Name: analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video at JoVE.com

Это исследование было частично поддержано AMED под номером гранта 21gm0810011h0005 (N.I. и Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) и JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Inzable Diseases (T.M.) и NAIST Next Generation Interdisciplinary Research Project (Y.S.).

Авторам нечего раскрывать.

Протоколы, описанные в этом исследовании, используют коммерчески доступные материалы и оборудование для микроскопии, обычно встречающееся во всех лабораториях, институтах и университетах. Таким образом, исследователи могут легко принять нынешнюю однопятнистую визуализацию и микроскопию силы тяги в своих исследованиях.
Спекл-визуализация может анализировать полимеризацию актина и муфту сцепления. Кроме того, спекл-визуализация может контролировать ретроградный поток молекул сцепления, таких как shootin1 и кортактин, которые взаимодействуют с ретроградным потоком F-актина. С помощью микроскопа TIRF можно также контролировать ретроградный поток молекулы клеточной адгезии L1-CAM23,41; L1-CAM подвергается сцеплению и скольжению, которое отражает эффективность сцепления сцепления23,41. Хотя в настоящем исследовании используется система TMR-HaloTag для спекл-визуализации, другие флуоресцентные белки, такие как EGFP и мономерный красный флуоресцентный белок, также доступны в анализе16,18,20,23,24,27,39. Основными условиями для визуализации актиновых пятен являются низкий уровень экспрессии флуоресцентного актина и освещенность минимальной площади (рисунок 2). В этом протоколе последовательно приобретаются сигналы Lifeact и HaloTag-actin. Поскольку ретроградный поток актина относительно медленный (4,5 ± 0,1 мкм/мин)24, анализ ретроградного потока F-актина и полимеризации актина не зависит от последовательного получения изображения различных флуоресцентных каналов (интервал ~ 1 с). Lifeact является широко используемым маркером F-актина, но может конкурировать с актин-связывающими белками47. Кроме того, Lifeact может изменять динамику актина, тем самым влияя на структуры F-актина и морфологию клеток47,48,49.
Микроскопия тяговой силы может обнаруживать силы, стимулирующие продвижение конуса роста. Устанавливая нейроны во внеклеточном матриксе, исследователи также могут анализировать силы, генерируемые в полу-3D-среде11. Визуализация с высоким увеличением важна для точной количественной оценки силы тяги, поскольку конусы роста генерируют слабые тяговые силы7. Хотя другие методы с нанопилларами или стресс-чувствительными биосенсорами также используются для измерения силы тяги50,51, метод на основе геля PAA обладает высокой степенью адаптации и позволяет регулировать жесткость подложки путем изменения концентраций акриламида и бис-акриламида41,44,52. В этом протоколе гель PAA готовят в конечной концентрации 3,75% акриламида и 0,03% бис-акриламида; Модуль Юнга составляет ~ 270 Pa22, и эта жесткость находится в диапазоне мозговой ткани (100-10 000 Па) 53,54,55. Из-за толщины геля PAA (~ 100 мкм) этот метод ограничивает использование линз с высоким увеличением во время микроскопии. Чтобы получить изображения с высоким увеличением, исследователи должны использовать функцию масштабирования в лазерном сканирующем конфокальном микроскопе.
В заключение, существующая спекл-визуализация и микроскопия силы тяги позволяют проводить количественный анализ ключевых событий в силовых поколениях. Эта информация будет иметь неоценимое значение для улучшения понимания механизмов, лежащих в основе продвижения конуса роста и навигации.

В развивающемся мозге позвоночных нейроны подвергаются тщательно организованным миграциям и проецируют аксоны к соответствующим синаптическим партнерам для создания функциональных нейронных сетей1,2,3. Ростовые колбочки, представляющие собой сенсорные и подвижные структуры, расположенные на кончике нейритов, определяют скорость и направление миграции нейронов и роста аксонов3,4,5. Поскольку нейроны окружены плотно упакованными средами, ростовые колбочки должны оказывать силы против окружающей среды, чтобы двигаться вперед6,7. Чтобы понять механизмы, лежащие в основе миграции нейронов и аксонального руководства, необходим анализ молекулярной механики для продвижения конуса роста.
Десятилетия анализа показали, что тяговая сила для стимулирования продвижения конуса роста генерируется механизмом «сцепления»; считается, что этот механизм функционирует не только в аксональном конусе роста, но и в конусе роста ведущего процесса мигрирующих нейронов8,9,10,11,12. А именно, актиновые нити (F-актины) в ростовых шишках полимеризуются на переднем крае и деполимеризуются проксимально, выталкивая переднюю мембрану13,14,15. Результирующая сила в сочетании с сокращением актомиозина индуцирует движение F-актинов назад, называемое ретроградным потоком7,11,16,17,18,19,20,21. Молекулы сцепления и клеточной адгезии опосредуют механическую связь между ретроградным потоком F-актина и адгезивной подложкой и передают силу потока F-актина на подложку, тем самым создавая тяговое усилие для продвижения конуса роста7,8,9,11,12,22 . Одновременно связь актин-подложка снижает скорость потока F-актина и преобразует полимеризацию актина в силу, при которой выступает передняя мембрана9,10.
Аксональные конусы роста воспринимают локальные химические сигналы и преобразуют их в направленную движущую силу для навигации по конусу роста3,23,24,25. Например, аксонная направляющая молекула нетрин-1 стимулирует свой рецептор, удаленный при колоректальном раке (DCC), и активирует Rho guanosine triphosphate (GTP)-связывающие белки клеточного деления белка 42 (Cdc42) и ras-связанного субстрата ботулинического токсина C3 1 (Rac1) и их последующую киназу p21-активированную киназу 1 (Pak1)26. Cdc42 и Rac1 способствуют 1) полимеризации актина, а Pak1 фосфорилирует молекулу сцепления shootin122,26. Shootin1 взаимодействует с ретроградным потоком F-актина через актин-связывающий белок кортактин27. Shootin1 также взаимодействует с молекулой адгезии клеток L1 (L1-CAM)20,24. Фосфорилирование Shootin1 увеличивает сродство связывания кортактина и L1-CAM и усиливает shootin1-опосредованное 2) сцепление 24,27. Внутри конуса роста асимметричные активации полимеризации актина и сцепления увеличивают 3) тяговое усилие на стороне источника нетрина-1, тем самым генерируя направленную движущую силу для поворота конуса роста (рисунок 1)24. Интенсивные исследования за последние несколько десятилетий в отношении миграции нейронов и руководства аксонами улучшили понимание направляющих молекул, их рецепторов и связанных с ними нисходящих сигнальных каскадов2,10,28,29,30. Однако молекулярные механизмы для создания сил для продвижения конуса роста только начинают проясняться; это может быть связано с ограниченным использованием протоколов механобиологического анализа.
В настоящем исследовании описывается подробный протокол мониторинга ретроградного потока F-актина с помощью односпеклической визуализации16,18. Мониторинг ретроградного потока F-актина широко проводился с использованием микроскопии сверхвысокого разрешения, конфокальной микроскопии со спиннинговым диском и флуоресценции полного интерференционного отражения (TIRF)25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Протокол в настоящем исследовании, однако, использует стандартный эпифлуоресцентный микроскоп и, таким образом, легко принимается11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. В сочетании с маркировкой F-актина Lifeact43 однокрапчатая визуализация позволяет количественно оценить скорость полимеризации актина и эффективность связи сцепления между ретроградным потоком F-актина и адгезивной подложкой39,42. В настоящем исследовании далее описывается подробный протокол тракционной силовой микроскопии с использованием флуоресцентного полиакриламида (PAA) геля11,22,23,24,27,39,41,42,44. Этот метод обнаруживает и количественно оценивает тяговую силу под конусом роста путем мониторинга движений бусин, вызванных силой44,45. Приведен код анализа тяговой силы с открытым исходным кодом, а также подробно объяснен метод количественной оценки тяговой силы во время миграции конуса роста. С помощью однокрапчатой визуализации и микроскопии силы тяги будет облегчено понимание молекулярной механики, лежащей в основе миграции конуса роста и навигации. Эти методы также применимы для анализа молекулярной механики, лежащей в основе дендритного увеличения позвоночника, что, как известно, важно для обучения и памяти42.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% trypan blue stain solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00809-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albmine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421787-9970-799</td>
			<td>Objective lens (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (diameter 18 mm)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C018001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16806-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open source software package</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>carboxylate-modified microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (14 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1130H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (27 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882-10X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBO103 W/2</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300382128</td>
			<td>Mercury lamp (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution from mouse EHS tumor</td>
			<td>Wako</td>
			<td>120-05751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16919-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Conforcal laser microscope (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB2018a</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse C57BL/6</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse neuron nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>22402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>AAD-1001</td>
			<td>Electroporation apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td>CMOS camera (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26036-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parallel Computing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>1528177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFN21A-HaloTag-actin</td>
			<td>(Minegishi et al., 2018)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420790-9901-000</td>
			<td>Objective lens (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td>
			<td>(Kastian et al., 2021)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slulfo-SAMPHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08933-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrate (NaOH)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>Sako tekkou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2009</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (single speckle imaging)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance

Чтобы создать функциональные сети, нейроны должны мигрировать в соответствующие места назначения, а затем расширять аксоны к своим клеткам-мишеням. Эти процессы зависят от продвижения ростовых колбочек, которые расположены на кончиках нейритов. Аксональные конусы роста генерируют движущие силы, ощущая их локальное микроокружение и модулируя динамику цитоскелета и актин-адгезионную связь (сцепление). Десятилетия исследований привели к идентификации направляющих молекул, их рецепторов и нисходящих сигнальных каскадов для регулирования миграции нейронов и аксонального руководства; однако молекулярные механизмы, необходимые для генерации сил для продвижения конуса роста и навигации, только начинают выясняться. На переднем крае колбочек роста нейронов актиновые нити подвергаются ретроградному потоку, который питается полимеризацией актина и сокращением актизина. Муфта сцепления между ретроградным потоком F-актина и адгезивной подложкой создает тяговые силы для продвижения конуса роста. В настоящем исследовании описывается подробный протокол мониторинга ретроградного потока F-актина с помощью однокрапчатой визуализации. Важно отметить, что в сочетании с маркером F-актина Lifeact этот метод может количественно оценить 1) скорость полимеризации F-актина и 2) эффективность связи сцепления между ретроградным потоком F-актина и адгезивной подложкой. Оба являются критическими переменными для создания сил для продвижения конуса роста и навигации. Кроме того, настоящее исследование описывает подробный протокол микроскопии силы тяги, который может количественно оценить 3) тяговую силу, генерируемую конусами роста. Таким образом, объединив анализ односпеклевой визуализации и микроскопии силы тяги, исследователи могут контролировать молекулярную механику, лежащую в основе продвижения конуса роста и навигации.

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video at JoVE.com

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video (Video) | JoVE

Чтобы продвинуться вперед, конусы роста должны оказывать тяговые силы против внешней среды. Генерация тяговых сил зависит от динамики актина и сцепления сцепления. В настоящем исследовании описаны методы анализа динамики актина, сцепления сцепления и тяговых сил для продвижения конуса роста.

Анализ динамики актина, сцепления сцепления и тяговой силы для продвижения конуса роста

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

Анализ связи однокраплевой визуализации и микроскопической силы тяги может анализировать молекулярные механизмы для продвижения конуса роста и навигации. В качестве методик используются коммерчески доступные материалы и стандартные микроскопы. Исследователи могут буквально адаптироваться к методам в своих исследованиях.Начинают с обработки нейронов тетраметилродамином или лигандом TMR в разведении от одного до 2000 в питательной среде в день in vitro 3. Затем поддерживайте нейроны на уровне 37 градусов цельсия с 5% углекислого газа в течение одного часа. После инкубации промыть лиганд TMR три раза предварительно подогретым PBS.Удалите PBS перед добавлением 0,5 миллилитра подогретой среды L-15 Лейбовица в нейроны. Поддерживайте нейроны на уровне 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Затем включите эпифлуоресцентный микроскоп и установите состояние верхнего инкубатора на 37 градусов по Цельсию.Затем поместите обработанные лигандом TMR нейроны в стеклянную нижнюю чашку на разогретом верхнем инкубаторе. Установите параметры получения изображения, такие как время экспозиции в 500 миллисекунд для флуоресцентных каналов Lifeact и HaloTag-actin и биннинг как 0,065 мкм на 0,065 мкм на пиксель с интервалом времени в три секунды для 50 кадров. После выбора ростового конуса, который сильно выражает Lifeact и еженедельно выражает HaloTag-актин.Закройте поле на диафрагме, чтобы осветить минимальную область, включающую конус роста, и получить покадровые изображения. В день in vitro 3 замените культуральную среду 0,5 миллилитрами нагретой среды L-15 Лейбовица и поддерживайте нейроны в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Для тракционной силовой микроскопии включите лазерный сканирующий конфокальный микроскоп и установите верхний инкубатор на 37 градусов цельсия.Поместите нейроны на стеклянную нижнюю тарелку на заранее предупрежденном верхнем инкубаторе. Задайте параметры получения изображения, как описано в сценарии меню, и выберите конус роста, который сильно выражает усиленный зеленый флуоресцентный белок или EGFP. Сосредоточьтесь на поверхности геля и получайте покадровые изображения.Когда это будет сделано, используйте программное обеспечение для обработки изображений для создания одноканальных стеков изображений RGB. Затем сохраните изображения в виде файлов tiff. Затем нанесите 100 микролитров массой 10% по объему додецилсульфата натрия или SDS, растворенного в дистиллированной воде, на стеклянную нижнюю посуду, чтобы расслабить гель-субстрат, высвобождая нейроны из субстрата.Затем высиживают блюдо в верхнем инкубаторе в течение пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия для стабилизации температуры. В лазерном сканирующем конфокальном микроскопе сосредоточьтесь на поверхности геля, чтобы получить изображение бусин в ненатянутой подложке. Создайте одноканальное RGB-изображение бусин в неустановленной подложке и сохраните это изображение в виде файла tiff.Скачайте код анализа тягового усилия TFM2021 и откройте TFM2021 в MATLAB. Открыть главную. m в TFM2021 и запустите его.Когда на экране появляется графический интерфейс пользователя. Нажмите на загрузить необученное, изображение подложки и выберите X-Y положение исправленного изображения бусины в ненапряженной подложке. Перейдите к загрузке флуоресцентных изображений бусин и выберите покадровый стек бусин изображений.Затем нажмите «Загрузить изображения яркого поля», чтобы выбрать покадровое стековое изображение яркого поля, и используйте загрузку изображений GFP для выбора изображения стека EGFP. В раскрывающемся списке графического интерфейса пользователя выберите GFP перед нажатием на ROI, чтобы указать интересующую область прямоугольника, включая конус роста, щелкнув две точки на отображаемом изображении ячейки. После этого нажмите кнопку сохранения в графическом интерфейсе пользователя, чтобы сохранить выбранные изображения стека вместе с ROI в матовом файле.Затем нажмите на spot detect и введите желаемое значение в диалоговом окне, чтобы определить пороговое значение для обнаружения бусин. Нажмите «Хорошо», чтобы начать расчет. После завершения расчета нажмите на дорожку графика, чтобы увеличить область, выбранную ранее, и отобразить обнаруженные бусины в виде белых точек.Используйте выделенные бусины для разграничения полигональной области, которая включает правильные точки под конусом роста. Затем, нажав клавишу ВВОД на клавиатуре, белые точки в полигональной области превратятся в красный. Нажмите на оценку силы в графическом интерфейсе пользователя.Затем введите значения для размера пикселя и модуля Юнга, как описано в рукописи. Поставьте значение коэффициента Пуассона равным 0,3 и выполните оценочную силу, чтобы начать расчет. Программа сохранит результаты расчета в файл формата электронной таблицы.Флуоресцентные изображения конуса роста нейронов показали высокую экспрессию Lifeact, позволяющую визуализировать морфологию конуса роста под полностью открытой и узкой диафрагмой. Уровни экспрессии HaloTag-актина были очень низкими с тусклыми сигналами. Когда диафрагма соответствующим образом сужается, фоновые сигналы уменьшаются, и в конусе роста появляется одиночный акт в крапинках.Исследователи, которые надлежащим образом достигнут всех шагов, будут наблюдать ретроградный поток F-актина в конусе роста. Жесткость полиакриламидного геля определяли путем расчета глубины углубления, вызванного весом микросферы. Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп использовался для захвата изображений поверхности геля и дна микросферы.Сигналы от флуоресцентных шариков не были видны на поверхности геля в области с отступом. Флуоресцентные изображения бусин, встроенных в полиакриламидный гель и нервный конус роста, показали бусины в их происхождении и смещенных положениях. Также наблюдался сигнал EGFP конуса роста.Кимографы отображали движения бусины по сравнению с эталонной бусиной. При выполнении одной спекл-визуализации важно выбрать нейрон, который еженедельно выражает, как действовать под двумя минимальными площадями. При выполнении микроскопии силы тяги важна визуализация с высоким увеличением для точной концентрации силы тяги.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones Video (Video) | JoVE

Маркировка F-актин Колючая Заканчивается родамин-актина в проницаемыми нейронов конусы роста

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric Analyses of Retinal Sections Video (Video) | JoVE

Морфометрические анализы сетчатки Разделы

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses Video (Video) | JoVE

Transretinal записи ЭРГ от мыши Retina: палочек и колбочек Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish Video (Video) | JoVE

Долгосрочный Поведенческая Отслеживание свободно плавающих слабо электрических рыб

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types Video (Video) | JoVE

Проточной цитометрии протоколы для поверхностных и внутриклеточных антиген анализ нейронных типов клеток

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina Video (Video) | JoVE

Са изображений<sup&gt; 2+</sup&gt; Динамика колбочек аксонов мыши Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons Video (Video) | JoVE

Количественное нитевидных актина (F-актин) Puncta на крысиной корковых нейронов

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy Video (Video) | JoVE

Вглядываясь мозга полисом с атомно-силовой микроскопии

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography Video (Video) | JoVE

Карликовые и Омега сложности анализа отдыха государство электроэнцефалография

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid Î² Effects in Cultured Mouse Neurons Video (Video) | JoVE

Визуализация аксональное роста конуса коллапса и раннего амилоида β эффекты в нейронах культивировали мыши

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...