Name: analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
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Cette recherche a été soutenue en partie par AMED sous le numéro de subvention 21gm0810011h0005 (N.I. et Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) et JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), la Osaka Medical Research Foundation for Incurable Diseases (T.M.) et le NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les protocoles décrits dans cette étude utilisent des matériaux et des équipements de microscopie disponibles dans le commerce que l’on trouve couramment dans tous les laboratoires, instituts et universités. Par conséquent, les chercheurs peuvent facilement adopter l’imagerie à faisceau unique et la microscopie à force de traction dans leurs études.
L’imagerie des mouchetures peut analyser la polymérisation de l’actine et le couplage d’embrayage. En outre, l’imagerie des mouchetures peut surveiller le flux rétrograde de molécules d’embrayage telles que la shootin1 et la cortactine, qui interagissent avec le flux rétrograde de F-actine. En utilisant un microscope TIRF, le flux rétrograde de la molécule d’adhésion cellulaire L1-CAM peut également être surveillé23,41; L1-CAM subit des comportements d’adhérence et de glissement qui reflètent l’efficacité de l’accouplement d’embrayage23,41. Bien que la présente étude utilise le système TMR-HaloTag pour l’imagerie des mouchetures, d’autres protéines fluorescentes, telles que l’EGFP et la protéine fluorescente rouge monomère, sont également disponibles dans l’analyse16,18,20,23,24,27,39. Les éléments essentiels pour visualiser les taches d’actine sont un faible niveau d’expression de l’actine fluorescente et l’éclairage d’une zone minimale (Figure 2). Dans ce protocole, les signaux Lifeact et HaloTag-actine sont acquis séquentiellement. Étant donné que l’écoulement rétrograde de l’actine est relativement lent (4,5 ± 0,1 μm/min)24, l’analyse du flux rétrograde de la F-actine et de la polymérisation de l’actine n’est pas affectée par l’acquisition séquentielle d’images de différents canaux fluorescents (intervalle ~1 s). Lifeact est un marqueur F-actine largement utilisé, mais peut rivaliser avec les protéines de liaison à l’actine47. Plus important encore, Lifeact peut modifier la dynamique de l’actine, affectant ainsi les structures de la F-actine et la morphologie cellulaire47,48,49.
La microscopie à force de traction peut détecter des forces pour stimuler l’avancement du cône de croissance. En montant les neurones dans une matrice extracellulaire, les chercheurs peuvent également analyser les forces générées dans un environnement semi-3D11. L’imagerie à fort grossissement est importante pour une quantification précise de la force de traction, car les cônes de croissance génèrent de faibles forces de traction7. Bien que d’autres méthodes avec des nanopiliers ou des biocapteurs sensibles au stress soient également utilisées pour mesurer la force de traction50,51, la méthode à base de gel PAA est très adaptable et permet d’ajuster la rigidité du substrat en faisant varier les concentrations d’acrylamide et de bis-acrylamide41,44,52. Dans ce protocole, le gel PAA est préparé à une concentration finale de 3,75% d’acrylamide et de 0,03% de bis-acrylamide; Le module de Young est d’environ 270 Pa22 et cette rigidité se situe dans la gamme du tissu cérébral (100-10 000 Pa)53,54,55. En raison de l’épaisseur du gel PAA (~100 μm), cette méthode limite l’utilisation de lentilles à fort grossissement pendant la microscopie. Pour obtenir des images à fort grossissement, les chercheurs doivent utiliser la fonction de zoom dans un microscope confocal à balayage laser.
En conclusion, la présente imagerie des mouchetures et la microscopie à force de traction permettent des analyses quantitatives des événements clés des générations de forces. Ces informations seront inestimables pour améliorer la compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’avancement et la navigation des cônes de croissance.

Dans le cerveau des vertébrés en développement, les neurones subissent des migrations soigneusement organisées et projettent des axones vers des partenaires synaptiques appropriés pour établir des réseaux neuronaux fonctionnels1,2,3. Les cônes de croissance, qui sont des structures sensorielles et mobiles situées à l’extrémité des neurites, déterminent la vitesse et la direction de la migration neuronale et de l’excroissance axonale3,4,5. Étant donné que les neurones sont entourés d’environnements serrés, les cônes de croissance doivent exercer des forces contre leur environnement pour avancer6,7. Pour comprendre les mécanismes sous-jacents à la migration neuronale et au guidage axonal, des analyses de la mécanique moléculaire pour l’avancement du cône de croissance sont essentielles.
Des décennies d’analyse ont révélé que la force de traction pour stimuler l’avance du cône de croissance est générée par le mécanisme d’embrayage; On pense que ce mécanisme fonctionne non seulement dans le cône de croissance axonal, mais aussi dans le cône de croissance du processus principal des neurones migrateurs8,9,10,11,12. À savoir, les filaments d’actine (F-actines) dans les cônes de croissance polymérisent au bord d’attaque et se dépolymérent proximalement, poussant la membrane de bord d’attaque13,14,15. La force résultante, en conjonction avec la contraction de l’actomyosine, induit un mouvement vers l’arrière des F-actines appelé écoulement rétrograde7,11,16,17,18,19,20,21. Les molécules d’adhésion de l’embrayage et de la cellule interviennent dans le couplage mécanique entre l’écoulement rétrograde de la F-actine et le substrat adhésif et transmettent la force de l’écoulement de la F-actine sur le substrat, générant ainsi une force de traction pour l’avance du cône de croissance7,8,9,11,12,22 . Parallèlement, le couplage actine-substrat réduit la vitesse d’écoulement de la F-actine et convertit la polymérisation de l’actine en force pour faire saillie la membrane de pointe9,10.
Les cônes de croissance axonale détectent les signaux chimiques locaux et les transduisent en une force motrice directionnelle pour la navigation des cônes de croissance3,23,24,25. Par exemple, une molécule de guidage axonale nétrine-1 stimule son récepteur supprimé dans le cancer colorectal (DCC) et active la protéine de contrôle de la division cellulaire 42 (Cdc42) et le substrat 1 de la toxine botulique C3 liée à Ras (Rac1), ainsi que leur kinase 1 activée par la kinase p21 en aval (Pak1)26. Cdc42 et Rac1 favorisent 1) la polymérisation de l’actine, et Pak1 phosphoryle une molécule d’embrayage shootin122,26. Shootin1 interagit avec le flux rétrograde de F-actine via une protéine de liaison à l’actine cortactine27. Shootin1 interagit également avec la molécule d’adhésion cellulaire L1 (L1-CAM)20,24. La phosphorylation de Shootin1 augmente les affinités de liaison pour la cortactine et la L1-CAM, et améliore le couplage d’embrayage médié par la shootin1 24,27. Dans le cône de croissance, les activations asymétriques de la polymérisation de l’actine et du couplage d’embrayage augmentent 3) la force de traction sur le côté de la source de nétrine 1, générant ainsi une force motrice directionnelle pour le tournage du cône de croissance (Figure 1)24. Des recherches intensives au cours des dernières décennies en ce qui concerne la migration neuronale et le guidage axonal ont amélioré la compréhension des molécules de guidage, de leurs récepteurs et des cascades de signalisation en aval associées2,10,28,29,30. Cependant, les mécanismes moléculaires pour générer des forces pour l’avancement du cône de croissance commencent tout juste à être élucidés; cela peut être attribué à l’utilisation limitée des protocoles pour les analyses mécanobiologiques.
La présente étude décrit un protocole détaillé pour la surveillance de l’écoulement rétrograde de la F-actine par imagerie à moucheture unique16,18. La surveillance de l’écoulement rétrograde de la F-actine a été largement réalisée à l’aide de la microscopie à super-résolution, de la microscopie confocale à disque rotatif et de la microscopie à fluorescence par réflexion par interférence totale (TIRF)25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Le protocole de la présente étude, cependant, utilise un microscope à épifluorescence standard et est donc facilement adoptable11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. Lorsqu’elle est combinée au marquage F-actine par Lifeact43, l’imagerie à tache unique permet de quantifier le taux de polymérisation de l’actine et l’efficacité du couplage d’embrayage entre le flux rétrograde de F-actine et le substrat adhésif39,42. La présente étude décrit en outre un protocole détaillé de microscopie à force de traction utilisant un gel de polyacrylamide (PAA) incorporé dans des billes fluorescentes11,22,23,24,27,39,41,42,44. Cette méthode détecte et quantifie la force de traction sous le cône de croissance en surveillant les mouvements de billes induits par la force44,45. Un code d’analyse de la force de traction open source est fourni et la méthode de quantification de la force de traction pendant la migration du cône de croissance est expliquée en détail. À l’aide de l’imagerie à faisceau unique et de la microscopie à force de traction, la compréhension de la mécanique moléculaire sous-jacente à la migration et à la navigation des cônes de croissance sera facilitée. Ces techniques sont également applicables pour analyser la mécanique moléculaire sous-jacente à l’élargissement de la colonne vertébrale dendritique, qui est connu pour être important dans l’apprentissage et la mémoire42.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% trypan blue stain solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00809-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albmine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421787-9970-799</td>
			<td>Objective lens (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (diameter 18 mm)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C018001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16806-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open source software package</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>carboxylate-modified microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (14 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1130H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (27 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882-10X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBO103 W/2</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300382128</td>
			<td>Mercury lamp (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution from mouse EHS tumor</td>
			<td>Wako</td>
			<td>120-05751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16919-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Conforcal laser microscope (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB2018a</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse C57BL/6</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse neuron nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>22402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>AAD-1001</td>
			<td>Electroporation apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td>CMOS camera (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26036-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parallel Computing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>1528177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFN21A-HaloTag-actin</td>
			<td>(Minegishi et al., 2018)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420790-9901-000</td>
			<td>Objective lens (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td>
			<td>(Kastian et al., 2021)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slulfo-SAMPHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08933-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrate (NaOH)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>Sako tekkou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2009</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (single speckle imaging)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance

Pour établir des réseaux fonctionnels, les neurones doivent migrer vers leurs destinations appropriées, puis étendre les axones vers leurs cellules cibles. Ces processus dépendent des progrès des cônes de croissance situés à l’extrémité des neurites. Les cônes de croissance axonale génèrent des forces motrices en détectant leur microenvironnement local et en modulant la dynamique du cytosquelette et le couplage actine-adhérence (couplage embrayage). Des décennies de recherche ont conduit à l’identification de molécules de guidage, de leurs récepteurs et de cascades de signalisation en aval pour réguler la migration neuronale et le guidage axonal; cependant, les mécanismes moléculaires nécessaires pour générer des forces pour stimuler l’avancement et la navigation du cône de croissance commencent tout juste à être élucidés. Au bord d’attaque des cônes de croissance neuronale, les filaments d’actine subissent un écoulement rétrograde, qui est alimenté par la polymérisation de l’actine et la contraction de l’actomyosine. Un couplage d’embrayage entre l’écoulement rétrograde de F-actine et le substrat adhésif génère des forces de traction pour l’avancement du cône de croissance. La présente étude décrit un protocole détaillé pour la surveillance de l’écoulement rétrograde de la F-actine par imagerie à moucheture unique. Il est important de noter que lorsqu’elle est combinée avec un marqueur de F-actine Lifeact, cette technique peut quantifier 1) le taux de polymérisation de la F-actine et 2) l’efficacité du couplage d’embrayage entre l’écoulement rétrograde de la F-actine et le substrat adhésif. Les deux sont des variables critiques pour générer des forces pour l’avance et la navigation du cône de croissance. En outre, la présente étude décrit un protocole détaillé de microscopie à force de traction, qui peut quantifier 3) la force de traction générée par les cônes de croissance. Ainsi, en couplant les analyses de l’imagerie à une seule moucheture et de la microscopie à force de traction, les chercheurs peuvent surveiller la mécanique moléculaire sous-jacente à l’avancement et à la navigation des cônes de croissance.

Imagerie à moucheture unique pour quantifier le taux de polymérisation de l’actine et l’efficacité du couplage d’embrayage Une expression Lifeact élevée permet la visualisation de la F-actine dans le cône de croissance; une faible expression de HaloTag-actine permet de surveiller l’écoulement rétrograde de la F-actine (Figure 3, Fichier supplémentaire 2). Le traçage des taches d’actine permet de mesurer la vitesse d’écoulement de la F-actine (Figure 3C,D). Étant donné que le couplage mécanique de l’écoulement rétrograde de F-actine et du substrat adhésif réduit la vitesse d’écoulement de F-actine, l’efficacité du couplage d’embrayage peut être estimée à partir de la vitesse. De plus, le marquage de la F-actine avec Lifeact facilite la visualisation de l’extension de la F-actine et est utile pour quantifier le taux de polymérisation de l’actine (Figure 3E,F).
Analyse quantitative de la force de traction Le strict respect de la méthodologie présentée ici révélera les mouvements des billes fluorescentes sous le cône de croissance (Figure 6C, Fichier supplémentaire 4). L’écoulement rétrograde de la F-actine sur le substrat génère une force de traction qui fait que les billes fluorescentes se déplacent vers l’arrière sous le cône de croissance. Le code d’analyse de la force de traction estime la force de traction due au déplacement des billes fluorescentes et exprime la force de traction calculée sous forme de vecteur de force. La direction et l’amplitude de la force de traction sont déterminées à partir des composantes x et y du vecteur force (Figure 8C,D). La case rouge de la figure 8D représente les composantes x et y d’un vecteur de force; La figure 8C représente le cône de croissance correspondant. En termes de coordonnées x-y, le vecteur pointe à -93,8° par rapport à l’axe des x ; cette orientation est dirigée vers l’arrière du cône de croissance (figure 8C). L’amplitude de la force de traction F a été calculée comme suit :
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg">
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg"> Figure 1 : Une machine à cône de croissance pour la génération de force et la navigation dans les cônes de croissance. Un gradient chimioattractif de nétrine-1 induit une stimulation asymétrique de son récepteur DCC sur un cône de croissance axonal. Cela active Rac1 et Cdc42, ainsi que leur kinase en aval Pak1. Rac1 et Cdc42 favorisent (1) la polymérisation de l’actine, tandis que Pak1 phosphoryle la shootin1, améliorant le couplage d’embrayage médié par la shootine1 (2). L’activation asymétrique de la dynamique de l’actine et le couplage d’embrayage à l’intérieur du cône de croissance augmentent (3) la force de traction du côté de la source de nétrine-1, générant ainsi une force motrice directionnelle pour l’attraction du cône de croissance. Les protocoles présentés ici permettent de quantifier les variables clés (1)-(3) pour la navigation des cônes de croissance. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg"> Figure 2 : Images de fluorescence d’un cône de croissance neuronale sous un diaphragme entièrement ouvert et rétréci. Le cône de croissance exprime Lifeact et HaloTag-actin. (A) Une expression Lifeact élevée permet de visualiser la morphologie du cône de croissance. D’autre part, les niveaux d’expression de HaloTag-actine sont très faibles, avec des signaux faibles lorsque le diaphragme est complètement ouvert. (B) Lorsque le diaphragme est correctement rétréci, les signaux de fond diminuent et des taches d’actine simples apparaissent dans le cône de croissance. Barres d’échelle : 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg"> Figure 3: Étapes de quantification de la vitesse d’écoulement de la F-actine et du taux de polymérisation de l’actine à l’aide d’un logiciel de traitement et d’analyse d’images Fidji. (A) Ajuster l’angle de l’image pour l’analyse. (1) Trouvez et sélectionnez une tache d’actine (pointe de flèche) qui s’écoule dans un faisceau de F-actine. (2) Sélectionnez Image > Transformer > Faire pivoter. (3) Réglez l’angle de manière à ce que le faisceau F-actine soit dirigé vers le haut. (4) L’angle de l’image sera modifié. (B) Délimiter la région, y compris la tache d’actine et le faisceau d’actine F. (1) Cliquez sur Rectangle dans la barre d’outils. (2) Délimitez une région sur l’image. La luminosité et le contraste de l’image sont augmentés pour permettre une visualisation claire de la tache d’actine et de la pointe du faisceau f-actine. (3) Sélectionnez Image > Dupliquer. (4) Entrez les cinq intervalles de temps qui montrent l’écoulement des taches d’actine dans le faisceau de f-actine. (5) L’image de pile sélectionnée apparaîtra à l’écran. (C) Cercles superposés sur la moucheture d’actine. (1) Cliquez sur Ovale dans la barre d’outils. (2) Dessinez un cercle sur une tache d’actine. (3) Sélectionnez Image > Superposition > Ajouter une sélection. (4) Le cercle est superposé. 5) Répétez la superposition des cercles sur les taches d’actine restantes. (D) Mesurer la distance de translocation des mouchetures d’actine au cours des cinq périodes. (1) Cliquez sur Directement dans la barre d’outils. (2) Tracez une ligne qui relie les centres des cercles. (3) Sélectionnez Analyser > mesure. Le résultat, indiqué par le paramètre Height (boîte rouge), relaie la distance de translocation de la moucheture d’actine. (E) Mesurer la variation de la longueur de la saillie de F-actine au cours des cinq périodes. (1) Tracez une ligne qui relie les extrémités de la saillie F-actine. (2) Sélectionnez Analyser > mesure. Le résultat (boîte rouge), Hauteur, indique la longueur d’extension du faisceau F-actine. (F) Le taux de polymérisation de l’actine est calculé à partir de la somme de la vitesse d’écoulement de la F-actine et de la vitesse d’extension. Voir aussi le fichier supplémentaire 2. Le dossier supplémentaire 3 aide les enquêteurs à mettre en pratique la méthodologie décrite ci-dessus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg"> Figure 4 : Étapes de préparation du gel PAA. Veuillez consulter l’étape 7.1 pour une description détaillée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg"> Figure 5 : Détermination de la rigidité du gel PAA. (A) Méthode d’indentation de la microsphère. Lorsqu’une microsphère est placée sur un gel PAA incorporé dans des billes fluorescentes, le poids de la microsphère provoque une indentation dans le gel. La profondeur d’indentation est calculée en soustrayant les positions z de la surface du gel PAA du fond de la microsphère (B,C) Images de fluorescence d’un gel PAA indenté par une microsphère et contenant des billes fluorescentes. Un microscope confocal à balayage laser a été utilisé pour capturer des images de la surface du gel (B) et du fond de la microsphère (C). Les signaux des billes fluorescentes ne sont pas visibles à la surface du gel dans la région en retrait (B, cercle). Ils peuvent cependant être observés au fond de la microsphère. Barres d’échelle : 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg"> Figure 6 : Cartographie de la force d’un cône de croissance neuronale. (A-C) Images de fluorescence de perles incorporées dans un gel PAA et d’un cône de croissance neurale visualisées avec EGFP. Après l’acquisition d’images time-lapse (A), le neurone a été libéré du substrat de gel en appliquant une solution SDS, et une image des perles dans le substrat non contraint a été capturée (B). (C) L’image des perles dans le substrat non contraint montre les perles dans leurs positions d’origine (vert) et déplacées (rouge). Le signal EGFP du cône de croissance est représenté en bleu. Les kymographes (à droite) montrent les mouvements des perles à des intervalles de 3 s pendant une durée de 147 s, indiqués par les flèches dans les zones encadrées 1 et 2. La perle dans la zone 2 est une perle de référence. Barres d’échelle : 2 μm pour (A), (B) et (C, à gauche), et 1 μm pour (C, au milieu). Voir aussi le fichier supplémentaire 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg"> Figure 7: Étapes pour corriger la position x-y de l’image de perle dans un substrat non contraint à l’aide de Fidji. (A) Concaténer l’image de perle dans un substrat non contraint avec l’image de pile time-lapse de perles fluorescentes. (1) Sélectionnez Piles d’images > > Outils > Concaténer. (2) Sélectionnez l’image des perles dans un substrat non contraint et l’image de pile time-lapse des perles fluorescentes dans Image1 et Image2, respectivement. Cliquez sur OK. (3) L’image de perle dans le substrat non contraint est ajoutée à l’image de la pile time-lapse. (B) Corriger la position x-y de l’image de la perle fluorescente. (1) Utilisez la barre de défilement (cadre rouge) pour sélectionner la deuxième image (flèche rouge) dans la pile d’images. (2) Sélectionnez Plugins > StackReg. (3) Sélectionnez Corps rigide dans la liste déroulante (cadre rouge) et cliquez sur OK. La correction de la position x-y va commencer. (C) Enregistrez l’image de perle corrigée de la position x-y. Après avoir sélectionné la première image de l’image de pile corrigée de position x-y, (1) sélectionnez Image > Dupliquer. (2) entrez 1 dans la plage et désélectionnez Pile en double. Cliquez ensuite sur OK. (3) l’image de perle corrigée de la position x-y dans le substrat non contraint apparaîtra à l’écran. Enregistrez cette image en tant que fichier tiff. Le dossier supplémentaire 6 aide les enquêteurs à mettre en pratique la méthodologie décrite ci-dessus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg"> Figure 8 : Analyse de la force de traction sous un cône de croissance neuronal à l’aide d’un code d’analyse de force de traction open source. (A) GUI pour analyser la force de traction. Les images time-lapse sélectionnées sur l’interface graphique peuvent être confirmées dans la liste déroulante et avec le curseur indiqué (boîte rouge). (B) Sélectionnez une région qui inclut le cône de croissance. (1) Cliquez sur ROI sur l’interface graphique. Avec le curseur de la souris, spécifiez deux points (pointes de flèche) sur l’image de la cellule. (2) Une boîte rouge apparaîtra sur l’image de la cellule. Deux clics déterminent l’emplacement de deux coins. (C) Sélectionnez les perles détectées (points blancs) sous le cône de croissance. (1) Sur l’interface graphique, cliquez sur Sélectionner les perles et délimitez une région polygonale qui inclut le cône de croissance en cliquant dessus. Appuyez sur la touche Entrée. (2) Les points blancs dans la région polygonale se transformeront en rouge. (D) Résultats calculés de la direction et de l’amplitude de la force de traction. La case rouge de la feuille de calcul représente les composantes x et y du vecteur de force, estimées par analyse de la force de traction. Sur la coordonnée x-y dans le panneau de droite, le vecteur force généré par le cône de croissance pointe à -93,8° par rapport à l’axe des x ; cette orientation est dirigée vers l’arrière du cône de croissance en (C). Le dossier supplémentaire 6 aide les enquêteurs à mettre en pratique la méthodologie décrite ci-dessus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Recettes de solutions et de supports utilisés dans cette étude. Voir le texte pour une utilisation détaillée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%201-63227R1.xlsx" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 2: Imagerie par fluorescence de Lifeact et imagerie par mouchetures fluorescentes de HaloTag-actine dans un cône de croissance nerveuse. Lifeact (vert) et HaloTag-actine (magenta). Les images ont été acquises toutes les 3 s pour une durée totale de 147 s. Barre d’échelle: 2 μm. Voir aussi Figure 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%202.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 3 : Données pratiques pour quantifier la vitesse d’écoulement de la F-actine et le taux de polymérisation de l’actine. Une image de pile time-lapse multicanal de Lifeact (vert) et HaloTag-actin (magenta). Voir aussi la figure 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental%20file%203.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 4 : Vidéo de cartographie de force détectant la force de traction au niveau d’un cône de croissance neuronale. Les positions d’origine (vert) et déplacées (rouge) des perles. Le signal EGFP dans le cône de croissance est représenté en bleu. Les images ont été acquises toutes les 3 s pendant 147 s. Barre d’échelle: 2 μm. Voir aussi la figure 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%204.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 5 : Code d’analyse de la force de traction. Veuillez consulter l’étape 8.12 pour une utilisation détaillée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%205.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Dossier supplémentaire 6 : Données pratiques pour quantifier la force de traction. Une image RVB monocanal des perles dans un substrat non contraint et un time-lapse monocanal empilent des images RVB de perles fluorescentes sous un cône de croissance, egFP et champ lumineux. Voir également les figures 7 et 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%206.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

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Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video (Video) | JoVE

Pour avancer, les cônes de croissance doivent exercer des forces de traction contre l’environnement extérieur. La génération de forces de traction dépend de la dynamique de l’actine et de l’accouplement de l’embrayage. La présente étude décrit des méthodes d’analyse de la dynamique de l’actine, du couplage d’embrayage et des forces de traction pour l’avancement du cône de croissance.

Analyses de la dynamique de l’actine, de l’accouplement d’embrayage et de la force de traction pour l’avancement du cône de croissance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

L’analyse de couplage de l’imagerie à une seule moucheture et de la force de traction microscopique peut analyser les machines moléculaires pour l’avancement et la navigation du cône de croissance. Comme les techniques utilisent des matériaux disponibles dans le commerce et des microscopes standard. Les chercheurs peuvent littéralement s’adapter aux techniques de leurs études.Commencez par traiter les neurones avec de la tétraméthyl-rhodamine ou du ligand TMR à une dilution de un à 2000 dans un milieu de culture le jour in vitro 3. Ensuite, maintenez les neurones à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pendant une heure. Après l’incubation, lavez le ligand TMR trois fois avec du PBS préchauffé.Retirez le PBS avant d’ajouter 0,5 millilitre de milieu L-15 de Leibovitz réchauffé dans les neurones. Maintenez les neurones à 37 degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, allumez un microscope à épifluorescence et réglez l’incubateur supérieur de l’État à 37 degrés Celsius.Placez ensuite les neurones traités par ligand TMR dans la boîte inférieure en verre de l’incubateur supérieur chauffé. Réglez les paramètres d’acquisition d’image tels que le temps d’exposition à 500 millisecondes pour un canal de fluorescence Lifeact et HaloTag-actine et binning comme 0,065 micron par 0,065 micron par pixel à un intervalle de temps de trois secondes pour 50 images. Après avoir sélectionné un cône de croissance qui exprime fortement Lifeact et exprime chaque semaine HaloTag-actine.Fermez le champ sur le diaphragme pour éclairer une zone minimale qui comprend le cône de croissance et acquérir des images en accéléré. Le jour in vitro 3, remplacez le milieu de culture par 0,5 millilitre de milieu L-15 de Leibovitz réchauffé et maintenez les neurones pendant une heure à 37 degrés Celsius. Pour la microscopie à force de traction, allumez un microscope confocal à balayage laser et réglez l’incubateur supérieur de la scène à 37 degrés Celsius.Placez les neurones sur la boîte inférieure en verre de l’incubateur supérieur pré-averti. Définissez les paramètres d’acquisition d’image comme décrit dans le script de menu et sélectionnez un cône de croissance qui exprime fortement la protéine de fluorescence verte améliorée ou EGFP. Concentrez-vous sur la surface du gel et acquérez des images time-lapse.Lorsque vous avez terminé, utilisez un logiciel de traitement d’image pour produire des piles d’images RVB time-lapses à canal unique. Enregistrez ensuite les images en tant que fichiers tiff. Ensuite, appliquez 100 microlitres de dodécylsulfate de sodium ou de FDS dissous dans de l’eau distillée de 10% en poids de volume pour détendre le substrat du gel en libérant les neurones du substrat.Ensuite, incubez le plat dans l’incubateur supérieur de la scène pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius pour stabiliser la température. Dans le microscope confocal à balayage laser, concentrez-vous sur la surface du gel pour acquérir une image des perles dans le substrat non contraint. Produisez une image RVB monocanal des perles dans le substrat non contraint et enregistrez cette image sous forme de fichier tiff.Téléchargez le code d’analyse de la force de traction TFM2021 et ouvrez TFM2021 dans MATLAB. Ouvrir le main. m dans TFM2021 et exécutez-le.Lorsqu’une interface utilisateur graphique apparaît à l’écran. Cliquez sur charger l’image du substrat non entraîné et sélectionnez l’image de perle corrigée de la position X-Y dans le substrat non entraîné. Allez charger des images de perles fluorescentes et sélectionnez la pile de perles d’image en accéléré.Cliquez ensuite sur charger des images en champ lumineux pour choisir l’image de pile time-lapse de champ lumineux et utilisez charger des images GFP pour sélectionner l’image de pile time-lapse d’EGFP. Dans la liste déroulante de l’interface utilisateur graphique, sélectionnez GFP avant de cliquer sur ROI pour spécifier la région rectangulaire d’intérêt, y compris le cône de croissance, en cliquant sur deux points sur l’image de cellule affichée. Une fois cela fait, cliquez sur le bouton Enregistrer de l’interface utilisateur graphique pour enregistrer les images de pile sélectionnées avec le retour sur investissement dans un fichier mat.Ensuite, cliquez sur détection ponctuelle et entrez une valeur souhaitée dans la boîte de dialogue pour déterminer un seuil de détection de perles. Appuyez sur OK pour commencer le calcul. Une fois le calcul terminé, cliquez sur la piste de tracé pour agrandir la région sélectionnée précédemment et afficher les perles détectées sous forme de points blancs.Utilisez des perles sélectionnées pour délimiter une région polygonale qui inclut les points corrects sous le cône de croissance. Ensuite, en appuyant sur Entrée sur le clavier, les points blancs dans la région polygonale passeront au rouge. Cliquez sur estimer la force dans l’interface utilisateur graphique.Entrez ensuite des valeurs pour la taille des pixels et le module de Young comme expliqué dans le manuscrit. Mettez la valeur du ratio de Poisson à 0,3 et exécutez la force d’estimation pour lancer le calcul. Le logiciel enregistrera les résultats de calcul dans un fichier au format feuille de calcul.Les images de fluorescence d’un cône de croissance neuronale ont montré une expression Lifeact élevée permettant la visualisation de la morphologie du cône de croissance sous un diaphragme entièrement ouvert et étroit. Les niveaux d’expression de HaloTag-actine étaient très faibles avec des signaux faibles. Lorsque le diaphragme est correctement rétréci, les signaux de fond diminuent et un seul acte en mouchetures apparaît dans le cône de croissance.Les chercheurs qui réalisent correctement toutes les étapes observeront l’écoulement rétrograde de la F-actine dans le cône de croissance. La rigidité du gel de polyacrylamide a été déterminée en calculant la profondeur d’indentation causée par le poids de la microsphère. Un microscope confocal à balayage laser a été utilisé pour capturer des images de la surface du gel et du fond de la microsphère.Les signaux des billes fluorescentes n’étaient pas visibles à la surface du gel dans la région en retrait. Les images de fluorescence des perles incorporées dans le gel de polyacrylamide et le cône de croissance neurale ont montré les perles dans leur origine et leurs positions déplacées. Le signal EGFP du cône de croissance a également été observé.Les kymographes affichaient les mouvements de la perle par rapport à une perle de référence. Lors de l’exécution d’une seule imagerie de mouchetures, il est important de sélectionner un neurone qui exprime chaque semaine comment agir sous deux une zone minimale. Lors de la microscopie à force de traction, l’imagerie à fort grossissement est importante pour une concentration précise de la force de traction.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones Video (Video) | JoVE

Etiquetage F-actine se termine avec des barbelés rhodamine-actine dans les cônes de croissance neuronale perméabilisées

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

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Analyses morphométriques des sections rétiniennes

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

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There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

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À long terme de suivi comportemental de librement piscine faiblement poisson électrique

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

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Cytométrie en flux pour les protocoles surface et intracellulaire Antigen analyses des types cellulaires de neurones

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

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Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

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The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

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Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

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Visualisation de la croissance axonale cône effondrement et effets précoces de β-amyloïde dans des neurones cultivés de souris

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