Name: analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
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Diese Forschung wurde teilweise von AMED unter der Fördernummer 21gm0810011h0005 (N.I. und Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) und JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), der Osaka Medical Research Foundation for Incurable Diseases (T.M.) und dem NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.) unterstützt.

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Die in dieser Studie beschriebenen Protokolle verwenden kommerziell verfügbare Materialien und Mikroskopiegeräte, die routinemäßig in allen Labors, Instituten und Universitäten zu finden sind. Daher können Forscher die vorliegende Einzelfleckenbildgebung und Zugkraftmikroskopie leicht in ihre Studien einbeziehen.
Die Speckle-Bildgebung kann Aktinpolymerisation und Kupplungskopplung analysieren. Darüber hinaus kann die Speckle-Bildgebung den retrograden Fluss von Kupplungsmolekülen wie Shootin1 und Cortactin überwachen, die mit dem retrograden F-Aktin-Fluss interagieren. Mit einem TIRF-Mikroskop kann auch der retrograde Fluss des Zelladhäsionsmoleküls L1-CAM überwacht werden23,41; L1-CAM erfährt ein Griff- und Schlupfverhalten, das die Effizienz der Kupplungskupplung widerspiegelt23,41. Obwohl die vorliegende Studie das TMR-HaloTag-System für die Speckle-Bildgebung verwendet, sind auch andere fluoreszierende Proteine wie EGFP und monomeres rot fluoreszierendes Protein in der Analyse verfügbar16,18,20,23,24,27,39. Die Grundlagen für die Visualisierung von Aktinflecken sind ein niedriges Expressionsniveau von fluoreszierendem Aktin und die Beleuchtung einer minimalen Fläche (Abbildung 2). In diesem Protokoll werden Lifeact- und HaloTag-Aktinsignale nacheinander erfasst. Da der retrograde Aktinfluss relativ langsam ist (4,5 ± 0,1 μm/min)24, wird die Analyse des retrograden F-Aktinflusses und der Aktinpolymerisation durch die sequentielle Bildaufnahme verschiedener Fluoreszenzkanäle (~1 s-Intervall) nicht beeinflusst. Lifeact ist ein weit verbreiteter F-Aktin-Marker, kann aber mit Aktin-bindenden Proteinen konkurrieren47. Von weiterer Bedeutung ist, dass Lifeact die Aktindynamik verändern kann, wodurch F-Aktinstrukturen und die Zellmorphologie beeinflusst werden47,48,49.
Die Zugkraftmikroskopie kann Kräfte erkennen, um den Wachstumskegelvorschub voranzutreiben. Durch die Montage der Neuronen in einer extrazellulären Matrix können die Forscher auch Kräfte analysieren, die in einer Semi-3D-Umgebung erzeugt werden11. Die Bildgebung mit hoher Vergrößerung ist wichtig für die genaue Quantifizierung der Zugkraft, da Wachstumskegel schwache Zugkräfte erzeugen7. Obwohl auch andere Methoden mit Nanosäulen oder spannungsempfindlichen Biosensoren zur Messung der Zugkraft verwendet werden50,51, ist die PAA-Gel-basierte Methode sehr anpassungsfähig und ermöglicht die Einstellung der Substratsteifigkeit durch Variation der Konzentrationen von Acrylamid und Bisacrylamid41,44,52. In diesem Protokoll wird das PAA-Gel in einer Endkonzentration von 3,75% Acrylamid und 0,03% Bisacrylamid hergestellt; Der Elastizitätsmodul beträgt ~ 270 Pa22 und diese Steifigkeit liegt im Bereich des Hirngewebes (100-10.000 Pa) 53,54,55. Aufgrund der Dicke des PAA-Gels (~100 μm) schränkt diese Methode die Verwendung von Linsen mit hoher Vergrößerung während der Mikroskopie ein. Um Bilder mit hoher Vergrößerung zu erhalten, sollten Forscher die Zoomfunktion in einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop verwenden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die vorliegende Speckle-Bildgebung und die Zugkraftmikroskopie quantitative Analysen der Schlüsselereignisse in der Krafterzeugung ermöglichen. Diese Informationen werden von unschätzbarem Wert sein, um das Verständnis der Mechanismen zu verbessern, die dem Fortschritt und der Navigation des Wachstumskegels zugrunde liegen.

Im sich entwickelnden Wirbeltiergehirn durchlaufen Neuronen aufwendig organisierte Migrationen und projizieren Axone in Richtung geeigneter synaptischer Partner, um funktionelle neuronale Netzwerke aufzubauen1,2,3. Wachstumskegel, die sensorische und bewegliche Strukturen an der Spitze von Neuriten sind, bestimmen die Geschwindigkeit und Richtung der neuronalen Migration und des Axonauswuchses3,4,5. Da Neuronen von dicht gedrängten Umgebungen umgeben sind, müssen Wachstumszapfen Kräfte gegen ihre Umgebung ausüben, um sich vorwärts zu bewegen6,7. Um die Mechanismen zu verstehen, die der neuronalen Migration und der axonalen Führung zugrunde liegen, sind Analysen der molekularen Mechanik für den Wachstumskegelfortschritt unerlässlich.
Jahrzehntelange Analysen haben ergeben, dass die Zugkraft zur Förderung des Wachstumskegels durch den "Kupplungsmechanismus" erzeugt wird. Es wird angenommen, dass dieser Mechanismus nicht nur im axonalen Wachstumskegel funktioniert, sondern auch im führenden Prozesswachstumskegel wandernder Neuronen8,9,10,11,12. Aktinfilamente (F-Aktine) in Wachstumskegeln polymerisieren nämlich an der vorderen Kante und depolymerisieren proximal, wodurch die vordere Membran herausgedrückt wird13,14,15. Die resultierende Kraft induziert in Verbindung mit der Actomyosinkontraktion eine Rückwärtsbewegung von F-Aktinen, die als retrograder Fluss bezeichnet werden7,11,16,17,18,19,20,21. Kupplungs- und Zelladhäsionsmoleküle vermitteln die mechanische Kopplung zwischen F-Aktin retrogradem Fluss und dem Klebstoffsubstrat und übertragen die Kraft des F-Aktinflusses auf das Substrat, wodurch Zugkraft für den Wachstumskegelfortschritt erzeugt wird7,8,9,11,12,22 . Gleichzeitig reduziert die Aktin-Substrat-Kopplung die F-Aktin-Strömungsgeschwindigkeit und wandelt die Aktinpolymerisation in die Kraft um, die die vordere Membran hervorsteht9,10.
Axonale Wachstumskegel spüren lokale chemische Hinweise und wandeln sie in eine richtungsweisende treibende Kraft für die Wachstumskegelnavigation um3,23,24,25. Zum Beispiel stimuliert ein Axon-Leitmolekül Netrin-1 seinen Rezeptor, der bei Darmkrebs (DCC) gelöscht wurde, und aktiviert die Rho-Guanosintriphosphat (GTP)-bindenden Proteine Zellteilungskontrollprotein 42 (Cdc42) und Ras-assoziiertes C3-Botulinumtoxinsubstrat 1 (Rac1) und ihre nachgeschaltete Kinase p21-aktivierte Kinase 1 (Pak1) 26. Cdc42 und Rac1 fördern 1) Aktinpolymerisation, und Pak1 phosphoryliert ein Kupplungsmolekül Shootin122,26. Shootin1 interagiert mit dem retrograden F-Aktin-Fluss über ein Aktin-bindendes Protein Cortactin27. Shootin1 interagiert auch mit dem L1-Zelladhäsionsmolekül (L1-CAM)20,24. Die Shootin1-Phosphorylierung erhöht die Bindungsaffinitäten für Cortactin und L1-CAM und verbessert die Shootin1-vermittelte 2)-Kupplungskopplung24,27. Innerhalb des Wachstumskegels erhöhen asymmetrische Aktivierungen der Aktinpolymerisation und der Kupplungskopplung 3) die Zugkraft auf der Seite der Netrin-1-Quelle und erzeugen dadurch eine gerichtete Antriebskraft für die Wachstumskegeldrehung (Abbildung 1)24. Die intensive Forschung der letzten Jahrzehnte in Bezug auf neuronale Migration und Axonführung hat das Verständnis von Leitmolekülen, ihren Rezeptoren und den damit verbundenen nachgeschalteten Signalkaskaden verbessert2,10,28,29,30. Die molekularen Maschinen zur Erzeugung von Kräften für den Wachstumskegelfortschritt beginnen jedoch gerade erst, aufgeklärt zu werden; dies kann auf die begrenzte Verwendung der Protokolle für mechanobiologische Analysen zurückgeführt werden.
Die vorliegende Studie beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Überwachung des retrograden F-Aktin-Flusses durch Single-Speckle-Bildgebung16,18. Die Überwachung des retrograden F-Aktin-Flusses wurde ausgiebig mit hochauflösender Mikroskopie, Spinnscheiben-Konfokalmikroskopie und TIRF-Mikroskopie (Total Interference Reflection Fluorescence) durchgeführt25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Das Protokoll in der vorliegenden Studie verwendet jedoch ein Standard-Epifluoreszenzmikroskop und ist daher leicht zu übernehmen11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. In Kombination mit der F-Aktin-Markierung durch Lifeact43 ermöglicht die Single-Speckle-Bildgebung eine Quantifizierung der Aktinpolymerisationsrate und der Kupplungskopplungseffizienz zwischen dem retrograden F-Aktin-Fluss und dem Klebstoffsubstrat39,42. Die vorliegende Studie beschreibt ferner ein detailliertes Protokoll der Zugkraftmikroskopie unter Verwendung eines fluoreszierenden, in Die Perle eingebetteten Polyacrylamid (PAA)-Gels11,22,23,24,27,39,41,42,44. Diese Methode erkennt und quantifiziert die Zugkraft unter dem Wachstumskegel durch Überwachung der kraftinduzierten Perlenbewegungen44,45. Ein Open-Source-Zugkraftanalysecode wird bereitgestellt, und die Methode zur Quantifizierung der Zugkraft während der Wachstumskegelmigration wird ausführlich erläutert. Mit Hilfe der Einzelfleckenbildgebung und der Zugkraftmikroskopie wird das Verständnis der molekularen Mechanik, die der Migration und Navigation von Wachstumskegeln zugrunde liegt, erleichtert. Diese Techniken sind auch zur Analyse der molekularen Mechanik anwendbar, die der dendritischen Wirbelsäulenvergrößerung zugrunde liegt, von der bekannt ist, dass sie für das Lernen und das Gedächtnis wichtig ist42.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% trypan blue stain solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00809-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albmine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421787-9970-799</td>
			<td>Objective lens (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (diameter 18 mm)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C018001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16806-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open source software package</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>carboxylate-modified microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (14 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1130H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (27 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882-10X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBO103 W/2</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300382128</td>
			<td>Mercury lamp (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution from mouse EHS tumor</td>
			<td>Wako</td>
			<td>120-05751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16919-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Conforcal laser microscope (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB2018a</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse C57BL/6</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse neuron nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>22402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>AAD-1001</td>
			<td>Electroporation apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td>CMOS camera (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26036-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parallel Computing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>1528177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFN21A-HaloTag-actin</td>
			<td>(Minegishi et al., 2018)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420790-9901-000</td>
			<td>Objective lens (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td>
			<td>(Kastian et al., 2021)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slulfo-SAMPHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08933-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrate (NaOH)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>Sako tekkou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2009</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (single speckle imaging)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance

Um funktionelle Netzwerke aufzubauen, müssen Neuronen zu ihren entsprechenden Zielen wandern und dann Axone in Richtung ihrer Zielzellen ausdehnen. Diese Prozesse hängen von den Fortschritten der Wachstumskegel ab, die sich an den Spitzen der Neuriten befinden. Axonale Wachstumskegel erzeugen treibende Kräfte, indem sie ihre lokale Mikroumgebung wahrnehmen und die Zytoskelettdynamik und Aktinadhäsionskopplung (Kupplungskopplung) modulieren. Jahrzehntelange Forschung hat zur Identifizierung von Leitmolekülen, ihren Rezeptoren und nachgeschalteten Signalkaskaden zur Regulierung der neuronalen Migration und der axonalen Führung geführt; Die molekularen Maschinen, die zur Erzeugung von Kräften erforderlich sind, um den Wachstumskegelvorschub und die Navigation voranzutreiben, werden jedoch gerade erst aufgeklärt. An der Vorderkante neuronaler Wachstumskegel durchlaufen Aktinfilamente einen retrograden Fluss, der durch Aktinpolymerisation und Actomyosinkontraktion angetrieben wird. Eine Kupplungskopplung zwischen F-Aktin retrogradem Flow und Klebesubstrat erzeugt Zugkräfte für den Wachstumskegelvorschub. Die vorliegende Studie beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Überwachung des retrograden F-Aktinflusses durch Single-Speckle-Bildgebung. Wichtig ist, dass diese Technik in Kombination mit einem F-Aktin-Marker Lifeact 1) die F-Aktin-Polymerisationsrate und 2) die Kupplungskopplungseffizienz zwischen dem retrograden F-Aktin-Fluss und dem Klebstoffsubstrat quantifizieren kann. Beides sind kritische Variablen für die Erzeugung von Kräften für den Wachstumskegelvorschub und die Navigation. Darüber hinaus beschreibt die vorliegende Studie ein detailliertes Protokoll der Zugkraftmikroskopie, das 3) die von Wachstumskegeln erzeugte Zugkraft quantifizieren kann. Durch die Kopplung der Analysen der Einzelfleckenbildgebung und der Zugkraftmikroskopie können die Forscher die molekulare Mechanik überwachen, die dem Wachstumskegelfortschritt und der Navigation zugrunde liegt.

Single-Speckle-Bildgebung zur Quantifizierung der Aktinpolymerisationsrate und der Kupplungskupplungseffizienz Eine hohe Lifeact-Expression ermöglicht die Visualisierung von F-Aktin innerhalb des Wachstumskegels; Eine niedrige HaloTag-Aktin-Expression ermöglicht die Überwachung des retrograden F-Aktin-Flusses (Abbildung 3, Ergänzende Datei 2). Die Verfolgung der Aktinflecken ermöglicht die Messung der F-Aktin-Strömungsgeschwindigkeit (Abbildung 3C,D). Da die mechanische Kopplung von F-Aktin retrograder Strömung und dem Klebesubstrat die F-Aktin-Strömungsgeschwindigkeit reduziert, kann die Kupplungskupplungseffizienz aus der Geschwindigkeit abgeschätzt werden. Darüber hinaus hilft die F-Aktin-Markierung mit Lifeact bei der Visualisierung der F-Aktin-Extension und ist nützlich für die Quantifizierung der Aktinpolymerisationsrate (Abbildung 3E,F).
Quantitative Analyse der Zugkraft Die strikte Einhaltung der hier vorgestellten Methodik zeigt die Bewegungen der fluoreszierenden Kügelchen unter dem Wachstumskegel (Abbildung 6C, Supplemental File 4). Die retrograde F-Aktin-Strömung auf das Substrat erzeugt eine Zugkraft, wodurch sich die fluoreszierenden Kügelchen unter dem Wachstumskegel nach hinten bewegen. Der Zugkraftanalysecode schätzt die Zugkraft aus der Fluoreszenzperlenverschiebung und drückt die berechnete Zugkraft als Kraftvektor aus. Richtung und Größe der Zugkraft werden aus den x- und y-Komponenten des Kraftvektors bestimmt (Bild 8C,D). Das rote Kästchen in Abbildung 8D stellt die x- und y-Komponenten eines Kraftvektors dar. Abbildung 8C zeigt den entsprechenden Wachstumskegel. In Bezug auf x-y-Koordinaten zeigt der Vektor auf -93,8° gegenüber der x-Achse; diese Ausrichtung ist auf die Rückseite des Wachstumskegels gerichtet (Abbildung 8C). Die Größe der Zugkraft F wurde wie folgt berechnet:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg">
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg"> Abbildung 1: Eine Wachstumskegelmaschinerie zur Krafterzeugung und Wachstumskegelnavigation. Ein netrin-1 chemoattraktiver Gradient induziert eine asymmetrische Stimulation seines Rezeptors DCC auf einem axonalen Wachstumskegel. Dies aktiviert Rac1 und Cdc42 und ihre nachgeschaltete Kinase Pak1. Rac1 und Cdc42 fördern (1) die Aktinpolymerisation, während Pak1 Shootin1 phosphoryliert und die Shootin1-vermittelte (2) Kupplungskopplung verstärkt. Die asymmetrische Aktivierung der Aktindynamik und der Kupplungskopplung innerhalb des Wachstumskegels erhöht (3) die Zugkraft auf der Seite der Netrin-1-Quelle und erzeugt dadurch eine gerichtete Antriebskraft für die Wachstumskegelanziehung. Die hier vorgestellten Protokolle erlauben die Quantifizierung der Schlüsselvariablen (1)-(3) für die Wachstumskegelnavigation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg"> Abbildung 2: Fluoreszenzbilder eines neuronalen Wachstumskegels unter einem vollständig geöffneten und verengten Zwerchfell. Der Wachstumskegel drückt Lifeact und HaloTag-Aktin aus. (A) Eine hohe Lifeact-Expression ermöglicht die Visualisierung der Wachstumskegelmorphologie. Auf der anderen Seite sind die HaloTag-Aktin-Expressionsniveaus sehr niedrig, mit schwachen Signalen, wenn die Membran vollständig geöffnet ist. (B) Wenn das Zwerchfell angemessen verengt ist, nehmen die Hintergrundsignale ab und einzelne Aktinflecken erscheinen im Wachstumskegel. Maßstabsbalken: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Schritte zur Quantifizierung der F-Aktin-F-Aktin-Strömungsgeschwindigkeit und Aktinpolymerisationsrate mit einer Bildverarbeitungs- und Analysesoftware Fidschi. (A) Passen Sie den Winkel des Bildes für die Analyse an. (1) Suchen und wählen Sie einen Aktinfleck (Pfeilspitze), der in einem F-Aktinbündel fließt. (2) Wählen Sie Bild > Transformieren > Drehen. (3) Stellen Sie den Winkel so ein, dass das F-Aktinbündel nach oben gerichtet ist. (4) Der Winkel des Bildes wird geändert. (B) Abgrenzung der Region, einschließlich des Aktinflecks und des F-Aktinbündels. (1) Klicken Sie in der Symbolleiste auf Rechteck. (2) Beschreiben Sie einen Bereich auf dem Bild. Die Helligkeit und der Kontrast des Bildes werden erhöht, um eine klare Visualisierung des Aktinflecks und der Spitze des F-Aktinbündels zu ermöglichen. (3) Wählen Sie Bild > Duplizieren. (4) Geben Sie die fünf Zeitrahmen ein, die den Aktin-Speckle-Fluss im F-Aktin-Bündel zeigen. (5) Das ausgewählte Stapelbild erscheint auf dem Bildschirm. (C) Überlagern Sie Kreise auf dem Aktinfleck. (1) Klicken Sie in der Symbolleiste auf Oval. (2) Zeichne einen Kreis auf einen Aktinfleck. (3) Wählen Sie Bild > Überlagerung > Auswahl hinzufügen. (4) Der Kreis wird überlagert. 5) Wiederholen Sie das Überlagern der Kreise auf den verbleibenden Aktinsprenkeln. (D) Messen Sie den Translokationsabstand von Aktinsprenkeln während der fünf Zeitrahmen. (1) Klicken Sie in der Symbolleiste auf Gerade. (2) Zeichne eine Linie, die die Mittelpunkte der Kreise verbindet. (3) Wählen Sie > Measure analysieren aus. Das Ergebnis, angezeigt durch den Parameter Höhe (rote Box), das den Aktin-Speckle-Translokationsabstand weitergibt. (E) Messen Sie die Änderung der Länge des F-Aktin-Vorsprungs während der fünf Zeitrahmen. (1) Zeichnen Sie eine Linie, die die Spitzen des F-Aktin-Vorsprungs verbindet. (2) Wählen Sie > Measure analysieren aus. Das Ergebnis (rotes Feld), Höhe, gibt die Verlängerungslänge des F-Aktinbündels an. (F) Die Aktinpolymerisationsrate wird aus der Summe der F-Aktin-Strömungsgeschwindigkeit und der Ausdehnungsrate berechnet. Siehe auch Ergänzende Datei 2. Ergänzende Akte 3 hilft den Ermittlern, die oben beschriebene Methodik zu üben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg"> Abbildung 4: Schritte für die PAA-Gel-Zubereitung. Eine detaillierte Beschreibung finden Sie in Schritt 7.1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg"> Abbildung 5: Bestimmung der PAA-Gelsteifigkeit. (A) Ein Mikrosphären-Eindringverfahren. Wenn eine Mikrokugel auf ein fluoreszierendes, in eine Perle eingebettetes PAA-Gel gelegt wird, verursacht das Gewicht der Mikrokugel eine Vertiefung im Gel. Die Eindringtiefe wird berechnet, indem die z-Positionen der PAA-Geloberfläche vom Boden der Mikrosphäre (B, C) subtrahiert werden Fluoreszenzbilder eines PAA-Gels, das von einer Mikrokugel eingerückt wird und fluoreszierende Kügelchen enthält. Ein konfokales Laserscanning-Mikroskop wurde verwendet, um Bilder der Geloberfläche (B) und des Bodens der Mikrosphäre (C) aufzunehmen. Signale der fluoreszierenden Kügelchen sind an der Geloberfläche im eingerückten Bereich (B, Kreis) nicht sichtbar. Sie können jedoch am Boden der Mikrosphäre beobachtet werden. Maßstabsbalken: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg"> Abbildung 6: Kraftkartierung eines neuronalen Wachstumskegels. (A-C) Fluoreszenzbilder von Perlen, die in ein PAA-Gel und einen neuronalen Wachstumskegel eingebettet sind, visualisiert mit EGFP. Nach der Aufnahme von Zeitrafferbildern (A) wurde das Neuron durch Auftragen von SDS-Lösung aus dem Gelsubstrat freigesetzt und ein Bild der Kügelchen im ungespannten Substrat aufgenommen (B). (C) Das Bild der Perlen im ungespannten Substrat zeigt die Kügelchen in ihrer ursprünglichen (grün) und verschobenen (rot) Position. Das EGFP-Signal des Wachstumskegels ist blau dargestellt. Kymographen (rechts) zeigen die Bewegungen der Perlen in Abständen von 3 s für eine Dauer von 147 s, gekennzeichnet durch die Pfeile in den Feldern 1 und 2. Die Perle in Bereich 2 ist eine Referenzperle. Maßstabsbalken: 2 μm für (A), (B) und (C, links) und 1 μm für (C, Mitte). Siehe auch Ergänzende Datei 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg"> Abbildung 7: Schritte zur Korrektur der x-y-Position des Perlenbildes in unbelastetem Substrat unter Verwendung von Fidschi. (A) Verketten Sie das Perlenbild in ungespanntem Substrat mit dem Zeitraffer-Stapelbild fluoreszierender Perlen. (1) Wählen Sie Bild > Stapel > Werkzeuge > verketten. (2) Wählen Sie das Bild der Perlen in ungespanntem Substrat und das Zeitraffer-Stapelbild der fluoreszierenden Perlen in Bild 1 bzw. Bild2 aus. Klicken Sie auf OK. (3) Das Perlenbild im ungespannten Substrat wird dem Zeitraffer-Stapelbild hinzugefügt. (B) Korrigieren Sie die x-y-Position des fluoreszierenden Perlenbildes. (1) Verwenden Sie die Bildlaufleiste (roter Rahmen), um den zweiten Frame (roter Pfeil) im Bildstapel auszuwählen. (2) Wählen Sie Plugins > StackReg. (3) Wählen Sie Starrkörper aus der Dropdown-Liste (roter Rahmen) und klicken Sie auf OK. Die Korrektur der x-y-Position beginnt. (C) Speichern Sie das x-y-positionskorrigierte Perlenbild. Nachdem Sie das erste Bild des positionskorrigierten x-y-Stapelbilds ausgewählt haben, (1) wählen Sie Bild > Duplizieren. (2) Geben Sie 1 in den Bereich ein und deaktivieren Sie Stack duplizieren. Klicken Sie dann auf OK. (3) Das x-y-positionskorrigierte Perlenbild im ungespannten Substrat erscheint auf dem Bildschirm. Speichern Sie dieses Bild als TIFF-Datei. Ergänzende Datei 6 hilft den Ermittlern, die oben beschriebene Methodik zu üben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg"> Abbildung 8: Analyse der Zugkraft unter einem neuronalen Wachstumskegel unter Verwendung eines Open-Source-Codes zur Traktionskraftanalyse. (A) GUI zur Analyse der Zugkraft. Zeitrafferbilder, die auf der GUI ausgewählt wurden, können aus der Dropdown-Liste und mit dem schieberegler (rote Box) bestätigt werden. (B) Wählen Sie eine Region aus, die den Wachstumskegel enthält. (1) Klicken Sie in der GUI auf ROI . Geben Sie mit dem Mauszeiger zwei Punkte (Pfeilspitzen) auf dem Zellenbild an. (2) Ein rotes Kästchen erscheint auf dem Zellenbild. Zwei Klicks bestimmen die Positionen von zwei Ecken. (C) Wählen Sie die erkannten Perlen (weiße Punkte) unter dem Wachstumskegel aus. (1) Klicken Sie in der GUI auf Perlen auswählen und markieren Sie einen polygonalen Bereich, der den Wachstumskegel enthält, indem Sie darauf klicken. Drücken Sie die Eingabetaste . (2) Die weißen Punkte innerhalb des polygonalen Bereichs ändern sich in eine rote Farbe. (D) Berechnete Ergebnisse der Richtung und des Umfangs der Zugkraft. Das rote Kästchen in der Tabelle stellt die x- und y-Komponenten des Kraftvektors dar, die durch die Zugkraftanalyse geschätzt werden. Auf der x-y-Koordinate im rechten Bereich zeigt der vom Wachstumskegel erzeugte Kraftvektor auf -93,8° gegen die x-Achse; diese Orientierung ist auf die Rückseite des Wachstumskegels in (C) gerichtet. Ergänzende Datei 6 hilft den Ermittlern, die oben beschriebene Methodik zu üben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Datei 1: Rezepte von Lösungen und Medien, die in dieser Studie verwendet werden. Siehe Text für eine detaillierte Verwendung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%201-63227R1.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Fluoreszenzbildgebung von Lifeact und fluoreszierende Speckle-Bildgebung von HaloTag-Aktin in einem Nervenwachstumskegel. Lifeact (grün) und HaloTag-Aktin (Magenta). Die Bilder wurden alle 3 s für eine Gesamtdauer von 147 s aufgenommen. Maßstabsleiste: 2 μm. Siehe auch Abbildung 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%202.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 3: Praxisdaten zur Quantifizierung der F-Aktin-Strömungsgeschwindigkeit und der Aktinpolymerisationsrate. Ein Mehrkanal-Zeitraffer-Stack-Bild von Lifeact (grün) und HaloTag-Aktin (Magenta). Siehe auch Abbildung 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental%20file%203.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 4: Ein Force-Mapping-Video, das die Zugkraft an einem neuronalen Wachstumskegel erkennt. Die ursprünglichen (grün) und verschobenen (rot) Positionen der Perlen. Das EGFP-Signal im Wachstumskegel ist blau dargestellt. Bilder wurden alle 3 s für 147 s aufgenommen. Maßstabsleiste: 2 μm. Siehe auch Abbildung 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%204.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 5: Zugkraftanalysecode. Eine detaillierte Verwendung finden Sie in Schritt 8.12. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%205.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 6: Praxisdaten zur Quantifizierung der Zugkraft. Ein einkanaliges RGB-Bild der Perlen in ungespanntem Substrat und einkanaliger Zeitraffer-Stack RGB-Bilder von fluoreszierenden Perlen unter einem Wachstumskegel, EGFP und Hellfeld. Siehe auch Abbildungen 7 und 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%206.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video (Video) | JoVE

Um voranzukommen, müssen Wachstumskegel Zugkräfte gegen die äußere Umgebung ausüben. Die Erzeugung von Zugkräften ist abhängig von der Aktindynamik und der Kupplungskupplung. Die vorliegende Studie beschreibt Methoden zur Analyse der Aktindynamik, der Kupplungskupplung und der Zugkräfte für den Wachstumskegelvorschub.

Analysen von Aktindynamik, Kupplungskupplung und Zugkraft für den Wachstumskegelvorschub

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

Die Kopplungsanalyse von Einzelfleckenbildgebung und Zugkraftmikroskopie kann molekulare Maschinen für wachstumskegelvordringend und -navigation analysieren. Da die Techniken handelsübliche Materialien und Standardmikroskope verwenden. Forscher können sich buchstäblich an die Techniken in ihren Studien anpassen.Beginnen Sie mit der Behandlung der Neuronen mit Tetramethyl-Rhodamin oder TMR-Liganden bei einer Verdünnung von eins bis 2000 in Kulturmedium am Tag in vitro 3. Dann halten Sie die Neuronen bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für eine Stunde. Nach der Inkubation den TMR-Liganden dreimal mit vorgewärmtem PBS waschen.Entfernen Sie das PBS, bevor Sie 0,5 Milliliter erwärmtes Leibovitz-L-15-Medium in die Neuronen geben. Halten Sie die Neuronen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Schalten Sie als Nächstes ein Epifluoreszenzmikroskop ein und stellen Sie den Staatlichen Top-Inkubator auf 37 Grad Celsius ein.Legen Sie dann die mit TMR-Liganden behandelten Neuronen in die Glasbodenschale auf den oberen Inkubator der erwärmten Stufe. Stellen Sie die Bildaufnahmeparameter wie Belichtungszeit auf 500 Millisekunden für Lifeact- und HaloTag-Aktin-Fluoreszenzkanäle und Binning auf 0,065 Mikrometer x 0,065 Mikrometer pro Pixel im Zeitintervall von drei Sekunden für 50 Bilder ein. Nach der Auswahl eines Wachstumskegels, der Lifeact stark exprimiert und wöchentlich HaloTag-Aktin exprimiert.Schließen Sie das Feld auf der Membran, um eine minimale Fläche zu beleuchten, die den Wachstumskegel enthält, und erfassen Sie Zeitrafferbilder. Ersetzen Sie am Tag in vitro 3 das Kulturmedium durch 0,5 Milliliter erwärmtes Leibovitz-L-15-Medium und halten Sie die Neuronen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius. Schalten Sie für die Zugkraftmikroskopie ein konfokales Laserscanning-Mikroskop ein und stellen Sie den oberen Inkubator der Bühne auf 37 Grad Celsius.Legen Sie die Neuronen auf die Glasbodenschale auf den vorgewarnten oberen Inkubator der Bühne. Stellen Sie die Bildaufnahmeparameter wie im Menüskript beschrieben ein und wählen Sie einen Wachstumskegel aus, der ein verstärktes grünes Fluoreszenzprotein oder EGFP stark exprimiert. Konzentrieren Sie sich auf die Geloberfläche und nehmen Sie Zeitrafferbilder auf.Wenn Sie fertig sind, verwenden Sie eine Bildverarbeitungssoftware, um Einkanal-Zeitraffer-RGB-Bildstapel zu erstellen. Speichern Sie dann die Bilder als TIFF-Dateien. Als nächstes tragen Sie 100 Mikroliter natriumdodecylsulfat oder SDS, gelöst in destilliertem Wasser, auf die Glasbodenschale auf, um das Gelsubstrat zu entspannen, indem Neuronen aus dem Substrat freigesetzt werden.Dann inkubieren Sie die Schüssel im Stage Top Inkubator für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius, um die Temperatur zu stabilisieren. Konzentrieren Sie sich im konfokalen Laserscanning-Mikroskop auf die Geloberfläche, um ein Bild der Kügelchen im ungespannten Substrat aufzunehmen. Erzeugen Sie ein einkanaliges RGB-Bild der Perlen im ungespannten Substrat und speichern Sie dieses Bild als TIFF-Datei.Laden Sie den Zugkraftanalysecode TFM2021 herunter und öffnen Sie TFM2021 in MATLAB. Öffnen Sie die Hauptzeile. m in TFM2021 und führen Sie es aus.Wenn eine grafische Benutzeroberfläche auf dem Bildschirm angezeigt wird. Klicken Sie auf Untrainiertes Substratbild laden und wählen Sie das X-Y-positionskorrigierte Perlenbild im ungespannten Substrat aus. Gehen Sie zu fluoreszierende Perlenbilder laden und wählen Sie den Zeitrafferstapel der Bildperlen aus.Klicken Sie dann auf Hellfeldbilder laden, um das Zeitraffer-Stack-Bild von Bright-Field auszuwählen, und verwenden Sie Load GFP-Bilder, um das Zeitraffer-Stack-Bild von EGFP auszuwählen. Wählen Sie in der Dropdown-Liste auf der grafischen Benutzeroberfläche GFP aus, bevor Sie auf ROI klicken, um den gewünschten Rechteckbereich einschließlich des Wachstumskegels anzugeben, indem Sie auf zwei Punkte auf dem angezeigten Zellenbild klicken. Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern auf der grafischen Benutzeroberfläche, um die ausgewählten Stack-Bilder zusammen mit dem ROI in einer mat-Datei zu speichern.Klicken Sie anschließend auf Spot-Erkennung und geben Sie einen gewünschten Wert in das Dialogfeld ein, um einen Schwellenwert für die Perlenerkennung zu bestimmen. Klicken Sie auf OK, um die Berechnung zu starten. Klicken Sie nach Abschluss der Berechnung auf Plotspur, um den zuvor ausgewählten Bereich zu vergrößern und die erkannten Perlen als weiße Punkte anzuzeigen.Verwenden Sie ausgewählte Perlen, um einen polygonalen Bereich abzugrenzen, der die richtigen Punkte unter dem Wachstumskegel enthält. Wenn Sie dann die Eingabetaste auf der Tastatur drücken, ändern sich die weißen Punkte innerhalb des polygonalen Bereichs in Rot. Klicken Sie in der grafischen Benutzeroberfläche auf Kraft schätzen.Geben Sie dann Werte für die Pixelgröße und den Elastizitätsmodul ein, wie im Manuskript erläutert. Geben Sie den Wert für das Poisson-Verhältnis als 0,3 an und führen Sie die Schätzkraft aus, um die Berechnung zu starten. Die Software speichert die Berechnungsergebnisse in einer Datei im Tabellenkalkulationsformat.Die Fluoreszenzbilder eines neuronalen Wachstumskegels zeigten eine hohe Lifeact-Expression, die die Visualisierung der Wachstumskegelmorphologie unter einem vollständig offenen und schmalen Zwerchfell ermöglicht. Die HaloTag-Aktin-Expressionsniveaus waren mit schwachen Signalen sehr niedrig. Wenn das Zwerchfell entsprechend verengt ist, verringern sich die Hintergrundsignale und ein einzelner Akt in Sprenkeln erscheint im Wachstumskegel.Forscher, die alle Schritte entsprechend erreichen, werden den retrograden F-Aktin-Fluss im Wachstumskegel beobachten. Die Steifigkeit des Polyacrylamidgels wurde durch Berechnung der durch das Gewicht der Mikrosphäre verursachten Eindringtiefe bestimmt. Ein konfokales Laserscanning-Mikroskop wurde verwendet, um Bilder der Geloberfläche und des Bodens der Mikrosphäre aufzunehmen.Die Signale der fluoreszierenden Kügelchen waren an der Geloberfläche im eingerückten Bereich nicht sichtbar. Fluoreszenzbilder der in das Polyacrylamid-Gel und den neuronalen Wachstumskegel eingebetteten Perlen zeigten die Perlen in ihrem Ursprung und ihren verschobenen Positionen. Das EGFP-Signal des Wachstumskegels wurde ebenfalls beobachtet.Die Kymographen zeigten die Bewegungen der Perle im Vergleich zu einer Referenzperle an. Bei der Durchführung einer einzelnen Speckle-Bildgebung sind wichtige Dinge, um ein Neuron auszuwählen, das wöchentlich ausdrückt, wie man unter zwei einer minimalen Fläche aktiniert. Bei der Durchführung einer Zugkraftmikroskopie ist die Bildgebung mit hoher Vergrößerung wichtig für die genaue Konzentration der Zugkraft.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones Video (Video) | JoVE

Labeling F-Aktin Barbed Endet mit Rhodamin-Aktin in permeabilisierten Neuronale Growth Cones

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Forschung

Neurowissenschaften

Morphometric Analyses of Retinal Sections

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Morphometrische Analysen von Netzhautschnitte

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses Video (Video) | JoVE

Transretinal ERG Recordings aus Maus-Retina: Stäbchen und Zapfen Photomorphosen

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish Video (Video) | JoVE

Langfristige Verhaltens Verfolgung von Frei Schwimmen Schwach elektrische Fische

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types Video (Video) | JoVE

Flow Cytometry Protokolle für Oberflächen- und intrazelluläre Antigen Analysen Neuronale Zelltypen

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina Video (Video) | JoVE

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik in Cone Photorezeptor Axonterminalen des Maus-Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons Video (Video) | JoVE

Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy Video (Video) | JoVE

Peering am Gehirn Polysomen mit Rasterkraftmikroskopie

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography Video (Video) | JoVE

Microstate und Omega Komplexität Analysen der ruhenden Zustand Elektroenzephalographie

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid Î² Effects in Cultured Mouse Neurons Video (Video) | JoVE

Visualisierung von axonale Wachstum Kegel Zusammenbruch und frühe Amyloid β-Effekte in kultivierten Maus Neuronen

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...