Name: analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
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Questa ricerca è stata sostenuta in parte da AMED con il numero di sovvenzione 21gm0810011h0005 (N.I. e Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) e JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Incurable Diseases (T.M.) e NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I protocolli descritti in questo studio utilizzano materiali disponibili in commercio e apparecchiature di microscopia che si trovano abitualmente in tutti i laboratori, istituti e università. Pertanto, i ricercatori possono facilmente adottare l'attuale imaging a singola macchia e la microscopia della forza di trazione nei loro studi.
L'imaging speckle può analizzare la polimerizzazione dell'actina e l'accoppiamento della frizione. Inoltre, l'imaging speckle può monitorare il flusso retrogrado di molecole di frizione come shootin1 e cortactin, che interagiscono con il flusso retrogrado di F-actina. Utilizzando un microscopio TIRF, è possibile monitorare anche il flusso retrogrado della molecola di adesione cellulare L1-CAM23,41; L1-CAM subisce comportamenti di presa e slittamento che riflettono l'efficienza di accoppiamento della frizione23,41. Sebbene il presente studio utilizzi il sistema TMR-HaloTag per l'imaging speckle, altre proteine fluorescenti, come EGFP e la proteina fluorescente rossa monomerica, sono disponibili nell'analisi16,18,20,23,24,27,39. Gli elementi essenziali per visualizzare le macchie di actina sono un basso livello di espressione di actina fluorescente e l'illuminazione di un'area minima (Figura 2). In questo protocollo, i segnali Lifeact e HaloTag-actina vengono acquisiti in sequenza. Poiché il flusso retrogrado di actina è relativamente lento (4,5 ± 0,1 μm/min)24, l'analisi del flusso retrogrado di F-actina e la polimerizzazione dell'actina non sono influenzate dall'acquisizione sequenziale di immagini di diversi canali fluorescenti (intervallo ~ 1 s). Lifeact è un marcatore F-actina ampiamente utilizzato, ma può competere con le proteine leganti l'actina47. Di ulteriore importanza, Lifeact può alterare la dinamica dell'actina, influenzando così le strutture F-actina e la morfologia cellulare47,48,49.
La microscopia a forza di trazione può rilevare le forze per guidare l'avanzamento del cono di crescita. Montando i neuroni all'interno di una matrice extracellulare, i ricercatori possono anche analizzare le forze generate in un ambiente semi-3D11. L'imaging ad alto ingrandimento è importante per una quantificazione accurata della forza di trazione perché i coni di crescita generano forze di trazione deboli7. Sebbene per misurare la forza di trazione vengano utilizzati anche altri metodi con nanopilastri o biosensori sensibili allo stress50,51, il metodo a base di gel PAA è altamente adattabile e consente di regolare la rigidità del substrato variando le concentrazioni di acrilammide e bis-acrilammide41,44,52. In questo protocollo, il gel PAA viene preparato ad una concentrazione finale del 3,75% di acrilammide e dello 0,03% di bis-acrilammide; Il modulo di Young è ~270 Pa22 e questa rigidità rientra nell'intervallo del tessuto cerebrale (100-10.000 Pa)53,54,55. A causa dello spessore del gel PAA (~ 100 μm), questo metodo limita l'uso di lenti ad alto ingrandimento durante la microscopia. Per ottenere immagini ad alto ingrandimento, i ricercatori dovrebbero utilizzare la funzione zoom in un microscopio confocale a scansione laser.
In conclusione, l'attuale speckle imaging e la microscopia della forza di trazione consentono analisi quantitative degli eventi chiave nelle generazioni di forze. Queste informazioni saranno preziose per migliorare la comprensione dei meccanismi che sono alla base dell'avanzamento e della navigazione del cono di crescita.

Nel cervello vertebrato in via di sviluppo, i neuroni subiscono migrazioni organizzate in modo elaborato e proiettano assoni verso partner sinaptici appropriati per stabilire reti neuronali funzionali1,2,3. I coni di crescita, che sono strutture sensoriali e mobili situate sulla punta dei neuriti, determinano la velocità e la direzione della migrazione neuronale e della crescita degli assoni3,4,5. Poiché i neuroni sono circondati da ambienti strettamente imballati, i coni di crescita devono esercitare forze contro il loro ambiente per andare avanti6,7. Per comprendere i meccanismi alla base della migrazione neuronale e della guida assonale, sono essenziali analisi della meccanica molecolare per l'avanzamento del cono di crescita.
Decenni di analisi hanno rivelato che la forza di trazione per guidare l'avanzamento del cono di crescita è generata dal meccanismo della "frizione"; si pensa che questo meccanismo funzioni non solo nel cono di crescita assonale, ma anche nel principale cono di crescita del processo dei neuroni migratori8,9,10,11,12. Vale a dire, i filamenti di actina (F-actine) nei coni di crescita polimerizzano sul bordo d'attacco e depolimerizzano prossimalmente, spingendo fuori la membrana all'avanguardia13,14,15. La forza risultante, in combinazione con la contrazione dell'actomiosina, induce il movimento all'indietro delle F-actine chiamate flusso retrogrado7,11,16,17,18,19,20,21. Le molecole di adesione della frizione e della cellula mediano l'accoppiamento meccanico tra il flusso retrogrado di F-actina e il substrato adesivo e trasmettono la forza del flusso di F-actina sul substrato, generando così forza di trazione per l'avanzamento del cono di crescita7,8,9,11,12,22 . Allo stesso tempo, l'accoppiamento actina-substrato riduce la velocità del flusso F-actina e converte la polimerizzazione dell'actina nella forza di sporgere la membrana all'avanguardia9,10.
I coni di crescita assonale rilevano i segnali chimici locali e li trasducono in una forza motrice direzionale per la navigazione del cono di crescita3,23,24,25. Ad esempio, una molecola guida assonale netrin-1 stimola il suo recettore eliminato nel cancro del colon-retto (DCC) e attiva la proteina di controllo della divisione cellulare 42 (Cdc42) e il substrato 1 (Rac1) della tossina botulinica C3 correlata a Rho guanosina trifosfato (GTP) e la loro chinasi 1 attivata dalla chinasi p21 a valle (Pak1)26. Cdc42 e Rac1 promuovono 1) polimerizzazione dell'actina e Pak1 fosforila una molecola di frizione shootin122,26. Shootin1 interagisce con il flusso retrogrado di F-actina attraverso una proteina legante l'actina cortactin27. Shootin1 interagisce anche con la molecola di adesione cellulare L1 (L1-CAM)20,24. La fosforilazione Shootin1 aumenta le affinità di legame per cortactina e L1-CAM e migliora l'accoppiamento frizione 2) mediato shootin124,27. All'interno del cono di crescita, le attivazioni asimmetriche della polimerizzazione dell'actina e dell'accoppiamento della frizione aumentano 3) la forza di trazione sul lato della sorgente netrin-1, generando così forza motrice direzionale per la rotazione del cono di crescita (Figura 1)24. Un'intensa ricerca negli ultimi decenni per quanto riguarda la migrazione neuronale e la guida degli assoni ha migliorato la comprensione delle molecole guida, dei loro recettori e delle cascate di segnalazione a valle associate2,10,28,29,30. Tuttavia, i macchinari molecolari per generare forze per l'avanzamento del cono di crescita stanno appena iniziando a essere chiariti; ciò può essere attribuito all'uso limitato dei protocolli per le analisi meccanobiologiche.
Il presente studio descrive un protocollo dettagliato per il monitoraggio del flusso retrogrado di F-actina mediante imaging a singola macchia16,18. Il monitoraggio del flusso retrogrado di F-actina è stato ampiamente eseguito utilizzando microscopia a super-risoluzione, microscopia confocale a disco rotante e microscopia a fluorescenza a riflessione totale ad interferenza totale (TIRF)25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Il protocollo nel presente studio, tuttavia, utilizza un microscopio a epifluorescenza standard ed è quindi facilmente adottabile11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. In combinazione con l'etichettatura F-actina di Lifeact43, l'imaging a singola macchia consente di quantificare la velocità di polimerizzazione dell'actina e l'efficienza di accoppiamento della frizione tra il flusso retrogrado di F-actina e il substrato adesivo39,42. Il presente studio descrive inoltre un protocollo dettagliato di microscopia della forza di trazione utilizzando un gel di poliacrilammide (PAA) incorporato in perline fluorescenti11,22,23,24,27,39,41,42,44. Questo metodo rileva e quantifica la forza di trazione sotto il cono di crescita monitorando i movimenti delle perline indotti dalla forza44,45. Viene fornito un codice di analisi della forza di trazione open source e viene spiegato in dettaglio il metodo per quantificare la forza di trazione durante la migrazione del cono di crescita. Con l'aiuto dell'imaging a singola macchia e della microscopia della forza di trazione, sarà facilitata la comprensione della meccanica molecolare alla base della migrazione e della navigazione del cono di crescita. Queste tecniche sono applicabili anche per analizzare la meccanica molecolare alla base dell'allargamento della colonna vertebrale dendritica, che è noto per essere importante nell'apprendimento e nella memoria42.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% trypan blue stain solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00809-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albmine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421787-9970-799</td>
			<td>Objective lens (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (diameter 18 mm)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C018001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16806-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open source software package</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>carboxylate-modified microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (14 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1130H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (27 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882-10X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBO103 W/2</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300382128</td>
			<td>Mercury lamp (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution from mouse EHS tumor</td>
			<td>Wako</td>
			<td>120-05751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16919-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Conforcal laser microscope (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB2018a</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse C57BL/6</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse neuron nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>22402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>AAD-1001</td>
			<td>Electroporation apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td>CMOS camera (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26036-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parallel Computing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>1528177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFN21A-HaloTag-actin</td>
			<td>(Minegishi et al., 2018)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420790-9901-000</td>
			<td>Objective lens (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td>
			<td>(Kastian et al., 2021)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slulfo-SAMPHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08933-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrate (NaOH)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>Sako tekkou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2009</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (single speckle imaging)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance

Per stabilire reti funzionali, i neuroni devono migrare verso le loro destinazioni appropriate e quindi estendere gli assoni verso le loro cellule bersaglio. Questi processi dipendono dai progressi dei coni di crescita che si trovano sulle punte dei neuriti. I coni di crescita assonale generano forze motrici rilevando il loro microambiente locale e modulando la dinamica citoscheletrica e l'accoppiamento actina-adesione (accoppiamento frizione). Decenni di ricerca hanno portato all'identificazione di molecole guida, dei loro recettori e di cascate di segnalazione a valle per la regolazione della migrazione neuronale e della guida assonale; tuttavia, i macchinari molecolari necessari per generare forze per guidare l'avanzamento del cono di crescita e la navigazione stanno appena iniziando a essere chiariti. All'avanguardia dei coni di crescita neuronale, i filamenti di actina subiscono un flusso retrogrado, che è alimentato dalla polimerizzazione dell'actina e dalla contrazione dell'actomiosina. Un accoppiamento della frizione tra il flusso retrogrado di F-actina e il substrato adesivo genera forze di trazione per l'avanzamento del cono di crescita. Il presente studio descrive un protocollo dettagliato per il monitoraggio del flusso retrogrado di F-actina mediante imaging a singola macchia. È importante sottolineare che, se combinata con un marcatore F-actina Lifeact, questa tecnica può quantificare 1) il tasso di polimerizzazione F-actina e 2) l'efficienza di accoppiamento della frizione tra il flusso retrogrado F-actina e il substrato adesivo. Entrambe sono variabili critiche per generare forze per l'avanzamento e la navigazione del cono di crescita. Inoltre, il presente studio descrive un protocollo dettagliato di microscopia della forza di trazione, che può quantificare 3) la forza di trazione generata dai coni di crescita. Pertanto, accoppiando le analisi dell'imaging a singola macchia e della microscopia della forza di trazione, i ricercatori possono monitorare la meccanica molecolare alla base dell'avanzamento e della navigazione del cono di crescita.

Imaging a singola macchia per quantificare la velocità di polimerizzazione dell'actina e l'efficienza di accoppiamento della frizione Un'elevata espressione di Lifeact consente la visualizzazione di F-actina all'interno del cono di crescita; una bassa espressione di HaloTag-actina consente il monitoraggio del flusso retrogrado di F-actina (Figura 3, File supplementare 2). Il tracciamento delle macchie di actina consente di misurare la velocità del flusso di F-actina (Figura 3C,D). Poiché l'accoppiamento meccanico del flusso retrogrado di F-actina e del substrato adesivo riduce la velocità del flusso di F-actina, l'efficienza di accoppiamento della frizione può essere stimata dalla velocità. Inoltre, l'etichettatura di F-actina con Lifeact aiuta la visualizzazione dell'estensione di F-actina ed è utile per quantificare il tasso di polimerizzazione dell'actina (Figura 3E, F).
Analisi quantitativa della forza di trazione La stretta aderenza alla metodologia qui presentata rivelerà i movimenti delle perle fluorescenti sotto il cono di crescita (Figura 6C, File supplementare 4). Il flusso retrogrado di F-actina sul substrato genera forza di trazione facendo sì che le perle fluorescenti si muovano all'indietro sotto il cono di crescita. Il codice di analisi della forza di trazione stima la forza di trazione dallo spostamento del tallone fluorescente ed esprime la forza di trazione calcolata come vettore di forza. La direzione e l'entità della forza di trazione sono determinate dalle componenti x e y del vettore di forza (Figura 8C,D). La casella rossa nella Figura 8D rappresenta le componenti x e y di un vettore di forza; La Figura 8C raffigura il cono di crescita corrispondente. In termini di coordinate x-y, il vettore punta a -93,8° contro l'asse x; questo orientamento è diretto verso la parte posteriore del cono di crescita (Figura 8C). L'entità della forza di trazione F è stata calcolata come segue:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg">
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg"> Figura 1: Un meccanismo a cono di crescita per la generazione di forza e la navigazione del cono di crescita. Un gradiente chemioattrattante netrin-1 induce la stimolazione asimmetrica del suo recettore DCC su un cono di crescita assonale. Questo attiva Rac1 e Cdc42 e la loro chinasi a valle Pak1. Rac1 e Cdc42 promuovono (1) la polimerizzazione dell'actina, mentre Pak1 fosforila shootin1, migliorando l'accoppiamento della frizione mediato da shootin1 (2). L'attivazione asimmetrica della dinamica dell'actina e l'accoppiamento della frizione all'interno del cono di crescita aumenta (3) la forza di trazione sul lato della sorgente netrin-1, generando così una forza motrice direzionale per l'attrazione del cono di crescita. I protocolli qui presentati consentono la quantificazione delle variabili chiave (1)-(3) per la navigazione del cono di crescita. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg"> Figura 2: Immagini di fluorescenza di un cono di crescita neuronale sotto un diaframma completamente aperto e ristretto. Il cono di crescita esprime Lifeact e HaloTag-actina. (A) Un'elevata espressione di Lifeact consente la visualizzazione della morfologia del cono di crescita. D'altra parte, i livelli di espressione di HaloTag-actina sono molto bassi, con segnali deboli quando il diaframma è completamente aperto. (B) Quando il diaframma è opportunamente ristretto, i segnali di fondo diminuiscono e singole macchie di actina appaiono nel cono di crescita. Barre della scala: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg"> Figura 3: Passaggi per quantificare la velocità del flusso di F-actina e la velocità di polimerizzazione dell'actina utilizzando un software di elaborazione e analisi delle immagini Fiji. (A) Regolare l'angolo dell'immagine per l'analisi. (1) Trova e seleziona una macchia di actina (punta di freccia) che scorre in un fascio di F-actina. (2) Selezionare Immagine > Trasforma > Ruota. (3) Impostare l'angolo in modo che il fascio di F-actina sia diretto verso l'alto. (4) L'angolo dell'immagine verrà modificato. (B) Delimitare la regione, compresi la macchia di actina e il fascio di F-actina. (1) Fare clic su Rettangolo sulla barra degli strumenti. (2) Delineare una regione sull'immagine. La luminosità e il contrasto dell'immagine sono aumentati per consentire una chiara visualizzazione della macchia di actina e della punta del fascio di F-actina. (3) Selezionare Immagine > Duplica. (4) Inserire i cinque intervalli di tempo che mostrano il flusso di macchie di actina nel fascio di F-actina. (5) L'immagine dello stack selezionata apparirà sullo schermo. (C) Sovrapposizione di cerchi sulla macchia di actina. (1) Fare clic su Oval sulla barra degli strumenti. (2) Disegna un cerchio su una macchia di actina. (3) Selezionare Immagine > Sovrapposizione > Aggiungi selezione. (4) Il cerchio è sovrapposto. 5) Ripetere la sovrapposizione dei cerchi sulle macchie di actina rimanenti. (D) Misurare la distanza di traslocazione delle macchie di actina durante i cinque intervalli di tempo. (1) Fare clic su Dritto sulla barra degli strumenti. (2) Disegna una linea che collega i centri dei cerchi. (3) Selezionare Analizza > misura. Il risultato, indicato dal parametro Altezza (riquadro rosso), trasmette la distanza di traslocazione della macchia di actina. (E) Misurare la variazione della lunghezza della protrusione di F-actina durante i cinque intervalli di tempo. (1) Tracciare una linea che collega le punte della protrusione F-actina. (2) Selezionare Analizza > misura. Il risultato (riquadro rosso), Altezza, indica la lunghezza di estensione del fascio di F-actina. (F) Il tasso di polimerizzazione dell'actina è calcolato dalla somma della velocità del flusso di F-actina e della velocità di estensione. Vedere anche File supplementare 2. Il file supplementare 3 aiuta gli investigatori a praticare la metodologia sopra descritta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg"> Figura 4: Passaggi per la preparazione del gel PAA. Si prega di consultare il passaggio 7.1 per una descrizione dettagliata. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg"> Figura 5: Determinazione della rigidità del gel PAA. (A) Un metodo di indentazione della microsfera. Quando una microsfera viene posizionata su un gel PAA incorporato in perline fluorescenti, il peso della microsfera provoca una rientranza nel gel. La profondità di indentazione viene calcolata sottraendo le posizioni z della superficie del gel PAA dal fondo della microsfera (B,C) Immagini di fluorescenza di un gel PAA rientrato da una microsfera e contenente perline fluorescenti. Un microscopio confocale a scansione laser è stato utilizzato per catturare immagini della superficie del gel (B) e del fondo della microsfera (C). I segnali provenienti dalle perle fluorescenti non sono visibili sulla superficie del gel nella regione rientrata (B, cerchio). Possono, tuttavia, essere osservati nella parte inferiore della microsfera. Barre di scala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg"> Figura 6: Mappatura della forza di un cono di crescita neuronale. (A-C) Immagini a fluorescenza di perline incorporate in un gel PAA e un cono di crescita neurale visualizzate con EGFP. A seguito dell'acquisizione di immagini time-lapse (A), il neurone è stato rilasciato dal substrato del gel applicando la soluzione SDS e un'immagine delle perline nel substrato non teso è stata catturata (B). (C) L'immagine delle perline nel substrato non teso mostra le perline nelle loro posizioni originali (verde) e spostate (rosso). Il segnale EGFP del cono di crescita è mostrato in blu. I kymografi (a destra) mostrano i movimenti delle perline a intervalli di 3 s per una durata di 147 s, indicati dalle frecce nelle aree in scatola 1 e 2. Il tallone nell'area 2 è un tallone di riferimento. Barre di scala: 2 μm per (A), (B) e (C, a sinistra) e 1 μm per (C, al centro). Vedere anche Il file supplementare 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg"> Figura 7: Passaggi per la correzione della posizione x-y dell'immagine del tallone in substrato non teso utilizzando Fiji. (A) Concatenare l'immagine del tallone in un substrato non teso con l'immagine dello stack time-lapse di perline fluorescenti. (1) Selezionare Image > Stacks > Tools > Concatenare. (2) Selezionare l'immagine delle perline in substrato non teso e l'immagine dello stack time-lapse delle perline fluorescenti rispettivamente in Image1 e Image2. Fare clic su OK. (3) L'immagine del tallone nel substrato non teso viene aggiunta all'immagine dello stack time-lapse. (B) Correggere la posizione x-y dell'immagine del tallone fluorescente. (1) Utilizzare la barra di scorrimento (cornice rossa) per selezionare il secondo fotogramma (freccia rossa) nella pila di immagini. (2) Selezionare Plugin > StackReg. (3) Selezionare Corpo rigido dall'elenco a discesa (cornice rossa) e fare clic su OK. Inizierà la correzione della posizione x-y. (C) Salvare l'immagine del tallone corretta per la posizione x-y. Dopo aver selezionato il primo fotogramma dell'immagine dello stack x-y corretta per la posizione, (1) selezionare Immagine > Duplica. (2) inserire 1 nell'intervallo e deselezionare lo stack duplicato. Quindi fare clic su OK. (3) l'immagine del tallone corretto per la posizione x-y nel substrato non teso apparirà sullo schermo. Salva questa immagine come file tiff. Il file supplementare 6 aiuta gli investigatori a praticare la metodologia sopra descritta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg"> Figura 8: Analisi della forza di trazione sotto un cono di crescita neuronale utilizzando un codice di analisi della forza di trazione open source. (A) GUI per l'analisi della forza di trazione. Le immagini time-lapse selezionate nella GUI possono essere confermate dall'elenco a discesa e con il cursore indicato (casella rossa). (B) Selezionare una regione che includa il cono di crescita. (1) Fare clic su ROI nella GUI. Con il cursore del mouse, specificare due punti (punte di freccia) sull'immagine della cella. (2) Una casella rossa apparirà sull'immagine della cella. Due clic determinano le posizioni di due angoli. (C) Selezionare le perline rilevate (punti bianchi) sotto il cono di crescita. (1) Nella GUI, fare clic su Seleziona perline e delimitare una regione poligonale che include il cono di crescita facendo clic. Premere il tasto Invio . (2) I punti bianchi all'interno della regione poligonale cambieranno in un colore rosso. (D) Risultati calcolati della direzione e dell'entità della forza di trazione. La casella rossa nel foglio di calcolo rappresenta le componenti x e y del vettore di forza, stimate dall'analisi della forza di trazione. Sulla coordinata x-y nel pannello di destra, il vettore di forza generato dal cono di crescita punta a -93,8° contro l'asse x; questo orientamento è diretto verso la parte posteriore del cono di crescita in (C). Il file supplementare 6 aiuta gli investigatori a praticare la metodologia sopra descritta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
File supplementare 1: Ricette di soluzioni e supporti utilizzati in questo studio. Vedere il testo per un utilizzo dettagliato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%201-63227R1.xlsx" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 2: Imaging a fluorescenza di Lifeact e imaging a macchie fluorescenti di HaloTag-actina in un cono di crescita nervosa. Lifeact (verde) e HaloTag-actina (magenta). Le immagini sono state acquisite ogni 3 s per una durata totale di 147 s. Barra di scala: 2 μm. Vedere anche la Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%202.mp4" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 3: Dati pratici per quantificare la velocità del flusso di F-actina e il tasso di polimerizzazione dell'actina. Un'immagine stack time-lapse multicanale di Lifeact (verde) e HaloTag-actina (magenta). Vedere anche la Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental%20file%203.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 4: un video di mappatura della forza che rileva la forza di trazione in un cono di crescita neuronale. Le posizioni originali (verde) e spostate (rosso) delle perline. Il segnale EGFP nel cono di crescita è mostrato in blu. Le immagini sono state acquisite ogni 3 s per 147 s. Barra di scala: 2 μm. Vedere anche la Figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%204.mp4" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 5: Codice di analisi della forza di trazione. Vedere il passaggio 8.12 per un utilizzo dettagliato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%205.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>
File supplementare 6: Dati pratici per quantificare la forza di trazione. Un'immagine RGB a canale singolo delle perline in substrato non teso e immagini RGB time-lapse a canale singolo di perline fluorescenti sotto un cono di crescita, EGFP e campo luminoso. Cfr . anche figure 7 e 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%206.zip" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a>

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Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video (Video) | JoVE

Per avanzare, i coni di crescita devono esercitare forze di trazione contro l'ambiente esterno. La generazione delle forze di trazione dipende dalla dinamica dell'actina e dall'accoppiamento della frizione. Il presente studio descrive i metodi per analizzare la dinamica dell'actina, l'accoppiamento della frizione e le forze di trazione per l'avanzamento del cono di crescita.

Analisi della dinamica dell'actina, dell'accoppiamento della frizione e della forza di trazione per l'avanzamento del cono di crescita

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

L'analisi di accoppiamento di imaging a singola macchia e forza di trazione microscopica può analizzare macchinari molecolari per l'avanzamento e la navigazione del cono di crescita. Poiché le tecniche utilizzano materiali disponibili in commercio e microscopi standard. I ricercatori possono letteralmente adattarsi alle tecniche nei loro studi.Iniziare trattando i neuroni con tetrametil-rodamina o ligando TMR ad una diluizione da uno a 2000 in terreno di coltura il giorno in vitro 3. Quindi mantenere i neuroni a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per un'ora. Dopo l'incubazione, lavare il ligando TMR tre volte con PBS preriscaldato.Rimuovere il PBS prima di aggiungere 0,5 millilitri di mezzo L-15 di Leibovitz riscaldato nei neuroni. Mantenere i neuroni a 37 gradi Celsius per un'ora. Quindi, accendere un microscopio a epifluorescenza e impostare l'incubatore superiore dello stato a 37 gradi Celsius.Quindi posizionare i neuroni trattati con ligando TMR nel piatto inferiore di vetro sull'incubatrice superiore del palco riscaldata. Impostare i parametri di acquisizione dell'immagine come il tempo di esposizione a 500 millisecondi per i canali di fluorescenza Lifeact e HaloTag-actina e il binning come 0,065 micron per 0,065 micron per pixel a un intervallo di tempo di tre secondi per 50 fotogrammi. Dopo aver selezionato un cono di crescita che esprime fortemente Lifeact e settimanalmente esprime HaloTag-actina.Chiudere il campo sul diaframma per illuminare un'area minima che includa il cono di crescita e acquisire immagini time lapse. Il giorno in vitro 3, sostituire il terreno di coltura con 0,5 millilitri di mezzo L-15 di Leibovitz riscaldato e mantenere i neuroni per un'ora a 37 gradi Celsius. Per la microscopia con forza di trazione, accendere un microscopio confocale a scansione laser e impostare l'incubatore superiore del palcoscenico a 37 gradi Celsius.Posiziona i neuroni sul piatto inferiore di vetro sull'incubatore superiore dello stadio pre-avvertito. Impostare i parametri di acquisizione dell'immagine come descritto nello script del menu e selezionare un cono di crescita che esprima fortemente la proteina di fluorescenza verde migliorata o EGFP. Concentrati sulla superficie del gel e acquisisci immagini time-lapse.Al termine, utilizzare un software di elaborazione delle immagini per produrre stack di immagini RGB time-lapse a canale singolo. Quindi salvare le immagini come file tiff. Quindi, applicare 100 microlitri del 10% in peso in volume di sodio dodecil solfato o SDS disciolto in acqua distillata sul piatto di fondo di vetro per rilassare il substrato del gel rilasciando neuroni dal substrato.Quindi incubare il piatto nell'incubatore superiore del palco per cinque minuti a 37 gradi Celsius per stabilizzare la temperatura. Nel microscopio confocale a scansione laser, concentrarsi sulla superficie del gel per acquisire un'immagine delle perline nel substrato non teso. Produrre un'immagine RGB a canale singolo delle perline nel substrato non teso e salvare questa immagine come file tiff.Scarica il codice di analisi della forza di trazione TFM2021 e apri TFM2021 in MATLAB. Apri principale. m in TFM2021 ed eseguirlo.Quando sullo schermo viene visualizzata un'interfaccia utente grafica. Fare clic su Carica immagine del substrato non addestrata e selezionare l'immagine del tallone corretta per la posizione X-Y nel substrato non teso. Vai a caricare immagini di perline fluorescenti e seleziona la pila time-lapse di perline di immagini.Quindi fare clic su Carica immagini in campo luminoso per scegliere l'immagine dello stack time-lapse di bright-field e utilizzare carica immagini GFP per selezionare l'immagine dello stack time-lapse di EGFP. Dall'elenco a discesa nell'interfaccia utente grafica, selezionare GFP prima di fare clic su ROI per specificare la regione rettangolare di interesse, incluso il cono di crescita, facendo clic su due punti sull'immagine della cella visualizzata. Una volta fatto clicca sul pulsante salva sull'interfaccia utente grafica per salvare le immagini dello stack selezionato insieme al ROI in un file mat.Quindi, fare clic su Spot Detect e inserire un valore desiderato nella finestra di dialogo per determinare una soglia per il rilevamento di perline. Premi ok per iniziare il calcolo. Dopo aver terminato il calcolo, fare clic su traccia di creazione per ingrandire la regione selezionata in precedenza e visualizzare le perline rilevate come punti bianchi.Utilizzare perline selezionate per delimitare un'area poligonale che include i punti corretti sotto il cono di crescita. Quindi, premendo invio sulla tastiera, i punti bianchi all'interno della regione poligonale si trasformeranno in rosso. Fare clic su stima forza nell'interfaccia utente grafica.Quindi inserisci i valori per la dimensione dei pixel e il modulo di Young come spiegato nel manoscritto. Metti il valore per il rapporto di Poisson come 0,3 ed esegui la forza di stima per avviare il calcolo. Il software salverà i risultati del calcolo in un file in formato foglio di calcolo.Le immagini di fluorescenza di un cono di crescita neuronale hanno mostrato un'elevata espressione di Lifeact che consente la visualizzazione della morfologia del cono di crescita sotto un diaframma completamente aperto e stretto. I livelli di espressione di HaloTag-actina erano molto bassi con segnali deboli. Quando il diaframma è opportunamente ristretto, i segnali di fondo diminuiscono e il singolo atto nelle macchie appare nel cono di crescita.I ricercatori che raggiungono in modo appropriato tutti i passaggi osserveranno il flusso retrogrado di F-actina nel cono di crescita. La rigidità del gel di poliacrilammide è stata determinata calcolando la profondità di rientranza causata dal peso della microsfera. Un microscopio confocale a scansione laser è stato utilizzato per catturare immagini della superficie del gel e del fondo della microsfera.I segnali provenienti dalle perle fluorescenti non erano visibili sulla superficie del gel nella regione frastagliata. Le immagini di fluorescenza delle perline incorporate nel gel di poliacrilammide e nel cono di crescita neurale, hanno mostrato le perle nella loro origine e posizioni spostate. È stato osservato anche il segnale EGFP del cono di crescita.I kymographs mostravano i movimenti del tallone rispetto a un tallone di riferimento. Quando si esegue un singolo speckle imaging, cose importanti per selezionare un neurone che settimanalmente esprime come actina sotto due un'area minima. Quando si esegue una microscopia con forza di trazione, l'imaging ad alto ingrandimento è importante per una concentrazione accurata della forza di trazione.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

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L&#39;etichettatura di F-actina Finisce spinato con Rodamina-actina in permeabilizzate coni di crescita neuronale

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