Name: analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video at JoVE.com

Denne forskningen ble delvis støttet av AMED under tilskuddsnummer 21gm0810011h0005 (N.I. og Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) og JSPS Grants-in-Aid for forskere i tidlig karriere (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Uhelbredelige sykdommer (T.M.), og NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Protokollene beskrevet i denne studien bruker kommersielt tilgjengelige materialer og mikroskopiutstyr som rutinemessig finnes i alle laboratorier, institutter og universiteter. Derfor kan etterforskere enkelt ta i bruk den nåværende enkeltflekkavbildningen og trekkraft kraftmikroskopi i studiene.
Flekkete avbildning kan analysere aktinpolymerisering og koblingskobling. I tillegg kan flekkete avbildning overvåke retrogradstrømmen av clutchmolekyler som shootin1 og cortactin, som samhandler med F-aktin retrograd strømning. Ved å bruke et TIRF-mikroskop kan den retrograde strømmen av celleadhesjonsmolekylet L1-CAM også overvåkes23,41; L1-CAM gjennomgår grep og skliatferd som gjenspeiler koblingseffektiviteten23,41. Selv om den nåværende studien benytter TMR-HaloTag-systemet for flekkete avbildning, er andre fluorescerende proteiner, som EGFP og monomerisk rødt fluorescerende protein, også tilgjengelig i analysen16,18,20,23,24,27,39. Det viktigste for å visualisere aktinflekker er et lavt uttrykksnivå av fluorescerende aktin og belysningen av et minimumsområde (figur 2). I denne protokollen innhentes Signalene Lifeact og HaloTag-actin sekvensielt. Fordi aktin retrograd strømning er relativt langsom (4,5 ± 0,1 μm/min)24, er analysen av F-aktin retrograd strømning og aktinpolymerisering upåvirket av sekvensiell bildeinnhenting av forskjellige fluorescerende kanaler (~1 s intervall). Lifeact er en mye brukt F-aktinmarkør, men kan konkurrere med aktinbindende proteiner47. Av ytterligere betydning kan Lifeact endre aktindynamikk, og dermed påvirke F-aktinstrukturer og cellemorfologien47,48,49.
Trekkraft mikroskopi kan oppdage krefter for å drive vekst kjegle forhånd. Ved å montere nevronene i en ekstracellulær matrise, kan etterforskere også analysere krefter generert i et semi-3D-miljø11. Høyforstørrelsesavbildning er viktig for nøyaktig kvantifisering av trekkraft fordi vekstkjegler genererer svake trekkraftkrefter7. Selv om andre metoder med nanopillarer eller stressfølsomme biosensorer også brukes til å måle trekkraft force50,51, er PAA gelbasert metode svært tilpasningsdyktig og muliggjør justering av substratstivitet ved å variere konsentrasjonene av akrylamid og bis-akrylamid41,44,52. I denne protokollen fremstilles PAA gel ved en endelig konsentrasjon på 3,75% akrylamid og 0,03% bis-akrylamid; Youngs modulus er ~ 270 Pa22 og denne stivheten er innenfor rekkevidden av hjernevev (100-10,000 Pa)53,54,55. På grunn av tykkelsen på PAA gel (~ 100 μm), begrenser denne metoden bruken av høyforstørrelseslinser under mikroskopi. For å få bilder med høy forstørrelse, bør undersøkere bruke zoomfunksjonen i et konfokalt mikroskop for laserskanning.
Avslutningsvis muliggjør dagens flekkavbildning og trekkraftmikroskopi kvantitative analyser av de viktigste hendelsene i kraftgenerasjoner. Denne informasjonen vil være uvurderlig for å forbedre forståelsen av mekanismene som ligger til grunn for vekstkjegleutvikling og navigasjon.

I den utviklende virveldyrhjernen gjennomgår nevroner forseggjort organiserte migrasjoner og prosjektaksoner mot passende synaptiske partnere for å etablere funksjonelle nevronnettverk1,2,3. Vekstkjegler, som er sensoriske og motile strukturer plassert på spissen av nevritter, bestemmer hastigheten og retningen for nevronal migrasjon og axon utvekst3,4,5. Siden nevroner er omgitt av tettpakkede miljøer, må vekstkjegler utøve krefter mot miljøet for å komme seg fremover6,7. For å forstå mekanismene som ligger til grunn for nevronmigrasjon og axonal veiledning, er analyser av molekylærmekanikk for vekstkjeglefremgang avgjørende.
Tiår med analyse har avslørt at trekkraft for å drive vekstkjeglefremgang genereres av "clutch" -mekanismen; denne mekanismen antas å fungere ikke bare i axonal vekst kjegle, men også i den ledende prosessvekst kjegle av migrerende nevroner8,9,10,11,12. Nemlig, aktinfilamenter (F-aktiner) i vekstkjegler polymeriserer i forkant og depolymeriserer proksimalt, skyver ut den ledende membranen13,14,15. Den resulterende kraften, sammen med actomyosin-sammentrekning, induserer bakre bevegelse av F-aktiner kalt retrogradstrømning7,11,16,17,18,19,20,21. Clutch- og celleadhesjonsmolekyler formidler mekanisk kobling mellom F-aktin retrograde strømning og limsubstratet og overfører kraften til F-aktinstrøm på substratet, og genererer dermed trekkraft for vekstkjeglefremgang7,8,9,11,12,22 . Samtidig reduserer aktin-substratkoblingen F-aktinstrømningshastigheten og konverterer aktinpolymerisering til kraften for å stikke ut den ledende membranen9,10.
Axonal vekst kjegler føler lokale kjemiske signaler og transduce dem til en retningsmessig drivkraft for vekst kjegle navigasjon3,23,24,25. For eksempel stimulerer et axonveiledningsmolekyl netrin-1 reseptoren som er slettet i kolorektal kreft (DCC), og aktiverer Rho guanosin triphosfat (GTP)-bindende proteiner celledelingskontrollprotein 42 (Cdc42) og Ras-relatert C3 botulinumtoksin substrat 1 (Rac1), og deres nedstrøms kinase p21-aktiverte kinase 1 (Pak1)26. Cdc42 og Rac1 fremmer 1) aktinpolymerisering, og Pak1 fosforylater et clutchmolekyl shootin122,26. Shootin1 samhandler med F-aktin retrograd strømning via en aktinbindende protein cortactin27. Shootin1 samhandler også med L1 celleadhesjonsmolekyl (L1-CAM)20,24. Shootin1 fosforylering øker bindingsaffinitetene for kortlaktin og L1-CAM, og forbedrer shootin1-mediert 2) clutchkobling24,27. Innenfor vekstkjeglen øker asymmetriske aktiveringer av aktinpolymerisering og koblingskobling 3) trekkraft på siden av netrin-1-kilden, og genererer dermed retningsbestemt drivkraft for vekstkjegle dreining (figur 1)24. Intensiv forskning de siste tiårene med hensyn til nevron migrasjon og axon veiledning har forbedret forståelsen av veiledningsmolekyler, deres reseptorer og tilhørende nedstrøms signalkaskader2,10,28,29,30. Imidlertid begynner de molekylære maskinene å generere krefter for vekstkjeglefremgang bare å bli belyst; Dette kan tilskrives begrenset bruk av protokollene for mekanobiologiske analyser.
Den nåværende studien beskriver en detaljert protokoll for overvåking av F-aktin retrograd strømning ved enkeltflekkavbildning16,18. Overvåking av F-aktin retrograd strømning har blitt grundig utført ved hjelp av super-oppløsning mikroskopi, spinning-disk confocal mikroskopi og total interferens refleksjon fluorescens (TIRF) mikroskopi25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Protokollen i den nåværende studien bruker imidlertid et standard epifluorescensmikroskop og er dermed lett adopterbart1,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. Kombinert med F-aktinmerking av Lifeact43, gir enkel flekkete avbildning mulighet for kvantifisering av aktinpolymeriseringshastigheten og koblingskoblingseffektiviteten mellom F-aktin retrograd strømning og limsubstratet39,42. Den nåværende studien beskriver videre en detaljert protokoll for trekkraft kraftmikroskopi ved hjelp av en fluorescerende perle-innebygd polyakrylamid (PAA) gel11,22,23,24,27,39,41,42,44. Denne metoden oppdager og kvantifiserer trekkraft under vekstkjeglen ved å overvåke kraftinduserte perlebevegelser44,45. En åpen kildekode trekkraft analyse kode er gitt, og metoden for kvantifisering trekkraft under vekst kjegle migrasjon forklares i detalj. Ved hjelp av enkel flekkete avbildning og trekkraft kraftmikroskopi, vil det bli lagt til rette for forståelse av den molekylære mekanikken som ligger til grunn for vekstkjeglemigrasjon og navigasjon. Disse teknikkene gjelder også for å analysere molekylærmekanikken som ligger til grunn for dendritisk ryggradsforstørrelse, som er kjent for å være viktig i læring og hukommelse42.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% trypan blue stain solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00809-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albmine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421787-9970-799</td>
			<td>Objective lens (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (diameter 18 mm)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C018001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16806-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open source software package</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>carboxylate-modified microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (14 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1130H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (27 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882-10X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBO103 W/2</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300382128</td>
			<td>Mercury lamp (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution from mouse EHS tumor</td>
			<td>Wako</td>
			<td>120-05751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16919-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Conforcal laser microscope (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB2018a</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse C57BL/6</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse neuron nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>22402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>AAD-1001</td>
			<td>Electroporation apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td>CMOS camera (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26036-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parallel Computing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>1528177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFN21A-HaloTag-actin</td>
			<td>(Minegishi et al., 2018)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420790-9901-000</td>
			<td>Objective lens (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td>
			<td>(Kastian et al., 2021)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slulfo-SAMPHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08933-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrate (NaOH)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>Sako tekkou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2009</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (single speckle imaging)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance

For å etablere funksjonelle nettverk må nevroner migrere til sine passende destinasjoner og deretter utvide axoner mot målcellene. Disse prosessene avhenger av fremskrittene av vekstkjegler som ligger på spissen av nevritter. Axonal vekst kjegler generere drivkrefter ved å føle sin lokale mikromiljø og modulere cytoskeletal dynamikk og actin-adhesion kobling (clutch kobling). Tiår med forskning har ført til identifisering av veiledningsmolekyler, deres reseptorer og nedstrøms signalkaskader for regulering av nevronmigrasjon og axonal veiledning; Imidlertid begynner de molekylære maskinene som kreves for å generere krefter for å drive vekstkjeglen fremover og navigasjonen bare å bli belyst. I forkant av nevronale vekstkjegler gjennomgår aktinfilamenter retrograd strømning, som drives av aktinpolymerisering og actomyosin-sammentrekning. En koblingskobling mellom F-aktin retrograde strømning og limsubstrat genererer trekkraftkrefter for vekstkjeglefremgang. Den nåværende studien beskriver en detaljert protokoll for overvåking av F-aktin retrograd strømning ved enkeltflekkavbildning. Viktig, når den kombineres med en F-aktinmarkør Lifeact, kan denne teknikken kvantifisere 1) F-aktinpolymeriseringshastigheten og 2) koblingskoblingseffektiviteten mellom F-aktin retrograd strømning og limsubstratet. Begge er kritiske variabler for å generere krefter for vekstkjeglefremgang og navigasjon. I tillegg beskriver den nåværende studien en detaljert protokoll for trekkraftmikroskopi, som kan kvantifisere 3) trekkraft generert av vekstkjegler. Ved å koble sammen analysene av enkeltflekkavbildning og trekkraftmikroskopi, kan etterforskerne derfor overvåke den molekylære mekanikken som ligger til grunn for vekstkjeglefremgang og navigasjon.

Enkel flekkavbildning for å kvantifisere aktinpolymeriseringshastighet og clutchkoblingseffektivitet Et høyt Lifeact-uttrykk tillater F-aktinvisualisering i vekstkjeglen; et lavt HaloTag-aktinuttrykk gjør det mulig å overvåke F-aktin retrograd strømning (figur 3, tilleggsfil 2). Sporing av aktinflekker tillater måling av F-aktinstrømningshastighet (figur 3C,D). Siden den mekaniske koblingen av F-aktin retrograde strømning og limsubstratet reduserer F-aktinstrømningshastigheten, kan koblingskoblingseffektiviteten estimeres ut fra hastigheten. Videre hjelper F-aktinmerking med Lifeact visualisering av F-aktinforlengelse og er nyttig for å kvantifisere aktinpolymeriseringsraten (figur 3E, F).
Kvantitativ analyse av trekkraft Streng overholdelse av metodikken som presenteres her, vil avsløre bevegelsene til fluorescerende perler under vekstkjeglen (Figur 6C, Supplemental File 4). F-aktin retrograd strømning på substratet genererer trekkraft kraft forårsaker fluorescerende perler å bevege seg bakover under vekst kjeglen. Trekkraft analyse kode estimerer trekkraft kraft fra fluorescerende perle forskyvning, og uttrykker den beregnede trekkraft kraft som en kraft vektor. Retningen og størrelsen på trekkraften bestemmes fra x- og y-komponentene i kraftvektoren (figur 8C,D). Den røde boksen i figur 8D representerer x- og y-komponentene i en kraftvektor. Figur 8C viser den tilsvarende vekstkjeglen. Når det gjelder x-y-koordinater, peker vektoren til -93,8° mot x-aksen; denne retningen er rettet mot baksiden av vekstkjeglen (figur 8C). Størrelsen på trekkraften F ble beregnet som følger:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg">
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg"> Figur 1: Et vekstkjeglemaskiner for kraftgenerering og vekstkjeglenavigasjon. En netrin-1 kjemoattractant gradient induserer asymmetrisk stimulering av reseptoren DCC på en axonal vekstkegle. Dette aktiverer Rac1 og Cdc42, og deres nedstrøms kinase Pak1. Rac1 og Cdc42 fremmer (1) aktinpolymerisering, mens Pak1 fosforylater shootin1, forbedrer shootin1-mediert (2) clutchkobling. Den asymmetriske aktiveringen av aktindynamikk og clutchkoblingen i vekstkjeglen øker (3) trekkraft på siden av netrin-1-kilden, og genererer dermed en retningsbestemt drivkraft for vekstkjegletiltrekning. Protokollene som presenteres her tillater kvantifisering av nøkkelvariablene (1)-(3) for vekstkjeglenavigasjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg"> Figur 2: Fluorescensbilder av en nevronal vekstkegle under en fullt åpnet og innsnevret membran. Vekstkjeglen uttrykker Lifeact og HaloTag-actin. (A) Et høyt Lifeact-uttrykk tillater visualisering av vekstkjeglemorfologi. På den annen side er HaloTag-aktinuttrykksnivåene svært lave, med svake signaler når membranen er helt åpnet. (B) Når membranen er riktig innsnevret, reduseres bakgrunnssignalene, og enkelt aktinflekker vises i vekstkjeglen. Skalastenger: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg"> Figur 3: Trinn for kvantifisering av F-aktinstrømningshastighet og aktinpolymeriseringshastighet ved hjelp av en bildebehandlings- og analyseprogramvare Fiji. (A) Juster vinkelen på bildet for analyse. (1) Finn og velg en aktinflekk (pilspiss) som strømmer i en F-aktinbunt. (2) Velg Bilde > Transformer > Roter. (3) Still inn vinkelen slik at F-aktinbunten er rettet oppover. (4) Vinkelen på bildet vil bli endret. (B) Avgrense regionen, inkludert aktinflekken og F-aktinbunten. (1) Klikk på Rektangel på verktøylinjen. (2) Avgrense et område på bildet. Lysstyrken og kontrasten til bildet økes for å tillate klar visualisering av aktinflekken og spissen av F-aktinbunten. (3) Velg Bilde > Dupliser. (4) Angi de fem tidsrammene som viser aktinflekkstrøm i F-aktinbunten. (5) Det valgte stakkbildet vises på skjermen. (C) Overlegg sirkler på aktinflekken. (1) Klikk på Oval på verktøylinjen. (2) Tegn en sirkel på en aktinflekk. (3) Velg Bilde > overlegg > Legg til utvalg. (4) Sirkelen er lagt over. 5) Gjenta overlegging av sirklene på de resterende aktinflekker. (D) Mål translokasjonsavstanden til aktinflekker i løpet av de fem tidsrammene. (1) Klikk på Rett på verktøylinjen. (2) Tegn en linje som forbinder midten av sirklene. (3) Velg Analyser > Mål. Resultatet, angitt av parameteren Height (rød boks), som sender actin speckle-translokasjonsavstanden. (E) Mål endringen i lengden på F-aktinprotrudering i løpet av de fem tidsrammene. (1) Tegn en linje som forbinder spissene på F-aktin-fremspringet. (2) Velg Analyser > mål. Resultatet (rød boks), Height, angir forlengelseslengden på F-aktinbunten. (F) Aktinpolymeriseringshastigheten beregnes ut fra summen av F-aktinstrømningshastigheten og forlengelseshastigheten. Se også Tilleggsfil 2. Supplemental File 3 hjelper etterforskere med å praktisere metodikken beskrevet ovenfor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg"> Figur 4: Trinn for PAA gelpreparat. Se trinn 7.1 for en detaljert beskrivelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg"> Figur 5: Bestemmelse av PAA gelstivhet. (A) En mikrosfæreinnrykksmetode. Når en mikrosfære er plassert på en fluorescerende perle-innebygd PAA gel, forårsaker mikrosfærens vekt en innrykk i gelen. Innrykksdybden beregnes ved å trekke z-posisjonene til PAA geloverflaten fra bunnen av mikrosfæren (B,C) Fluorescensbilder av en PAA gel rykket inn av en mikrosfære og inneholder fluorescerende perler. Et laserskanningskonfokalt mikroskop ble brukt til å ta bilder av geloverflaten (B) og bunnen av mikrosfæren (C). Signaler fra fluorescerende perler er ikke synlige på geloverflaten i det innrykkede området (B, sirkel). De kan imidlertid observeres på bunnen av mikrosfæren. Skalastenger: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg"> Figur 6: Kraftkartlegging av en nevron vekstkjegle. (A-C) Fluorescensbilder av perler innebygd i en PAA gel og en nevral vekst kjegle visualisert med EGFP. Etter oppkjøpet av tidsforløpbilder (A) ble nevronen frigjort fra gelunderlaget ved å bruke SDS-løsning, og et bilde av perlene i det ubegrensede substratet ble fanget (B). (C) Bildet av perlene i det ubegrensede substratet viser perlene i sine opprinnelige (grønne) og fordrevne (røde) posisjoner. EGFP-signalet til vekstkjeglen er vist i blått. Kymografier (høyre) viser bevegelsene til perler med 3 s intervaller i en varighet på 147 s, angitt av pilene i innkapslede områder 1 og 2. Perlen i område 2 er en referanseperle. Skalastenger: 2 μm for (A), (B) og (C, venstre) og 1 μm for (C, midten). Se også Tilleggsfil 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg"> Figur 7: Trinn for korrigering av x-y-posisjonen til perlebildet i ubegrunnet substrat ved hjelp av Fiji. (A) Sett sammen perlebildet i ubegrunnet substrat med tidsforløpstabelbildet av fluorescerende perler. (1) Velg Image > Stacks > Tools > Concatenate. (2) Velg perlebildet i ubegrensede substrat og tidsforløp stack-bildet av fluorescerende perler i henholdsvis Bilde1 og Bilde2. Klikk på OK. (3) Perlebildet i det ubegrensede substratet legges til i bildet av tidsforløpstakken. (B) Korrigere x-y-posisjonen til det fluorescerende perlebildet. (1) Bruk rullefeltet (rød ramme) for å velge den andre rammen (rød pil) i bildestakken. (2) Velg Plugins > StackReg. (3) Velg Stiv kropp fra rullegardinlisten (rød ramme) og klikk på OK. Rettelsen av x-y-posisjonen begynner. (C) Lagre det x-y posisjonskorrigerte perlebildet. Når du har valgt den første rammen i det plasseringskorrigerte stakkbildet i x-y, velger du Bilde > Dupliser. (2) skriv inn 1 i området og fjern merket for Duplikatstakk. Klikk deretter på OK. (3) det x-y posisjonskorrigerte perlebildet i det ubegrensede substratet vises på skjermen. Lagre dette bildet som en TIFF-fil. Supplemental File 6 hjelper etterforskere med å praktisere metodikken beskrevet ovenfor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg"> Figur 8: Analyse av trekkraft under en nevronal vekstkegle ved hjelp av en åpen kildekode-trekkraftanalysekode. (A) GUI for å analysere trekkraft. Tidsforløpbilder som er valgt i brukergrensesnittet, kan bekreftes fra rullegardinlisten og med glidebryteren angitt (rød boks). (B) Velg et område som inkluderer vekstkjeglen. (1) Klikk på avkastning på GUI. Med musepekeren angir du to punkt (pilspisser) på cellebildet. (2) En rød boks vises på cellebildet. To klikk bestemmer plasseringen av to hjørner. (C) Velg de oppdagede perlene (hvite prikker) under vekstkjeglen. (1) På GUI, klikk på Velg perler, og avgrense et polygonalt område som inkluderer vekstkjeglen ved å klikke. Trykk ENTER . (2) De hvite prikkene i det polygonale området endres til en rød farge. (D) Beregnede resultater av trekkraftens retning og størrelse. Den røde boksen i regnearket representerer x- og y-komponentene i kraftvektoren, estimert av trekkraftanalyse. På x-y-koordinaten i høyre panel peker kraftvektoren generert av vekstkjeglen til -93,8° mot x-aksen; denne retningen er rettet mot baksiden av vekstkjeglen i (C). Supplemental File 6 hjelper etterforskere med å praktisere metodikken beskrevet ovenfor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tilleggsfil 1: Oppskrifter på løsninger og medier som brukes i denne studien. Se tekst for detaljert bruk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%201-63227R1.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende fil 2: Fluorescensavbildning av Lifeact og fluorescerende flekkete avbildning av HaloTag-aktin i en nervevekstkegle. Lifeact (grønn) og HaloTag-aktin (magenta). Bilder ble anskaffet hver tredje s for en total varighet på 147 s. Skala bar: 2 μm. Se også figur 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%202.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende fil 3: Øv på data for kvantifisering av F-aktinstrømningshastighet og aktinpolymeriseringshastigheten. Et tidsforløpsstakkbilde med flere kanaler av Lifeact (grønn) og HaloTag-aktin (magenta). Se også figur 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental%20file%203.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Supplerende fil 4: En kraftkartleggingsvideo som oppdager trekkraft ved en nevronal vekstkjegle. De opprinnelige (grønne) og fordrevne (røde) posisjonene til perlene. EGFP-signalet i vekstkjeglen vises i blått. Bilder ble anskaffet hver tredje s for 147 s. Skala bar: 2 μm. Se også figur 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%204.mp4" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 5: Trekkraft kraftanalysekode. Se trinn 8.12 for detaljert bruk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%205.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>
Tilleggsfil 6: Øv på data for kvantifisering av trekkraft. Et enkanals RGB-bilde av perlene i ubegrensede substrat- og enkanals tidsforløpstakk RGB-bilder av fluorescerende perler under en vekstkegle, EGFP og lysfelt. Se også figur 7 og 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%206.zip" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video at JoVE.com

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video (Video) | JoVE

For å fremme må vekstkjegler utøve trekkraftkrefter mot det ytre miljø. Genereringen av trekkraftkrefter er avhengig av aktindynamikk og clutchkobling. Den nåværende studien beskriver metoder for å analysere aktindynamikk, clutchkobling og trekkraft krefter for vekst kjegle fremskritt.

Analyser av Actin Dynamics, ClutchKobling og Trekkraft Force for Growth Cone Advance

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

Koblingsanalyse av enkeltflekkavbildning og trekkraft kraftmikroskopisk kan analysere molekylære maskinerier for vekstkjeglefremgang og navigasjon. Som teknikkene bruker kommersielt tilgjengelige materialer og standard mikroskoper. Forskere kan bokstavelig talt tilpasse seg teknikkene i studiene sine.Begynn med å behandle nevronene med tetrametyl-rhodamin eller TMR ligand ved en fortynning av en til 2000 i kulturmedium på dagen in vitro 3. Oppretthold deretter nevronene ved 37 grader Celsius med 5% karbondioksid i en time. Etter inkubasjon, vask TMR-ligand tre ganger med forvarmet PBS.Fjern PBS før du tilsetter 0,5 milliliter varmet Leibovitz L-15 medium inn i nevronene. Oppretthold nevronene ved 37 grader Celsius i en time. Deretter slår du på et epifluorescence mikroskop og setter tilstandstoppinkubatoren til 37 grader Celsius.Plasser deretter TMR ligandbehandlede nevroner i glassbunnsfatet på den oppvarmede scenen topp inkubator. Angi bildeanskaffelsesparameterne, for eksempel eksponeringstid, til 500 millisekunder for en Lifeact- og HaloTag-aktinfluorescenskanaler og binning som 0,065 mikron med 0,065 mikron per piksel med et tidsintervall på tre sekunder for 50 bilder. Etter å ha valgt en vekstkegle som sterkt uttrykker Lifeact og ukentlig uttrykker HaloTag-actin.Lukk feltet på membranen for å belyse et minimumsområde som inkluderer vekstkjeglen og skaffe tidsforløpbilder. På dagen in vitro 3, erstatt kulturmediet med 0,5 milliliter varmet Leibovitz L-15 medium og vedlikehold nevronene i en time ved 37 grader Celsius. For trekkraftmikroskopi, slå på et laserskanningskonfokalt mikroskop og sett trinntoppen inkubator til 37 grader Celsius.Plasser nevronene på glassbunnsfatet på den forhåndsvarslete trinnstoppinkubatoren. Angi bildeanskaffelsesparametrene som beskrevet i menyskriptet, og velg en vekstkegle som sterkt uttrykker forbedret grønt fluorescensprotein eller EGFP. Fokuser på geloverflaten og få tidsforløpbilder.Når du er ferdig, bruker du en bildebehandlingsprogramvare til å produsere RGB-bildestakker med én kanal. Deretter lagrer du bildene som TIFF-filer. Deretter bruker du 100 mikroliter med 10% vekt ved volum natrium dodecylsulfat eller SDS oppløst i destillert vann til glassbunnsfatet for å slappe av gelsubstratet ved å frigjøre nevroner fra substratet.Inkuber deretter parabolen i scenen topp inkubator i fem minutter ved 37 grader Celsius for å stabilisere temperaturen. I laserskanning konfikale mikroskop, fokuser på geloverflaten for å få et bilde av perlene i det ubegrensede substratet. Lag et RGB-bilde med én kanal av perlene i det ubegrensede underlaget, og lagre dette bildet som en TIFF-fil.Last ned trekkraft analysekode TFM2021 og åpne TFM2021 i MATLAB. Åpne hoveddelen. m i TFM2021 og kjør den.Når et grafisk brukergrensesnitt vises på skjermen. Klikk på last utrent, substratbilde og velg X-Y posisjon korrigert perle bilde i det ubegrensede substratet. Gå for å laste fluorescerende perlebilder og velg tidsforløpstakken av bildeperler.Klikk deretter på last inn lysfeltbilder for å velge tidsforløpstakkbildet av lysfelt og bruk last inn GFP-bilder for å velge tidsforløpstakkbildet til EGFP. Fra rullegardinlisten på det grafiske brukergrensesnittet velger du GFP før du klikker på AVKASTNING for å angi rektangelområdet av interesse, inkludert vekstkjeglen, ved å klikke to punkter på det viste cellebildet. Når du er ferdig, klikker du på lagre-knappen på det grafiske brukergrensesnittet for å lagre de valgte stakkbildene sammen med avkastningen i en mattefil.Deretter klikker du på spotgjenkjenning og legger inn ønsket verdi i dialogboksen for å bestemme en terskel for perledeteksjon. Trykk ok for å starte beregningen. Etter å ha fullført beregningen, klikk på plottsporet for å forstørre regionen som er valgt tidligere og vise de oppdagede perlene som hvite prikker.Bruk utvalgte perler til å avgrense et polygonalt område som inneholder de riktige prikkene under vekstkjeglen. Deretter endres de hvite prikkene i det polygonale området til rødt ved å trykke enter på tastaturet. Klikk på estimatkraft i det grafiske brukergrensesnittet.Skriv deretter inn verdier for pikselstørrelsen og Youngs modulus som forklart i manuskriptet. Sett verdien for Poissons forhold som 0,3 og utfør estimatkraft for å starte beregningen. Programvaren vil lagre beregningsresultatene i et regneark format fil.Fluorescensbildene av en nevronal vekstkegle viste et høyt Lifeact-uttrykk som tillot visualisering av vekstkjeglemorfologi under en helt åpen og smal membran. HaloTag-actin-uttrykksnivåene var svært lave med svake signaler. Når membranen er en riktig innsnevret, reduseres bakgrunnssignalene og enkelt handling i flekker vises i vekstkjeglen.Forskere som på en hensiktsmessig måte oppnår alle trinnene, vil observere F-aktin retrograd strømning i vekstkjeglen. Stivheten til polyakrylamidgelen ble bestemt ved å beregne dybden av innrykk forårsaket på grunn av mikrosfærens vekt. Et laserskanningskonfokalt mikroskop ble brukt til å ta bilder av geloverflaten og bunnen av mikrosfæren.Signalene fra fluorescerende perler var ikke synlige på geloverflaten i det innrykkede området. Fluorescensbilder av perlene innebygd i polyakrylamidgelen og nevral vekstkjegle, viste perlene i deres opprinnelse og fordrevne posisjoner. EGFP-signalet om vekstkjeglen ble også observert.Kymografiene viste perlens bevegelser sammenlignet med en referanseperle. Når du utfører en enkelt flekkete avbildning, uttrykker viktige ting å velge en nevron som ukentlig uttrykker hvordan man skal handle under to et minimumsområde. Når du utfører en trekkraftmikroskopi, er høy forstørrelsesavbildning viktig for nøyaktig konsentrasjon av trekkraft.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones Video (Video) | JoVE

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric Analyses of Retinal Sections Video (Video) | JoVE

Morfometriske Analyser av netthinnens Seksjoner

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses Video (Video) | JoVE

Transretinal ERG Opptak fra Mouse Retina: Rod og Cone Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish Video (Video) | JoVE

Langsiktig Behavioral Sporing av frittsvømmende Weakly Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types Video (Video) | JoVE

Flowcytometrisystemer protokoller for Surface og Intracellulær Antigen Analyser av Neural celletyper

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina Video (Video) | JoVE

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics i Cone fotoreseptor Axon terminaler Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons Video (Video) | JoVE

Kvantifisering av Trådformede Actin (F-aktin) puncta i Rat kortikale nevroner

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy Video (Video) | JoVE

Peering på Brain Polysomes med Atomic Force Microscopy

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography Video (Video) | JoVE

Mikrostaten og Omega kompleksitet analyser av hvile-statlige Elektroencefalogram

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid Î² Effects in Cultured Mouse Neurons Video (Video) | JoVE

Visualisere Axonal vekst kjegle kollaps og tidlig Amyloid β effekter i kulturperler musen nerveceller

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...