeeldvorming en tractiekrachtmicroscopie te koppelen, kunnen onderzoekers de moleculaire mechanica volgen die ten grondslag ligt aan de voortgang en navigatie van groeikegels.

Beeldvorming met enkele spikkel om de actinepolymerisatiesnelheid en koppelingskoppelingsefficiëntie te kwantificeren Een hoge Lifeact-expressie maakt F-actinevisualisatie binnen de groeikegel mogelijk; een lage HaloTag-actine-expressie maakt de monitoring van de F-actine retrograde stroom mogelijk (Figuur 3, Aanvullend bestand 2). Tracering van de actine spikkels maakt het mogelijk om de F-actine stroomsnelheid te meten (Figuur 3C,D). Omdat de mechanische koppeling van F-actine retrograde flow en het lijmsubstraat de F-actine stroomsnelheid vermindert, kan de koppelingskoppelingsefficiëntie worden geschat aan de hand van de snelheid. Bovendien helpt F-actine-etikettering met Lifeact de visualisatie van F-actine-extensie en is het nuttig voor het kwantificeren van de actinepolymerisatiesnelheid (figuur 3E, F).
Kwantitatieve analyse van de trekkracht Strikte naleving van de hier gepresenteerde methodologie zal de bewegingen van fluorescerende kralen onder de groeikegel onthullen (figuur 6C, aanvullend bestand 4). F-actine retrograde stroming op het substraat genereert trekkracht waardoor de fluorescerende kralen naar achteren bewegen onder de groeikegel. De tractiekrachtanalysecode schat de tractiekracht van fluorescerende kraalverplaatsing en drukt de berekende tractiekracht uit als een krachtvector. De richting en grootte van de trekkracht worden bepaald aan de hand van de x- en y-componenten van de krachtvector (figuur 8C,D). Het rode vak in figuur 8D vertegenwoordigt de x- en y-componenten van een krachtvector; Figuur 8C toont de bijbehorende groeikegel. In termen van x-y-coördinaten wijst de vector naar -93,8° tegen de x-as; deze oriëntatie is gericht op de achterkant van de groeikegel (figuur 8C). De grootte van de trekkracht F werd als volgt berekend:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg">
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg"> Figuur 1: Een groeikegelmachinerie voor krachtgeneratie en groeikegelnavigatie. Een netrine-1 chemoattractant gradiënt induceert asymmetrische stimulatie van zijn receptor DCC op een axonale groeikegel. Dit activeert Rac1 en Cdc42, en hun stroomafwaartse kinase Pak1. Rac1 en Cdc42 bevorderen (1) actinepolymerisatie, terwijl Pak1 shootin1 fosforyleert, waardoor shootin1-gemedieerde (2) koppelingskoppeling wordt verbeterd. De asymmetrische activering van actinedynamica en de koppeling in de groeikegel verhoogt (3) de trekkracht aan de zijkant van de netrin-1-bron, waardoor een directionele drijvende kracht wordt gegenereerd voor het aantrekken van groeikegel. De hier gepresenteerde protocollen maken het mogelijk om de belangrijkste variabelen (1)-(3) voor groeikegelnavigatie te kwantificeren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg"> Figuur 2: Fluorescentiebeelden van een neuronale groeikegel onder een volledig geopend en vernauwd diafragma. De groeikegel drukt Lifeact en HaloTag-actine uit. (A) Een hoge Lifeact-expressie maakt visualisatie van de morfologie van de groeikegel mogelijk. Aan de andere kant zijn halotag-actine-expressieniveaus erg laag, met zwakke signalen wanneer het diafragma volledig is geopend. (B) Wanneer het diafragma op de juiste manier is vernauwd, nemen de achtergrondsignalen af en verschijnen er enkele actine-spikkels in de groeikegel. Schaalbalken: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg"> Figuur 3: Stappen voor het kwantificeren van de F-actine stroomsnelheid en actinepolymerisatiesnelheid met behulp van een beeldverwerkings- en analysesoftware Fiji. (A) Pas de hoek van het beeld aan voor analyse. (1) Zoek en selecteer een actine spikkel (pijlpunt) die stroomt in een F-actine bundel. (2) Selecteer Afbeelding > Transformeren > roteren. (3) Stel de hoek zo in dat de F-actinebundel naar boven wordt gericht. (4) De hoek van de afbeelding wordt gewijzigd. (B) Baken het gebied af, met inbegrip van de actinespikkel en de F-actinebundel. (1) Klik op Rechthoek op de werkbalk. (2) Baken een gebied op de afbeelding af. De helderheid en het contrast van het beeld worden verhoogd om een duidelijke visualisatie van de actine spikkel en de punt van de F-actine bundel mogelijk te maken. (3) Selecteer Afbeelding > dupliceren. (4) Voer de vijf tijdframes in die de actine-spikkelstroom in de F-actinebundel laten zien. (5) De geselecteerde stapelafbeelding verschijnt op het scherm. (C) Overlay cirkels op de actine spikkel. (1) Klik op Ovaal op de werkbalk. (2) Teken een cirkel op een actine spikkel. (3) Selecteer Afbeelding > overlay > Selectie toevoegen. (4) De cirkel is bedekt. 5) Herhaal het bedekken van de cirkels op de resterende actine spikkels. (D) Meet de translocatieafstand van actine spikkels gedurende de vijf tijdframes. (1) Klik op Direct op de werkbalk. (2) Teken een lijn die de middelpunten van de cirkels met elkaar verbindt. (3) Selecteer Analyseren > meting. Het resultaat, aangegeven door de parameter Hoogte (rood vak), die de translocatieafstand van de actinespikkel doorgeeft. (E) Meet de verandering in de lengte van het uitsteeksel van F-actine gedurende de vijf tijdframes. (1) Trek een lijn die de uiteinden van het F-actine-uitsteeksel met elkaar verbindt. (2) Selecteer Analyseren > meting. Het resultaat (rood vak), Hoogte, geeft de verlengingslengte van de F-actinebundel aan. (F) De actinepolymerisatiesnelheid wordt berekend op basis van de som van de F-actinestroomsnelheid en de extensiesnelheid. Zie ook Aanvullend dossier 2. Aanvullend dossier 3 helpt onderzoekers om de hierboven beschreven methodologie te oefenen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg"> Figuur 4: Stappen voor het PAA-gelpreparaat. Zie stap 7.1 voor een gedetailleerde beschrijving. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg"> Figuur 5: Bepaling van de stijfheid van paa-gel. (A) Een microsfeerinspringingsmethode. Wanneer een microsfeer op een fluorescerende paa-gel met kralen wordt geplaatst, veroorzaakt het gewicht van de microsfeer een inkeping in de gel. De inkepingsdiepte wordt berekend door de z-posities van het PAA-geloppervlak af te trekken van de onderkant van de microsfeer (B,C) Fluorescentiebeelden van een PAA-gel ingesprongen door een microsfeer en die fluorescerende kralen bevat. Een confocale laserscanmicroscoop werd gebruikt om beelden vast te leggen van het geloppervlak (B) en de bodem van de microsfeer (C). Signalen van de fluorescerende kralen zijn niet zichtbaar op het geloppervlak in het ingesprongen gebied (B, cirkel). Ze kunnen echter worden waargenomen aan de onderkant van de microsfeer. Schaalbalken: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg"> Figuur 6: Force mapping van een neuronale groeikegel. (A-C) Fluorescentiebeelden van kralen ingebed in een PAA-gel en een neurale groeikegel gevisualiseerd met EGFP. Na het verkrijgen van time-lapse-beelden (A) werd het neuron vrijgegeven uit het gelsubstraat door SDS-oplossing toe te passen en werd een beeld van de kralen in het ongetrainde substraat vastgelegd (B). (C) De afbeelding van de kralen in het ongetrainde substraat toont de kralen in hun oorspronkelijke (groene) en verplaatste (rode) posities. Het EGFP-signaal van de groeikegel wordt blauw weergegeven. Kymografen (rechts) tonen de bewegingen van kralen met intervallen van 3 s voor een duur van 147 s, aangegeven door de pijlen in de ingepakte gebieden 1 en 2. De kraal in gebied 2 is een referentiekraal. Schaalbalken: 2 μm voor (A), (B) en (C, links) en 1 μm voor (C, midden). Zie ook Aanvullend dossier 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg"> Figuur 7: Stappen voor het corrigeren van de x-y-positie van de kraalafbeelding in ongetraind substraat met Fiji. (A) Voeg het kraalbeeld in ongetraind substraat samen met het time-lapse stapelbeeld van fluorescerende kralen. (1) Selecteer Afbeelding > stapels > tools > samenvoegen. (2) Selecteer de kralenafbeelding in ongetraind substraat en de time-lapse stackafbeelding van fluorescerende kralen in respectievelijk Afbeelding1 en Afbeelding2. Klik op OK. (3) De kraalafbeelding in het ongetrainde substraat wordt toegevoegd aan de time-lapse stackafbeelding. (B) Corrigeer de x-y-positie van het fluorescerende kralenbeeld. (1) Gebruik de schuifbalk (rood kader) om het tweede frame (rode pijl) in de afbeeldingsstapel te selecteren. (2) Selecteer Plugins > StackReg. (3) Selecteer Rigid Body in de vervolgkeuzelijst (rood frame) en klik op OK. De correctie van de x-y positie zal beginnen. (C) Sla de x-y positie-gecorrigeerde kraalafbeelding op. Nadat u het eerste frame van de x-y-positiegecorrigeerde stapelafbeelding hebt geselecteerd(1), selecteert u Afbeelding > Dupliceren. (2) voer 1 in het bereik in en schakel Dubbele stapel uit. Klik vervolgens op OK. (3) het x-y positiegecorrigeerde kraalbeeld in het ongetrainde substraat verschijnt op het scherm. Sla deze afbeelding op als tiff-bestand. Aanvullend dossier 6 helpt onderzoekers om de hierboven beschreven methodologie te oefenen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg"> Figuur 8: Analyse van tractiekracht onder een neuronale groeikegel met behulp van een open-source tractiekrachtanalysecode. (A) GUI voor het analyseren van tractiekracht. Time-lapse-afbeeldingen die in de GUI zijn geselecteerd, kunnen worden bevestigd in de vervolgkeuzelijst en met de aangegeven schuifregelaar (rood vak). (B) Selecteer een regio die de groeikegel bevat. (1) Klik op ROI op de GUI. Geef met de muiscursor twee punten (pijlpunten) op de celafbeelding op. (2) Er verschijnt een rood vak op de celafbeelding. Twee klikken bepalen de locaties van twee hoeken. (C) Selecteer de gedetecteerde kralen (witte stippen) onder de groeikegel. (1) Klik in de GUI op Kralen selecteren en destreep een veelhoekig gebied af dat de groeikegel bevat door te klikken. Druk op enter . (2) De witte stippen binnen het veelhoekige gebied veranderen in een rode kleur. D) Berekende resultaten van de richting en de omvang van de trekkracht. Het rode vak in de spreadsheet vertegenwoordigt de x- en y-componenten van de krachtvector, geschat door tractiekrachtanalyse. Op de x-y-coördinaat in het rechterpaneel wijst de krachtvector die door de groeikegel wordt gegenereerd tot -93,8° tegen de x-as; deze oriëntatie is gericht op de achterkant van de groeikegel in (C). Aanvullend dossier 6 helpt onderzoekers om de hierboven beschreven methodologie te oefenen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Aanvullend bestand 1: Recepten van oplossingen en media die in deze studie worden gebruikt. Zie tekst voor gedetailleerd gebruik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%201-63227R1.xlsx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 2: Fluorescentiebeeldvorming van Lifeact en fluorescerende spikkelbeeldvorming van HaloTag-actine in een zenuwgroeikegel. Lifeact (groen) en HaloTag-actine (magenta). Beelden werden elke 3 s verkregen voor een totale duur van 147 s. Schaalbalk: 2 μm. Zie ook Figuur 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%202.mp4" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 3: Praktijkgegevens voor het kwantificeren van de F-actinestroomsnelheid en de actinepolymerisatiesnelheid. Een multichannel time-lapse stack afbeelding van Lifeact (groen) en HaloTag-actine (magenta). Zie ook figuur 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental%20file%203.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend bestand 4: Een force-mapping video die tractiekracht detecteert bij een neuronale groeikegel. De oorspronkelijke (groene) en verplaatste (rode) posities van de kralen. Het EGFP-signaal in de groeikegel wordt blauw weergegeven. Beelden werden verkregen om de 3 s voor 147 s. Schaalbalk: 2 μm. Zie ook figuur 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%204.mp4" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 5: Tractiekrachtanalysecode. Zie stap 8.12 voor gedetailleerd gebruik. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%205.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>
Aanvullend dossier 6: Oefengegevens voor het kwantificeren van de trekkracht. Een enkelkanaals RGB-afbeelding van de kralen in ongetraind substraat en eenkanaals time-lapse stapel RGB-beelden van fluorescerende kralen onder een groeikegel, EGFP en helder veld. Zie ook figuren 7 en 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%206.zip" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video at JoVE.com

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video (Video) | JoVE

Om vooruit te komen, moeten groeikegels tractiekrachten uitoefenen tegen de externe omgeving. Het genereren van trekkrachten is afhankelijk van actinedynamiek en koppeling. De huidige studie beschrijft methoden voor het analyseren van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekrachten voor groeikegelvoortgang.

Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

Koppelingsanalyse van single speckle imaging en tractiekracht microscopisch kan moleculaire machines analyseren voor groeikegelvooruitgang en navigatie. Omdat de technieken gebruik maken van commercieel verkrijgbare materialen en standaard microscopen. Onderzoekers kunnen zich letterlijk aanpassen aan de technieken in hun studies.Begin met het behandelen van de neuronen met tetramethyl-rhodamine of TMR-ligand bij een verdunning van één tot 2000 in kweekmedium op de dag in vitro 3. Houd vervolgens de neuronen gedurende een uur op 37 graden Celsius met 5% koolstofdioxide. Was na incubatie het TMR-ligand driemaal met voorverwarmd PBS.Verwijder de PBS voordat u 0,5 milliliter opgewarmd L-15-medium van Leibovitz aan de neuronen toevoegt. Houd de neuronen gedurende een uur op 37 graden Celsius. Zet vervolgens een epifluorescentiemicroscoop aan en stel de bovenste incubator van de staat in op 37 graden Celsius.Plaats vervolgens de met TMR ligand behandelde neuronen in de glazen onderste schaal op de verwarmde incubator aan de bovenkant. Stel de beeldacquisitieparameters in, zoals belichtingstijd op 500 milliseconden voor een Lifeact- en HaloTag-actinefluorescentiekanalen en binning als 0,065 micron bij 0,065 micron per pixel bij een tijdsinterval van drie seconden voor 50 frames. Na het selecteren van een groeikegel die Lifeact sterk tot expressie brengt en wekelijks HaloTag-actine tot expressie brengt.Sluit het veld op het diafragma om een minimaal gebied met de groeikegel te verlichten en timelapse-beelden te verkrijgen. Vervang op de dag in vitro 3 het kweekmedium door 0,5 milliliter verwarmd L-15-medium van Leibovitz en houd de neuronen gedurende een uur op 37 graden Celsius. Schakel voor tractiekrachtmicroscopie een confocale laserscanmicroscoop in en stel de incubator van het podium in op 37 graden Celsius.Plaats de neuronen op de glazen onderste schaal op de vooraf gewaarschuwde incubator aan de bovenkant van het podium. Stel de beeldacquisitieparameters in zoals beschreven in het menuscript en selecteer een groeikegel die sterk tot expressie komt met verbeterd groen fluorescentie-eiwit of EGFP. Focus op het geloppervlak en verkrijg time-lapse-beelden.Als u klaar bent, gebruikt u beeldverwerkingssoftware om RGB-beeldstapels met één kanaal te produceren. Sla de afbeeldingen vervolgens op als tiff-bestanden. Breng vervolgens 100 microliter van 10% gewicht per volume natriumdodecylsulfaat of SDS opgelost in gedestilleerd water aan op de glazen bodemschaal om het gelsubstraat te ontspannen door neuronen uit het substraat vrij te maken.Incubeer vervolgens het gerecht in de incubator van het podiumtop gedurende vijf minuten bij 37 graden Celsius om de temperatuur te stabiliseren. Richt je in de confocale microscoop van het laserscannen op het geloppervlak om een beeld te krijgen van de kralen in het ongetrainde substraat. Produceer een enkelkanaals RGB-afbeelding van de kralen in het ongetrainde substraat en sla deze afbeelding op als tiff-bestand.Download de tractiekrachtanalysecode TFM2021 en open TFM2021 in MATLAB. Open hoofdgerecht. m in TFM2021 en voer het uit.Wanneer een grafische gebruikersinterface op het scherm verschijnt. Klik op load untrained, substrate image en selecteer de X-Y positie gecorrigeerde kraal afbeelding in het ongetrainde substraat. Ga naar fluorescerende kralenafbeeldingen laden en selecteer de time-lapse-stapel afbeeldingskralen.Klik vervolgens op bright-field images laden om de time-lapse stack image van bright-field te kiezen en gebruik load GFP images om de time-lapse stack image van EGFP te selecteren. Selecteer in de vervolgkeuzelijst op de grafische gebruikersinterface GFP voordat u op ROI klikt om het gewenste rechthoekgebied op te geven, inclusief de groeikegel, door op twee punten op de weergegeven celafbeelding te klikken. Als u klaar bent, klikt u op de knop Opslaan op de grafische gebruikersinterface om de geselecteerde stapelafbeeldingen samen met de ROI in een matbestand op te slaan.Klik vervolgens ter plaatse op detecteren en voer een gewenste waarde in het dialoogvenster in om een drempel voor kraaldetectie te bepalen. Druk op ok om de berekening te beginnen. Nadat u de berekening hebt voltooid, klikt u op plottrack om het eerder geselecteerde gebied te vergroten en de gedetecteerde kralen als witte stippen weer te geven.Gebruik geselecteerde kralen om een veelhoekig gebied af te bakenen dat de juiste stippen onder de groeikegel bevat. Door vervolgens op enter op het toetsenbord te drukken, veranderen de witte stippen in het veelhoekige gebied in rood. Klik op schattingskracht in de grafische gebruikersinterface.Voer vervolgens waarden in voor de pixelgrootte en young's modulus zoals uitgelegd in het manuscript. Zet de waarde voor de verhouding van Poisson op 0,3 en voer de schattingskracht uit om de berekening te starten. De software slaat de berekeningsresultaten op in een spreadsheetformaatbestand.De fluorescentiebeelden van een neuronale groeikegel toonden een hoge Lifeact-expressie die de visualisatie van de morfologie van de groeikegel onder een volledig open en smal diafragma mogelijk maakte. HaloTag-actine expressie niveaus waren zeer laag met dim signalen. Wanneer het diafragma op de juiste manier is versmald, nemen achtergrondsignalen af en verschijnen er enkele handelingen in spikkels in de groeikegel.Onderzoekers die alle stappen op de juiste manier bereiken, zullen de retrograde stroom F-actine in de groeikegel observeren. De stijfheid van de polyacrylamidegel werd bepaald door de inkepingsdiepte te berekenen die werd veroorzaakt door het gewicht van de microsfeer. Een confocale laserscanmicroscoop werd gebruikt om beelden van het geloppervlak en de bodem van de microsfeer vast te leggen.De signalen van de fluorescerende kralen waren niet zichtbaar aan het geloppervlak in het ingesprongen gebied. Fluorescentiebeelden van de kralen ingebed in de polyacrylamidegel en de neurale groeikegel, toonden de kralen in hun oorsprong en verplaatste posities. Het EGFP-signaal van de groeikegel werd ook waargenomen.De kymografen toonden de bewegingen van de kraal in vergelijking met een referentiekraal. Bij het uitvoeren van een enkele spikkelbeeldvorming, belangrijke dingen om een neuron te selecteren dat wekelijks uitdrukt hoe te acteren onder twee een minimumgebied. Bij het uitvoeren van een tractiekrachtmicroscopie is beeldvorming met een hoge vergroting belangrijk voor een nauwkeurige concentratie van tractiekracht.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones Video (Video) | JoVE

Labeling F-actine Prikkeldraad Eindigt op Rhodamine-actine in gepermeabiliseerde neuronale groei Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric Analyses of Retinal Sections Video (Video) | JoVE

Morfometrische analyses van het netvlies secties

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses Video (Video) | JoVE

Transretinal ERG Opnames van Mouse Retina: staafjes en kegeltjes Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish Video (Video) | JoVE

Langdurige Behavioral Tracking van Vrij Zwemmen Zwak Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types Video (Video) | JoVE

Flowcytometrie Protocollen voor Surface en intracellulaire Antigen Analyses van Neural Cell Types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina Video (Video) | JoVE

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamiek in Cone fotoreceptorcellen Axon Terminals van de Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons Video (Video) | JoVE

Kwantificering van draadvormige actine (F-actine) Puncta in Rat corticale neuronen

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy Video (Video) | JoVE

Turen naar Brain polysomen met Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography Video (Video) | JoVE

Vorstendom en Omega complexiteit Analyses van de rust-state-elektro-encefalografie

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid Î² Effects in Cultured Mouse Neurons Video (Video) | JoVE

Visualiseren van axonale groei Cone ineenstorting en vroege amyloïde β effecten in gekweekte muis neuronen

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...