Name: analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
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Esta pesquisa foi apoiada em parte pela AMED sob o número de subvenção 21gm0810011h0005 (N.I. e Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) e JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), a Fundação de Pesquisa Médica de Osaka para Doenças Incuráveis (T.M.), e o Naist Next Generation Interdisciplinar Research Project (Y.S.).

Os autores não têm nada a revelar.

Os protocolos descritos neste estudo utilizam materiais e equipamentos de microscopia disponíveis comercialmente encontrados rotineiramente em todos os laboratórios, institutos e universidades. Portanto, os pesquisadores podem facilmente adotar a atual microscopia de imagem de mancha única e força de tração em seus estudos.
A imagem de manchas pode analisar a polimerização de actin e o acoplamento da embreagem. Além disso, a imagem de manchas pode monitorar o fluxo retrógrado de moléculas de embreagem como shootin1 e cortactina, que interagem com f-actin fluxo retrógrado. Usando um microscópio TIRF, o fluxo retrógrado da molécula de adesão celular L1-CAM também pode ser monitorado23,41; O L1-CAM sofre comportamentos de aderência e deslizamento que refletem a eficiência do acoplamento de embreagem23,41. Embora o presente estudo empregue o sistema TMR-HaloTag para imagens de manchas, outras proteínas fluorescentes, como eGFP e proteína fluorescente vermelha monomérica, também estão disponíveis nas análises16,18,20,23,24,27,39. O essencial para visualizar as manchas de actina são um baixo nível de expressão de actina fluorescente e a iluminação de uma área mínima (Figura 2). Neste protocolo, os sinais lifeact e halotag-actin são adquiridos sequencialmente. Como o fluxo retrógrado da actina é relativamente lento (4,5 ± 0,1 μm/min)24, a análise do fluxo f-actin retrógrado e da polimerização de actina não são afetadas pela aquisição de imagem sequencial de diferentes canais fluorescentes (~1 s intervalo). Lifeact é um marcador F-actin amplamente utilizado, mas pode competir com proteínas de ligação actina47. De maior importância, o Lifeact pode alterar a dinâmica da actina, afetando assim as estruturas F-actin e a morfologia celular47,48,49.
Microscopia de força de tração pode detectar forças para impulsionar o avanço do cone de crescimento. Ao montar os neurônios dentro de uma matriz extracelular, os pesquisadores também podem analisar forças geradas em um ambiente semi-3D11. A imagem de alta ampliação é importante para uma quantificação precisa da força de tração porque os cones de crescimento geram forças de tração fracas7. Embora outros métodos com nanopillars ou biosensores sensíveis ao estresse também sejam usados para medir a força de tração50,51, o método baseado em gel paa é altamente adaptável e permite o ajuste da rigidez do substrato variando as concentrações de acrilamida e bis-acrilamida41,44,52. Neste protocolo, o gel PAA é preparado em uma concentração final de 3,75% de acrilamida e 0,03% de bis-acrilamida; O módulo de Young é ~270 Pa22 e essa rigidez está dentro da faixa de tecido cerebral (100-10.000 Pa)53,54,55. Devido à espessura do gel PAA (~100 μm), este método limita o uso de lentes de alta ampliação durante a microscopia. Para obter imagens de alta ampliação, os pesquisadores devem usar a função zoom em um microscópio confocal de varredura a laser.
Em conclusão, a atual microscopia de imagem e força de tração permite análises quantitativas dos principais eventos em vigor gerações. Essas informações serão inestimáveis para melhorar a compreensão dos mecanismos que fundamentam o avanço do cone de crescimento e a navegação.

No cérebro vertebrado em desenvolvimento, os neurônios passam por migrações elaboradamente organizadas e projetam axônios em direção a parceiros sinápticos apropriados para estabelecer redes neuronais funcionais1,2,3. Cones de crescimento, que são estruturas sensoriais e motil localizadas na ponta dos neurites, determinam a velocidade e a direção da migração neuronal e do crescimento do axônio3,4,5. Uma vez que os neurônios estão cercados por ambientes bem embalados, os cones de crescimento devem exercer forças contra seu ambiente para avançar6,7. Para entender os mecanismos subjacentes à migração neuronal e orientação axonal, as análises da mecânica molecular para o avanço do cone de crescimento são essenciais.
Décadas de análise revelaram que a força de tração para impulsionar o avanço do cone de crescimento é gerada pelo mecanismo de 'embreagem'; acredita-se que esse mecanismo funcione não apenas no cone de crescimento axonal, mas também no cone de crescimento do processo líder de neurônios migratórios8,9,10,11,12. Ou seja, filamentos de actina (F-actins) em cones de crescimento polimerizam na borda principal e despomerizam proximicamente, empurrando para fora a membrana de ponta13,14,15. A força resultante, em conjunto com a contração da actomyosina, induz o movimento para trás das F-actinas chamada fluxo retrógrado7,11,16,17,18,19,20,21. Moléculas de aderência e de aderência celular mediam o acoplamento mecânico entre o fluxo retrógrado F-actin e o substrato adesivo e transmitem a força do fluxo F-actin para o substrato, gerando assim força de tração para o avanço do cone de crescimento7,8,9,11,12,22 . Simultaneamente, o acoplamento actin-substrato reduz a velocidade de fluxo F-actin e converte a polimerização de actina na força para protuberinar a membrana de borda principal9,10.
Os cones de crescimento axonal sentem as pistas químicas locais e as transduzem em uma força motriz direcional para a navegação de cone de crescimento3,23,24,25. Por exemplo, uma molécula de orientação de axônio netrin-1 estimula seu receptor excluído no câncer colorretal (DCC), e ativa o triphosfato de guanosina rho (GTP) -vincula proteínas de divisão celular 42 (Cdc42) e substrato de toxina botulínica C3 1 (Rac1) e sua quinase a jusante p21-ativada quinase 1 (Pak1)26. Cdc42 e Rac1 promovem a polimerização de actina, e Pak1 fosforila uma molécula de embreagem dispara 122,26. O Shootin1 interage com o fluxo retrógrado F-actin através de uma proteína cortactin27 de ligação de actina. O Shootin1 também interage com a molécula de adesão celular L1 (L1-CAM)20,24. A fosforilação shootin1 aumenta as afinidades de ligação para cortactina e L1-CAM, e aumenta o acoplamento de embreagem 24,27 mediado por shootin1. Dentro do cone de crescimento, ativações assimétricas de polimerização de actina e acoplamento de embreagem aumentam 3) força de tração na lateral da fonte netrin-1, gerando assim força motriz direcional para a curva do cone de crescimento (Figura 1)24. Pesquisas intensivas nas últimas décadas em relação à migração neuronal e orientação do axônio aumentaram a compreensão das moléculas de orientação, seus receptores e associaram cascatas de sinalização a jusante2,10,28,29,30. No entanto, as máquinas moleculares para gerar forças para o avanço do cone de crescimento estão apenas começando a ser elucidadas; isso pode ser atribuído ao uso limitado dos protocolos para análises mecanobiológicas.
O presente estudo descreve um protocolo detalhado para o monitoramento do fluxo retrógrado F-actin por imagem de uma única mancha16,18. O monitoramento do fluxo retrógrado F-actin tem sido extensivamente realizado utilizando microscopia de super-resolução, microscopia confocal de disco giratório e fluorescência de reflexo de interferência total (TIRF) microscopia25,31,32,33,34,35,36,37,38 . O protocolo do presente estudo, no entanto, utiliza um microscópio de epifluorescência padrão e, portanto, é prontamente adotável11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. Quando combinada com a rotulagem F-actin por Lifeact43, a imagem de mancha única permite quantificações da taxa de polimerização de actina e da eficiência de acoplamento de embreagem entre o fluxo f-actin retrógrado e o substrato adesivo39,42. O presente estudo descreve ainda um protocolo detalhado de microscopia de força de tração utilizando um gel de poliacrilamida fluorescente (PAA) 11,22,23,24,27,39,41,42,44. Este método detecta e quantifica a força de tração sob o cone de crescimento monitorando movimentos de contas induzidos pela força44,45. Um código de análise de força de tração de código aberto é fornecido, e o método para quantificar a força de tração durante a migração do cone de crescimento é explicado em detalhes. Com o auxílio de imagens de partículas simples e microscopia de força de tração, a compreensão da mecânica molecular subjacente à migração do cone de crescimento e da navegação será facilitada. Essas técnicas também são aplicáveis para analisar a mecânica molecular subjacente ao alargamento da coluna dendrítica, que é conhecido por ser importante na aprendizagem e na memória42.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% trypan blue stain solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00809-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albmine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421787-9970-799</td>
			<td>Objective lens (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (diameter 18 mm)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C018001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16806-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open source software package</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>carboxylate-modified microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (14 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1130H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (27 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882-10X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBO103 W/2</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300382128</td>
			<td>Mercury lamp (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution from mouse EHS tumor</td>
			<td>Wako</td>
			<td>120-05751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16919-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Conforcal laser microscope (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB2018a</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse C57BL/6</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse neuron nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>22402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>AAD-1001</td>
			<td>Electroporation apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td>CMOS camera (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26036-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parallel Computing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>1528177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFN21A-HaloTag-actin</td>
			<td>(Minegishi et al., 2018)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420790-9901-000</td>
			<td>Objective lens (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td>
			<td>(Kastian et al., 2021)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slulfo-SAMPHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08933-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrate (NaOH)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>Sako tekkou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2009</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (single speckle imaging)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance

Para estabelecer redes funcionais, os neurônios devem migrar para seus destinos apropriados e, em seguida, estender axônios em direção às suas células-alvo. Esses processos dependem dos avanços dos cones de crescimento que se localizaram nas pontas dos neurites. Cones de crescimento axonal geram forças motrizes ao sentir seu microambiente local e modular a dinâmica citoesquelletal e o acoplamento de adesão de actina (acoplamento de embreagem). Décadas de pesquisa levaram à identificação de moléculas de orientação, seus receptores e cascatas de sinalização a jusante para regular a migração neuronal e orientação axonal; no entanto, as máquinas moleculares necessárias para gerar forças para impulsionar o avanço do cone de crescimento e a navegação estão apenas começando a ser elucidadas. Na ponta dos cones de crescimento neuronal, os filamentos de actina sofrem fluxo retrógrado, que é alimentado pela polimerização de actina e contração de actomyosina. Um acoplamento de embreagem entre o fluxo retrógrado F-actin e o substrato adesivo gera forças de tração para o avanço do cone de crescimento. O presente estudo descreve um protocolo detalhado para monitorar o fluxo retrógrado F-actin por imagem de uma única mancha. É importante ressaltar que, quando combinada com um marcador F-actin Lifeact, esta técnica pode quantificar 1) a taxa de polimerização F-actin e 2) a eficiência de acoplamento de embreagem entre o fluxo retrógrado F-actin e o substrato adesivo. Ambas são variáveis críticas para a geração de forças para o avanço do cone de crescimento e navegação. Além disso, o presente estudo descreve um protocolo detalhado de microscopia de força de tração, que pode quantificar 3) força de tração gerada por cones de crescimento. Assim, acoplando as análises de imagens de partículas simples e microscopia de força de tração, os pesquisadores podem monitorar a mecânica molecular subjacente ao avanço do cone de crescimento e navegação.

Imagem de uma única mancha para quantificar a taxa de polimerização de actina e eficiência de acoplamento de embreagem Uma expressão de alta lifeact permite a visualização de F-actin dentro do cone de crescimento; uma expressão de halotag-actina baixa permite o monitoramento do fluxo retrógrado F-actin (Figura 3, Arquivo Suplementar 2). O rastreamento das manchas de actina permite a medição da velocidade de fluxo F-actin (Figura 3C,D). Uma vez que o acoplamento mecânico do fluxo retrógrado F-actin e o substrato adesivo reduz a velocidade de fluxo F-actin, a eficiência do acoplamento da embreagem pode ser estimada a partir da velocidade. Além disso, a rotulagem F-actin com lifeact auxilia a visualização da extensão F-actin e é útil para quantificar a taxa de polimerização de actina (Figura 3E,F).
Análise quantitativa da força de tração A adesão rigorosa à metodologia aqui apresentada revelará os movimentos das contas fluorescentes sob o cone de crescimento (Figura 6C, Arquivo Suplementar 4). F-actin fluxo retrógrado para o substrato gera força de tração fazendo com que as contas fluorescentes se movam para trás sob o cone de crescimento. O código de análise da força de tração estima a força de tração do deslocamento fluorescente das contas, e expressa a força de tração calculada como vetor de força. A direção e a magnitude da força de tração são determinadas a partir dos componentes x e y do vetor de força (Figura 8C,D). A caixa vermelha na Figura 8D representa os componentes x e y de um vetor de força; A Figura 8C retrata o cone de crescimento correspondente. Em termos de coordenadas x-y, o vetor aponta para -93,8° contra o eixo x; esta orientação é direcionada para a parte traseira do cone de crescimento (Figura 8C). A magnitude da força de tração F foi calculada da seguinte forma:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg">
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg"> Figura 1: Uma máquina de cone de crescimento para geração de força e navegação de cone de crescimento. Um gradiente de quimioattractant netrin-1 induz a estimulação assimétrica de seu receptor DCC em um cone de crescimento axonal. Isso ativa rac1 e Cdc42, e seu Pak1 de quinase a jusante. Rac1 e Cdc42 promovem (1) polimerização de actina, enquanto pak1 fosforilatos disparam1, aumentando o acoplamento de embreagem mediado por 1 a tiros (2). A ativação assimétrica da dinâmica do actin e o acoplamento da embreagem dentro do cone de crescimento aumenta (3) a força de tração na lateral da fonte netrin-1, gerando assim uma força motriz direcional para a atração do cone de crescimento. Os protocolos aqui apresentados permitem a quantificação das variáveis-chave (1)-(3) para a navegação de cone de crescimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg"> Figura 2: Imagens de fluorescência de um cone de crescimento neuronal sob um diafragma totalmente aberto e estreito. O cone de crescimento expressa Lifeact e HaloTag-actin. (A) Uma expressão de alta lifeact permite a visualização da morfologia do cone de crescimento. Por outro lado, os níveis de expressão halotag-actin são muito baixos, com sinais fracos quando o diafragma está totalmente aberto. (B) Quando o diafragma é apropriadamente reduzido, os sinais de fundo diminuem e as manchas de actina única aparecem no cone de crescimento. Barras de escala: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg"> Figura 3: Etapas para quantificar a velocidade de fluxo F-actin e a taxa de polimerização de actina usando um software de processamento e análise de imagem Fiji. (A) Ajuste o ângulo da imagem para análise. (1) Encontre e selecione uma mancha de actin (ponta de flecha) que flui em um feixe F-actin. (2) Selecione > de imagem Transformar > rota. (3) Defina o ângulo para que o feixe F-actin seja direcionado para cima. (4) O ângulo da imagem será alterado. (B) Demarcar a região, incluindo a mancha de actina e o feixe F-actin. (1) Clique em Retângulo na barra de ferramentas. (2) Delineie uma região na imagem. O brilho e o contraste da imagem são aumentados para permitir uma visualização clara da mancha de actina e da ponta do feixe F-actin. (3) Selecione a > duplicata da imagem. (4) Insira os cinco períodos de tempo que mostram o fluxo de manchas de actina no feixe F-actin. (5) A imagem da pilha selecionada aparecerá na tela. (C) Sobreposição circula sobre a mancha de actina. (1) Clique em Oval na barra de ferramentas. (2) Desenhe um círculo sobre uma mancha de actina. (3) Selecione A sobreposição de > de imagem > adicionar seleção. (4) O círculo está sobreposto. 5) Repita sobreposição dos círculos sobre as manchas restantes de actin. (D) Meça a distância de translocação das manchas de actina durante os cinco períodos de tempo. (1) Clique em Reta na barra de ferramentas. (2) Desenhe uma linha que ligue os centros dos círculos. (3) Selecione Analisar > Medida. O resultado, indicado pelo parâmetro Altura (caixa vermelha), retransmitindo a distância de translocação de manchas de actina. (E) Meça a alteração no comprimento da saliência F-actin durante os cinco períodos de tempo. (1) Desenhe uma linha que vincule as pontas da saliência F-actin. (2) Selecione Analisar > Medida. O resultado (caixa vermelha), Altura, indica o comprimento de extensão do feixe F-actin. (F) A taxa de polimerização de actina é calculada a partir da soma da velocidade de fluxo F-actin e da taxa de extensão. Veja também arquivo suplementar 2. O Arquivo Suplementar 3 auxilia os investigadores a praticar a metodologia descrita acima. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg"> Figura 4: Passos para a preparação do gel PAA. Consulte o passo 7.1 para obter uma descrição detalhada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg"> Figura 5: Determinação da rigidez do gel paa. (A) Um método de recuo da microesfera. Quando uma microesfera é colocada em um gel PAA fluorescente embutido em contas, o peso da microesfera causa um recuo no gel. A profundidade do recuo é calculada subtraindo as posições z da superfície do gel PAA da parte inferior da microesfera (B,C) Imagens de fluorescência de um gel paa recuado por uma microesfera e contendo contas fluorescentes. Um microscópio confocal de varredura a laser foi usado para capturar imagens da superfície do gel (B) e da parte inferior da microsfera (C). Os sinais das contas fluorescentes não são visíveis na superfície do gel na região recuada (B, círculo). Eles podem, no entanto, ser observados na parte inferior da microesfera. Barras de escala: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg"> Figura 6: Mapeamento de força de um cone de crescimento neuronal. (A-C) Imagens de fluorescência de contas embutidas em um gel PAA e um cone de crescimento neural visualizado com EGFP. Após a aquisição de imagens de lapso de tempo (A), o neurônio foi liberado do substrato de gel aplicando a solução SDS, e uma imagem das contas no substrato não treinado foi capturada (B). (C) A imagem das contas no substrato não treinado mostra as contas em suas posições originais (verdes) e deslocadas (vermelhas). O sinal EGFP do cone de crescimento é mostrado em azul. Os kymógrafos (à direita) mostram os movimentos das contas em intervalos de 3 s durante uma duração de 147 s, indicadas pelas setas nas áreas encaixotadas 1 e 2. A conta na área 2 é uma conta de referência. Barras de escala: 2 μm para (A), (B) e (C, esquerda) e 1 μm para (C, médio). Veja também arquivo suplementar 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg"> Figura 7: Passos para a posição x-y de correção da imagem de contas em substrato não treinado usando Fiji. (A) Concatenar a imagem da conta em substrato não treinado com a imagem de pilha de lapso de tempo de contas fluorescentes. (1) Selecione > de imagens > Ferramentas > Concatenato. (2) Selecione a imagem das contas em substrato não treinado e a imagem da pilha de lapso de tempo de contas fluorescentes na Imagem1 e na Imagem2, respectivamente. Clique em OK. (3) A imagem da conta no substrato não treinado é adicionada à imagem da pilha de lapso de tempo. (B) Corrija a posição x-y da imagem fluorescente da conta. (1) Use a barra de rolagem (quadro vermelho) para selecionar o segundo quadro (seta vermelha) na pilha de imagens. (2) Selecione Plugins > StackReg. (3) Selecione corpo rígido na lista de gotas (quadro vermelho) e clique em OK. A correção da posição x-y começará. (C) Salve a imagem de contas corrigida por posição x-y. Depois de selecionar o primeiro quadro da imagem de pilha corrigida por x-y, (1) selecione Imagem > Duplicar. (2) entrada 1 na pilha de intervalo e desmarcação duplicada. Em seguida, clique em OK. (3) a imagem de contas corrigida por posição x-y no substrato não treinado aparecerá na tela. Salve esta imagem como um arquivo de disputa. O Arquivo Suplementar 6 auxilia os investigadores a praticar a metodologia descrita acima. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg"> Figura 8: Análise da força de tração sob um cone de crescimento neuronal utilizando um código de análise de força de tração de código aberto. (A) GUI para análise da força de tração. As imagens de lapso de tempo selecionadas na GUI podem ser confirmadas na lista suspensa e com o controle deslizante indicado (caixa vermelha). (B) Selecione uma região que inclua o cone de crescimento. (1) Clique no ROI na GUI. Com o cursor do mouse, especifique dois pontos (pontas de seta) na imagem do celular. (2) Uma caixa vermelha aparecerá na imagem do celular. Dois cliques determinam a localização de dois cantos. (C) Selecione as contas detectadas (pontos brancos) sob o cone de crescimento. (1) Na GUI, clique em Selecionar contas e demarca uma região poligonal que inclua o cone de crescimento clicando. Pressione a tecla Enter . (2) Os pontos brancos dentro da região poligonal se transformarão em uma cor vermelha. (D) Resultados calculados da direção e magnitude da força de tração. A caixa vermelha na planilha representa os componentes x e y do vetor de força, estimados pela análise da força de tração. Na coordenada x-y no painel direito, o vetor de força gerado pelo cone de crescimento aponta para -93,8° contra o eixo x; esta orientação é direcionada para a parte traseira do cone de crescimento em (C). O Arquivo Suplementar 6 auxilia os investigadores a praticar a metodologia descrita acima. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Arquivo Suplementar 1: Receitas de soluções e mídias utilizadas neste estudo. Consulte o texto para uso detalhado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%201-63227R1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Arquivo suplementar 2: Imagem de fluorescência de Lifeact e imagem de manchas fluorescentes de HaloTag-actin em um cone de crescimento nervoso. Lifeact (verde) e HaloTag-actin (magenta). As imagens foram adquiridas a cada 3 s por uma duração total de 147 s. Barra de escala: 2 μm. Veja também Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%202.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 3: Pratique dados para quantificar a velocidade de fluxo F-actin e a taxa de polimerização de actina. Uma imagem multicanal de pilha de lapso de tempo de Lifeact (verde) e HaloTag-actin (magenta). Veja também a Figura 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental%20file%203.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 4: Um vídeo de mapeamento de força detectando força de tração em um cone de crescimento neuronal. As posições originais (verdes) e deslocadas (vermelhas) das contas. O sinal EGFP no cone de crescimento é mostrado em azul. As imagens foram adquiridas a cada 3 s por 147 s. Barra de escala: 2 μm. Veja também Figura 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%204.mp4" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 5: Código de análise da força de tração. Consulte o Passo 8.12 para uso detalhado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%205.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 6: Pratique dados para quantificar a força de tração. Uma imagem RGB de um único canal das contas em substrato não treinado e imagens RGB de pilha de tempo de um único canal de contas fluorescentes sob um cone de crescimento, EGFP e campo brilhante. Veja também as Figuras 7 e 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%206.zip" target="_blank">Clique aqui para baixar este Arquivo.</a>

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Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video (Video) | JoVE

Para avançar, os cones de crescimento devem exercer forças de tração contra o ambiente externo. A geração de forças de tração depende da dinâmica actin e do acoplamento da embreagem. O presente estudo descreve métodos para analisar a dinâmica do actin, acoplamento de embreagem e forças de tração para o avanço do cone de crescimento.

Análises da Actin Dynamics, Clutch Coupling e Força de Tração para o Avanço do Cone de Crescimento

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

A análise de acoplamento de imagens de partículas simples e força de tração microscópica pode analisar máquinas moleculares para avanço de cone de crescimento e navegação. Como as técnicas usam materiais disponíveis comercialmente e microscópios padrão. Os pesquisadores podem literalmente adaptar-se às técnicas em seus estudos.Comece tratando os neurônios com tetrametil-rhodamina ou ligante TMR a uma diluição de um a 2000 em meio de cultura no dia in vitro 3. Em seguida, mantenha os neurônios a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por uma hora. Após a incubação, lave o ligante TMR três vezes com PBS pré-aquecido.Remova o PBS antes de adicionar 0,5 mililitros do meio L-15 de Leibovitz aquecido nos neurônios. Mantenha os neurônios a 37 graus Celsius por uma hora. Em seguida, ligue um microscópio de epifluorescência e coloque a incubadora superior do estado em 37 graus Celsius.Em seguida, coloque os neurônios tratados tmr na placa de fundo de vidro na incubadora superior do palco aquecido. Defina os parâmetros de aquisição de imagem, como tempo de exposição em 500 milissegundos para um lifeact e canais de fluorescência de ato de HaloTag e binning como 0,065 míclico por 0,065 mígdo por pixel no intervalo de tempo de três segundos para 50 quadros. Depois de selecionar um cone de crescimento que expressa fortemente lifeact e expressa semanalmente HaloTag-actin.Feche o campo no diafragma para iluminar uma área mínima que inclua o cone de crescimento e adquira imagens de lapso de tempo. No dia in vitro 3, substitua o meio de cultura por 0,5 mililitros de meio L-15 de Leibovitz aquecido e mantenha os neurônios por uma hora a 37 graus Celsius. Para microscopia de força de tração, ligue um microscópio confocal de varredura a laser e coloque a incubadora superior do palco em 37 graus Celsius.Coloque os neurônios na placa de fundo de vidro na incubadora superior do palco pré-avisada. Defina os parâmetros de aquisição de imagem conforme descrito no script do menu e selecione um cone de crescimento que expresse fortemente proteína de fluorescência verde aprimorada ou EGFP. Concentre-se na superfície do gel e adquira imagens de lapso de tempo.Quando feito, use um software de processamento de imagem para produzir pilhas de imagens RGB de lapso de tempo de um único canal. Em seguida, salve as imagens como arquivos de tiff. Em seguida, aplique 100 microliters de 10% de peso em volume sulfato de dodecyl de sódio ou SDS dissolvido em água destilada ao prato inferior de vidro para relaxar o substrato de gel liberando neurônios do substrato.Em seguida, incubar o prato na incubadora superior do palco por cinco minutos a 37 graus Celsius para estabilizar a temperatura. No microscópio confocal de varredura a laser, concentre-se na superfície do gel para adquirir uma imagem das contas no substrato não treinado. Produza uma imagem RGB de um único canal das contas no substrato não treinado e salve esta imagem como um arquivo de tiff.Baixe o código de análise de força de tração TFM2021 e abra o TFM2021 no MATLAB. Aberto principal. m em TFM2021 e executá-lo.Quando uma interface gráfica do usuário aparece na tela. Clique na imagem de carga não treinada, substrato e selecione a imagem de contas corrigida da posição X-Y no substrato não treinado. Vá carregar imagens fluorescentes e selecione a pilha de contas de lapso de tempo de contas de imagem.Em seguida, clique em carregar imagens de campo brilhante para escolher a imagem de pilha de lapso de tempo do campo brilhante e usar imagens de GFP de carga para selecionar a imagem de pilha de lapso de tempo do EGFP. A partir da lista suspensa na interface gráfica do usuário, selecione GFP antes de clicar no ROI para especificar a região de interesse do retângulo, incluindo o cone de crescimento, clicando em dois pontos na imagem da célula exibida. Uma vez feito clique no botão salvar na interface gráfica do usuário para salvar as imagens selecionadas em pilha junto com o ROI em um arquivo de tapete.Em seguida, clique no local detectar e inserir um valor desejado na caixa de diálogo para determinar um limiar para detecção de contas. Bata bem para começar o cálculo. Após terminar o cálculo, clique na faixa de plot para ampliar a região selecionada anteriormente e exibir as contas detectadas como pontos brancos.Use contas selecionadas para demarcar uma região poligonal que inclua os pontos corretos sob o cone de crescimento. Em seguida, pressionando enter no teclado, os pontos brancos dentro da região poligonal se transformarão em vermelho. Clique na força de estimativa na interface gráfica do usuário.Em seguida, valores de entrada para o tamanho do pixel e módulo de Young como explicado no manuscrito. Coloque o valor da razão de Poisson como 0,3 e execute a força de estimativa para iniciar o cálculo. O software salvará os resultados de cálculo em um arquivo de formato de planilha.As imagens de fluorescência de um cone de crescimento neuronal mostraram uma expressão de vida alta permitindo a visualização da morfologia do cone de crescimento sob um diafragma totalmente aberto e estreito. Os níveis de expressão halotag-actin eram muito baixos com sinais fracos. Quando o diafragma é um apropriadamente estreito, os sinais de fundo diminuem e ato único em manchas aparecem no cone de crescimento.Pesquisadores que apropriadamente alcançarem todas as etapas observarão f-actin fluxo retrógrado no cone de crescimento. A rigidez do gel de poliacrilamida foi determinada pelo cálculo da profundidade do recuo causado devido ao peso da microesfera. Um microscópio confocal de varredura a laser foi usado para capturar imagens da superfície do gel e da parte inferior da microesfera.Os sinais das contas fluorescentes não eram visíveis na superfície do gel na região recuada. Imagens de fluorescência das contas embutidas no gel de poliacrilamida e no cone de crescimento neural, mostraram as contas em sua origem e posições deslocadas. Também foi observado o sinal EGFP do cone de crescimento.Os kymographs exibiram os movimentos da conta em comparação com uma conta de referência. Ao realizar uma única imagem de manchas, coisas importantes para selecionar um neurônio que semanalmente expressa como agir sob duas uma área mínima. Ao realizar uma microscopia de força de tração, a alta imagem de ampliação é importante para uma concentração precisa da força de tração.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

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Rotulagem F-actina Termina farpado com Rodamina-actina em permeabilizadas Cones de Crescimento Neuronal

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Neurociência

Morphometric Analyses of Retinal Sections

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Análises morfométricas de secções da retina

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses Video (Video) | JoVE

Transretinal Recordings ERG de Retina do mouse: Rod e Photoresponses Cone

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish Video (Video) | JoVE

Longo prazo Behavioral Rastreamento de Livremente Natação fracamente elétrico dos peixes

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

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Citometria de Fluxo protocolos para a superfície e intracelular Antigen análises de tipos de células neurais

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina Video (Video) | JoVE

Imagem Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamics nos terminais Cone fotorreceptores Axon do mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons Video (Video) | JoVE

Quantificação de filamentosas actina (F-actina) puncta no Rat neurônios corticais

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy Video (Video) | JoVE

Olhando para Cérebro polissomos com Microscopia de Força Atômica

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography Video (Video) | JoVE

Microestado e análises de complexidade Omega de eletroencefalografia a estado descansando

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid Î² Effects in Cultured Mouse Neurons Video (Video) | JoVE

Visualizando o colapso do Cone de crescimento Axonal e primeiros efeitos β amiloide nos neurônios cultivados Mouse

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...