Name: analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video at JoVE.com

Denna forskning stöddes delvis av AMED under bidragsnummer 21gm0810011h0005 (N.I. och Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) och JSPS Grants-in-Aid for Early-Career Scientists (JP19K16258, T.M.), Osaka Medical Research Foundation for Incurable Diseases (T.M.)

Författarna har inget att avslöja.

Protokollen som beskrivs i denna studie använder kommersiellt tillgängliga material och mikroskopiutrustning som rutinmässigt finns i alla laboratorier, institut och universitet. Därför kan prövare enkelt anta den nuvarande single speckle imaging och traction force mikroskopi i sina studier.
Fläckavbildningen kan analysera aktinpolymerisering och kopplingskoppling. Dessutom kan speckle imaging övervaka det bakåtsträvande flödet av kopplingsmolekyler som shootin1 och kortaktin, som interagerar med F-aktin retrograde flöde. Med hjälp av ett TIRF-mikroskop kan även cell vidhäftningsmolekylen L1-CAM:s retrogradeflöde övervakas23,41. L1-CAM genomgår grepp- och glidbeteenden som återspeglar kopplingskopplingseffektiviteten23,41. Även om denna studie använder TMR-HaloTag-systemet för fläckavbildning, finns även andra fluorescerande proteiner, såsom EGFP och monomeriskt rött fluorescerande protein, tillgängliga i analysen16,18,20,23,24,27,39. Det väsentliga för att visualisera aktinfläckar är en låg uttrycksnivå för fluorescerande aktin och belysning av ett minimiområde (figur 2). I detta protokoll förvärvas Lifeact- och HaloTag-aktinsignaler sekventiellt. Eftersom aktin retrograde flödet är relativt långsamt (4,5 ± 0,1 μm/min)24, analys av F-aktin retrograd flöde och aktin polymerisation påverkas inte av sekventiell bild förvärv av olika fluorescerande kanaler (~ 1 s intervall). Lifeact är en allmänt använd F-aktinmarkör, men kan konkurrera med aktinbindande proteiner47. Av ytterligare betydelse kan Lifeact förändra aktindynamiken och därmed påverka F-aktinstrukturer och cellmorfologin47,48,49.
Dragkraftmikroskopi kan upptäcka krafter för att driva tillväxtkonens framryckning. Genom att montera nervcellerna i en extracellulär matris kan utredarna också analysera krafter som genereras i en semi-3D-miljö11. Hög förstoringsavbildning är viktigt för noggrann kvantifiering av dragkraft eftersom tillväxtkoner genererar svaga dragkrafter7. Även om andra metoder med nanopillar eller stresskänsliga biosensorer också används för att mäta dragkraft50,51, är PAA-gelbaserad metod mycket anpassningsbar och möjliggör justering av substratestelhet genom att variera koncentrationerna av akrylamid och bis-akrylamid41,44,52. I detta protokoll framställs PAA-gelen vid en slutlig koncentration av 3,75% akrylamid och 0,03% bis-akrylamid; Youngs modulus är ~270 Pa22 och denna styvhet ligger inom intervallet för hjärnvävnad (100-10 000 Pa)53,54,55. På grund av tjockleken på PAA-gelen (~ 100 μm) begränsar denna metod användningen av högförstoringslinser under mikroskopi. För att få bilder med hög förstoring bör utredarna använda zoomfunktionen i ett konfokalt mikroskop med laserskanning.
Sammanfattningsvis möjliggör den nuvarande speckle imaging och traction force mikroskopi kvantitativa analyser av de viktigaste händelserna i kraft generationer. Denna information kommer att vara ovärderlig för att förbättra förståelsen av de mekanismer som ligger till grund för tillväxtkonens framsteg och navigering.

I den utvecklande ryggradsdjur hjärnan genomgår nervceller noggrant organiserade migreringar och projekt axoner mot lämpliga synaptiska partners för att upprätta funktionella neuronala nätverk1,2,3. Tillväxtkoner, som är sensoriska och motila strukturer som ligger vid spetsen av neuriter, bestämmer hastigheten och riktningen för neuronal migration och axon utväxt3,4,5. Eftersom nervceller är omgivna av tätt packade miljöer måste tillväxtkoner utöva krafter mot sin miljö för att gå vidare6,7. För att förstå mekanismerna bakom neuronal migration och axonal vägledning, analyser av den molekylära mekaniken för tillväxt kon framsteg är viktiga.
Årtionden av analys har visat att dragkraft för att driva tillväxtkonens framryckning genereras av "kopplingsmekanismen". denna mekanism tros fungera inte bara i axonal tillväxt kon utan också i den ledande processen tillväxt kon av migrerande nervceller8,9,10,11,12. Aktinfilament (F-aktiner) i tillväxtkoner polymeriserar vid framkanten och depolymeriserar proximally och trycker ut det ledande membranet13,14,15. Den resulterande kraften, i samband med aktomyosinkontraktion, inducerar bakåtrörelse av F-aktiner som kallas retrograd flöde7,11,16,17,18,19,20,21. Kopplings- och cell vidhäftningsmolekyler förmedlar mekanisk koppling mellan F-aktin retrograde flöde och det självhäftande substratet och överför kraften i F-aktinflödet på substratet, vilket genererar dragkraft för tillväxtkonen advance7,8,9,11,12,22 . Samtidigt minskar kopplingen mellan aktin-substrat F-aktinflödet och omvandlar aktinpolymerisation till kraften för att sticka ut det ledande membranet9,10.
Axonal tillväxtkoner känner av lokala kemiska signaler och omvandlar dem till en riktningskraft för tillväxtkonnavigering3,23,24,25. Till exempel stimulerar en axon-molekyl netrin-1 sin receptor som raderas i kolorektal cancer (DCC), och aktiverar Rho guanosintrifosfat (GTP)-bindande proteiner celldelningskontrollprotein 42 (Cdc42) och Ras-relaterade C3 botulinumtoxin substrat 1 (Rac1), och deras nedströms kinas p21-aktiverade kinas 1 (Pak1)26. Cdc42 och Rac1 främjar 1) aktinpolymerisering, och Pak1 fosforyterar en kopplingsmolekyl shootin122,26. Shootin1 interagerar med F-aktin retrograde flöde via ett aktinbindande protein kortaktin27. Shootin1 interagerar också med L1-cells vidhäftningsmolekyl (L1-CAM)20,24. Shootin1 fosforylering ökar bindningstillhörigheten för kortaktin och L1-CAM, och förbättrar shootin1-medierad kopplingskoppling24,27. Inom tillväxtkonen ökar asymmetriska aktiveringar av aktinpolymerisering och kopplingskoppling 3) dragkraft på sidan av netrin-1-källan, vilket genererar riktningsdrivande kraft för tillväxtkonsvarvning (figur 1)24. Intensiv forskning under de senaste decennierna med avseende på neuronal migration och axon vägledning har ökat förståelsen för vägledningsmolekyler, deras receptorer och tillhörande nedströms signaleringskaskader2,10,28,29,30. Men de molekylära maskinerierna för att generera krafter för tillväxtkonens framryckning har just börjat klargöras; Detta kan hänföras till den begränsade användningen av protokollen för mekanobiologiska analyser.
Denna studie beskriver ett detaljerat protokoll för övervakning av F-aktin retrograd flöde genom en enda speckle imaging16,18. Övervakning av F-actin retrograde flöde har utförts i stor utsträckning med hjälp av superupplösning mikroskopi, spinning-disk confocal mikroskopi och total interferensreflektion fluorescens (TIRF) mikroskopi25,31,32,33,34,35,36,37,38 . Protokollet i den aktuella studien använder dock ett standardeporescensmikroskop och är därmed lätt att anta11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. I kombination med F-aktinmärkning av Lifeact43 möjliggör single speckle imaging kvantifieringar av aktinpolymerisationshastigheten och kopplingskopplingseffektiviteten mellan F-aktin retrograde flöde och det självhäftande substratet39,42. Denna studie beskriver vidare ett detaljerat protokoll för dragkraft mikroskopi med hjälp av en fluorescerande pärla-inbäddad polyakrylamid (PAA) gel11,22,23,24,27,39,41,42,44. Denna metod detekterar och kvantifierar dragkraft under tillväxtkonen genom att övervaka kraftinducerade pärlrörelser44,45. En analyskod för dragkraft med öppen källkod tillhandahålls, och metoden för kvantifiering av dragkraft under tillväxtkonmigrering förklaras i detalj. Med hjälp av single speckle imaging och traction force mikroskopi, förståelse av den molekylära mekaniken bakom tillväxt kon migration och navigering kommer att underlättas. Dessa tekniker är också tillämpliga för att analysera den molekylära mekaniken bakom dendritiska ryggraden utvidgningen, som är känd för att vara viktigt i lärande och minne42.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% trypan blue stain solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00809-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albmine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421787-9970-799</td>
			<td>Objective lens (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (diameter 18 mm)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C018001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16806-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open source software package</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>carboxylate-modified microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (14 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1130H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (27 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882-10X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBO103 W/2</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300382128</td>
			<td>Mercury lamp (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution from mouse EHS tumor</td>
			<td>Wako</td>
			<td>120-05751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16919-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Conforcal laser microscope (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB2018a</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse C57BL/6</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse neuron nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>22402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>AAD-1001</td>
			<td>Electroporation apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td>CMOS camera (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26036-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parallel Computing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>1528177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFN21A-HaloTag-actin</td>
			<td>(Minegishi et al., 2018)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420790-9901-000</td>
			<td>Objective lens (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td>
			<td>(Kastian et al., 2021)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slulfo-SAMPHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08933-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrate (NaOH)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>Sako tekkou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2009</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (single speckle imaging)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance

För att upprätta funktionella nätverk måste neuroner migrera till sina lämpliga destinationer och sedan förlänga axoner mot sina målceller. Dessa processer beror på framstegen hos tillväxtkoner som ligger vid spetsarna av neuriter. Axonal tillväxtkoner genererar drivkrafter genom att känna av sin lokala mikromiljö och modulera cytoskeletal dynamik och aktin-vidhäftningskoppling (kopplingskoppling). Årtionden av forskning har lett till identifiering av styrmolekyler, deras receptorer och nedströms signalkaskader för reglering av neuronal migration och axonal vägledning; Men de molekylära maskiner som krävs för att generera krafter för att driva tillväxtkonens framryckning och navigering börjar bara klargöras. I framkant av neuronala tillväxtkoner genomgår aktinfilament retrograd flöde, som drivs av aktinpolymerisering och aktomyosinkontraktion. En kopplingskoppling mellan F-aktin retrograde flöde och lim substrat genererar dragkrafter för tillväxt kon framryckning. Denna studie beskriver ett detaljerat protokoll för övervakning F-aktin retrograd flöde genom en enda speckle imaging. Viktigt, i kombination med en F-aktinmarkör Lifeact, kan denna teknik kvantifiera 1) F-aktinpolymeriseringshastigheten och 2) kopplingskopplingseffektiviteten mellan F-aktin retrograde flöde och det självhäftande substratet. Båda är kritiska variabler för att generera krafter för tillväxtkonens framryckning och navigering. Dessutom beskriver denna studie ett detaljerat protokoll av dragkraft mikroskopi, som kan kvantifiera 3) dragkraft genereras av tillväxt koner. Genom att koppla analyserna av single speckle imaging och traction force mikroskopi, kan utredare övervaka den molekylära mekaniken bakom tillväxt kon framsteg och navigering.

Enkel fläckavbildning för att kvantifiera aktinpolymeriseringshastighet och kopplingskopplingseffektivitet Ett högt Lifeact-uttryck tillåter F-aktinvisualisering i tillväxtkonen; ett lågt HaloTag-aktin-uttryck gör det möjligt att övervaka F-aktin retrograde flöde (figur 3, kompletterande fil 2). Spårning av aktinfläckarna gör det möjligt att mäta F-aktinflödeshastigheten (figur 3C,D). Eftersom den mekaniska kopplingen av F-actin retrograde flöde och det självhäftande substratet minskar F-aktin flödeshastigheten, kan kopplingskopplingseffektiviteten uppskattas från hastigheten. Dessutom underlättar F-aktinmärkning med Lifeact visualisering av F-aktinförlängning och är användbar för kvantifiering av aktinpolymerisationshastigheten (figur 3E,F).
Kvantitativ analys av dragkraft Strikt efterlevnad av den metod som presenteras här kommer att avslöja rörelserna av fluorescerande pärlor under tillväxtkonen (figur 6C, kompletterande fil 4). F-aktin retrograd flöde på substratet genererar dragkraft orsakar fluorescerande pärlor att flytta bakåt under tillväxtkonen. Dragkraftsanalyskoden uppskattar dragkraft från fluorescerande pärlförskjutning och uttrycker den beräknade dragkraften som en kraftvektor. Dragkraftens riktning och storlek bestäms utifrån kraftvektorns x- och y-komponenter (figur 8C,D). Den röda rutan i figur 8D representerar x- och y-komponenterna i en kraftvektor. Figur 8C visar motsvarande tillväxtkon. När det gäller x-y-koordinater pekar vektorn på -93,8° mot x-axeln. Denna orientering riktas mot baksidan av tillväxtkonen (figur 8C). Dragkraften F:s storlek beräknades på följande sätt:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg">
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg"> Figur 1: En tillväxtkonmaskin för kraftgenerering och tillväxtkonnavigering. En netrin-1 chemoattractant gradient inducera asymmetrisk stimulering av dess receptor DCC på en axonal tillväxt kon. Detta aktiverar Rac1 och Cdc42, och deras nedströms kinas Pak1. Rac1 och Cdc42 främjar (1) aktinpolymerisering, medan Pak1 fosforylater skjuter1, vilket förbättrar shootin1-medierad (2) kopplingskoppling. Den asymmetriska aktiveringen av aktindynamiken och kopplingskopplingen i tillväxtkonen ökar (3) dragkraften på sidan av netrin-1-källan, vilket genererar en riktningskraft för tillväxtkon attraktion. Protokollen som presenteras här möjliggör kvantifiering av nyckelvariablerna (1)-(3) för tillväxtkonnavigering. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg"> Figur 2: Fluorescensbilder av en neuronal tillväxtkon under ett helt öppet och smalt membran. Tillväxtkonen uttrycker Lifeact och HaloTag-aktin. (A) Ett högt Lifeact-uttryck tillåter visualisering av tillväxtkonmorfologi. Å andra sidan är HaloTag-aktin-uttrycksnivåerna mycket låga, med dunkla signaler när membranet är helt öppet. (B) När membranet är lämpligt smalt minskar bakgrundssignalerna och enstaka aktinfläckar uppträder i tillväxtkonen. Skalningsstaplar: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg"> Bild 3: Steg för kvantifiering av F-aktinflödeshastighet och aktinpolymeriseringshastighet med hjälp av en bildbehandlings- och analysprogramvara Fiji. (1) Hitta och välj en aktinfläck (pilspets) som flödar i ett F-aktinpaket. (2) Välj Bild > omforma > rotera. (3) Ställ in vinkeln så att F-aktin-bunten riktas uppåt. (4) Bildens vinkel kommer att ändras. B) Avgränsa regionen, inklusive aktin-fläcken och F-aktinbunten. (1) Klicka på Rektangel i verktygsfältet. (2) Avgränsa en region på bilden. Bildens ljusstyrka och kontrast ökas för att möjliggöra tydlig visualisering av aktinfläcken och spetsen på F-aktin-bunten. (3) Välj Bild > Duplicera. (4) Ange de fem tidsramar som visar aktinfläckflöde i F-aktin-bunten. (5) Den valda stackbilden visas på skärmen. C) Överlägg cirklar på aktin speckle. (1) Klicka på Oval i verktygsfältet. (2) Rita en cirkel på en aktinfläck. (3) Välj Bild > överlägg > Lägg till markering. (4) Cirkeln är överlagrad. 5) Upprepa överläggningen av cirklarna på de återstående aktinfläckarna. D) Mät flyttningsavståndet för aktinfläckar under de fem tidsramarna. (1) Klicka på Rakt i verktygsfältet. (2) Rita en linje som länkar cirklarnas mittpunkter. (3) Välj Analysera > mått. Resultatet, som indikeras av parametern Höjd (röd låda), vidarebefordrar aktin speckle flyttningsavståndet. e) Mät förändringen i längden på F-aktinutskjutningen under de fem tidsramarna. (1) Rita en linje som länkar F-aktins utskjutning. (2) Välj Analysera > mått. Resultatet (röd ruta), Höjd, anger F-aktin-buntens förlängningslängd. F) Aktinpolymeriseringshastigheten beräknas utifrån summan av F-aktinflödeshastigheten och förlängningshastigheten. Se även Kompletterande fil 2. Kompletterande fil 3 hjälper utredare att tillämpa den metod som beskrivs ovan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg"> Figur 4: Steg för PAA-gelberedningen. Se steg 7.1 för en detaljerad beskrivning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg"> Figur 5: Bestämning av PAA-gelstyvhet. A) En mikrosfärindragsmetod. När en mikrosfär placeras på en fluorescerande pärla-inbäddad PAA-gel orsakar mikrosfärens vikt en fördjupning i gelén. Indragsdjupet beräknas genom att subtrahera Z-positionerna på PAA-gelytan från botten av mikrosfären (B,C) Fluorescensbilder av en PAA-gel indragen av en mikrosfär och som innehåller fluorescerande pärlor. Ett laserskanningskonokalmikroskop användes för att fånga bilder av gelytan (B) och botten av mikrosfären (C). Signaler från fluorescerande pärlor är inte synliga på gelytan i den indragna regionen (B, cirkel). De kan dock observeras längst ner i mikrosfären. Skalningsstaplar: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg"> Figur 6: Force mappning av en neuronal tillväxtkon. (A-C) Fluorescens bilder av pärlor inbäddade i en PAA gel och en neural tillväxt kon visualiseras med EGFP. Efter förvärvet av timelapse bilder (A), släpptes neuron från gelsubstratet genom att applicera SDS-lösningen, och en bild av pärlor i det otränade substratet fångades (B). C) Bilden av pärlorna i det otränade substratet visar pärlorna i sina ursprungliga (gröna) och förskjutna (röda) positioner. EGFP-signalen för tillväxtkonen visas i blått. Kymographs (höger) visar rörelserna hos pärlor med 3 s intervaller under en varaktighet av 147 s, vilket indikeras av pilarna i de boxade områdena 1 och 2. Pärlan i område 2 är en referenspärla. Skalstänger: 2 μm för (A), (B) och (C, vänster) och 1 μm för (C, mitten). Se även Kompletterande fil 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg"> Bild 7: Steg för korrigering av x-y-positionen för pärlbilden i otränat substrat med fijiansk (A) Sammanfoga pärlbilden i otränat substrat med tidsfördröjningsstapelbilden av fluorescerande pärlor. (1) Välj Bild - > stackar > verktyg > sammanfoga. (2) Välj pärlor bilden i otränat substrat och timelapse stack bilden av fluorescerande pärlor i Bild1 respektive Bild2. Klicka på OK. (3) Pärlbilden i det otränade substratet läggs till i bilden av tidsfördröjningsstacken. (B) Korrigera x-y-positionen för den fluorescerande pärlans bild. (1) Använd rullningslisten (röd ram) för att markera den andra bildrutan (röd pil) i bildstapeln. (2) Välj plugins > StackReg. (3) Välj Styv kropp i listrutan (röd ram) och klicka på OK. Korrigeringen av x-y-positionen börjar. (C) Spara den x-y positionskorrigerade pärlan. När du har valt den första bildrutan i den x-y positionskorrigerade stackbilden väljer du Bild > Duplicera. (2) Mata in 1 i intervallet och avmarkera Dupliceringsstapeln. Klicka sedan på OK. (3) Den x-y positionskorrigerade pärlbilden i det otränade substratet visas på skärmen. Spara den här bilden som en tiff-fil. Kompletterande fil 6 hjälper utredare att tillämpa den metod som beskrivs ovan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg"> Figur 8: Analys av dragkraft under en neuronal tillväxtkon med hjälp av en analyskod med öppen källkod. (A) GUI för analys av dragkraft. Tidsfördröjningsbilder som valts på det grafiska gränssnittet kan bekräftas från listrutan och med skjutreglaget angiven (röd ruta). (B) Välj en region som innehåller tillväxtkonen. (1) Klicka på ROI på gui. Med muspekaren anger du två punkter (pilspetsar) på cellbilden. (2) En röd ruta visas på cellbilden. Två klick avgör var två hörn finns. (C) Välj de upptäckta pärlorna (vita prickar) under tillväxtkonen. (1) Klicka på Välj pärlor på GUI och avgränsa en polygonal region som innehåller tillväxtkonen genom att klicka. Tryck på Retur . (2) De vita prickarna inom polygonområdet kommer att ändras till en röd färg. (D) Beräknade resultat av dragkraftens riktning och storlek. Den röda rutan i kalkylbladet representerar kraftvektorns x- och y-komponenter, som uppskattas genom dragkraftsanalys. På x-y-koordinaten i den högra panelen pekar kraftvektorn som genereras av tillväxtkonen till -93,8° mot x-axeln. denna orientering riktas mot baksidan av tillväxtkonen i (C). Kompletterande fil 6 hjälper utredare att tillämpa den metod som beskrivs ovan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av den här figuren.</a>
Kompletterande fil 1: Recept av lösningar och media som används i denna studie. Se text för detaljerad användning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%201-63227R1.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 2: Fluorescensavbildning av Lifeact och fluorescerande fläckavbildning av HaloTag-aktin i en nervtillväxtkon. Lifeact (grön) och HaloTag-aktin (magenta). Bilder förvärvades var tredje s för en total varaktighet av 147 s. Skalstång: 2 μm. Se även bild 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%202.mp4" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 3: Öva data för kvantifiering av F-aktinflödeshastighet och aktinpolymeriseringshastigheten. En flerkanalig timelapse-stackbild av Lifeact (grön) och HaloTag-aktin (magenta). Se även figur 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental%20file%203.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 4: En kraftkartläggningsvideo som detekterar dragkraft vid en neuronal tillväxtkon. Pärlornas ursprungliga (gröna) och förskjutna (röda) positioner. EGFP-signalen i tillväxtkonen visas i blått. Bilder förvärvades var tredje s för 147 s. Skalstång: 2 μm. Se även figur 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%204.mp4" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 5: Traction force analys kod. Se steg 8.12 för detaljerad användning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%205.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>
Kompletterande fil 6: Övningsdata för kvantifiering av dragkraft. En enkanalig RGB-bild av pärlor i otränat substrat och enkanalig tidsfördröjningsstack RGB-bilder av fluorescerande pärlor under en tillväxtkon, EGFP och ljusfält. Se även figurerna 7 och 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%206.zip" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video at JoVE.com

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video (Video) | JoVE

För att avancera måste tillväxtkoner utöva dragkrafter mot den yttre miljön. Genereringen av dragkrafter är beroende av aktindynamik och kopplingskoppling. Den aktuella studien beskriver metoder för att analysera aktindynamik, kopplingskoppling och dragkrafter för tillväxtkon framryckning.

Analyser av Actin Dynamics, Kopplingskoppling och dragkraft för tillväxtkonförskott

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

Kopplingsanalys av single speckle imaging och traction force mikroskopiska kan analysera molekylära maskiner för tillväxt kon framsteg och navigering. Eftersom teknikerna använder kommersiellt tillgängliga material och standardmikroskop. Forskare kan bokstavligen anpassa sig till teknikerna i sina studier.Börja med att behandla nervcellerna med tetrametyl-rhodamin eller TMR ligand vid en utspädning av en till 2000 i odlingsmedium på dagen in vitro 3. Behåll sedan nervcellerna vid 37 grader Celsius med 5% koldioxid i en timme. Tvätta TMR ligand tre gånger efter inkubation.Ta bort PBS innan du lägger till 0,5 milliliter uppvärmd Leibovitz L-15-medium i nervcellerna. Håll nervcellerna vid 37 grader Celsius i en timme. Slå sedan på ett epifluorescensmikroskop och ställ in den statliga toppinkubatorn på 37 grader Celsius.Placera sedan TMR ligand-behandlade nervceller i glasbottenskålen på den uppvärmda sceninkubatorn. Ställ in bildförvärvsparametrarna som exponeringstid till 500 millisekunder för fluorescenskanalerna Lifeact och HaloTag-aktin och binning som 0,065 mikron med 0,065 mikron per pixel med ett tidsintervall på tre sekunder för 50 bildrutor. Efter att ha valt en tillväxtkon som starkt uttrycker Lifeact och varje vecka uttrycker HaloTag-actin.Stäng fältet på membranet för att belysa ett minsta område som inkluderar tillväxtkonen och skaffa tidsfördröjningsbilder. På dagen in vitro 3, ersätt odlingsmediet med 0,5 milliliter uppvärmd Leibovitz L-15 medium och behåll nervcellerna i en timme vid 37 grader Celsius. För dragkraftmikroskopi, slå på ett laserskanningskonfokalt mikroskop och ställ in scenens toppinkubator till 37 grader Celsius.Placera nervcellerna på glasbottenskålen på den förvarnade sceninkubatorn. Ställ in parametrarna för bildförvärv enligt beskrivningen i menyskriptet och välj en tillväxtkon som starkt uttrycker förbättrat grönt fluorescensprotein eller EGFP. Fokusera på gelytan och skaffa timelapse-bilder.När du är klar använder du ett bildbehandlingsprogram för att producera RGB-bildstackar med en kanal. Spara sedan bilderna som tiff-filer. Applicera sedan 100 mikroliter med 10% vikt i volym natrium dodecylsulfat eller SDS upplöst i destillerat vatten till glasbottenskålen för att slappna av gelsubstratet genom att släppa nervceller från substratet.Inkubera sedan skålen i scenens toppinkubator i fem minuter vid 37 grader Celsius för att stabilisera temperaturen. I laserskanningskonfokalmikroskopet, fokusera på gelytan för att få en bild av pärlorna i det otränade substratet. Skapa en RGB-bild med en kanal av pärlorna i det otränade substratet och spara den här bilden som en tiff-fil.Ladda ner dragkraftsanalyskoden TFM2021 och öppna TFM2021 i MATLAB. Öppen huvud. m i TFM2021 och köra den.När ett grafiskt användargränssnitt visas på skärmen. Klicka på last otränad, substratbild och välj X-Y-positionen korrigerad pärla i det otränade substratet. Gå för att ladda fluorescerande pärlbilder och välj timelapse stacken av bildpärlor.Klicka sedan på ladda ljusfältsbilder för att välja tidsfördröjningsstackbilden av ljusfält och använd ladda GFP-bilder för att välja timelapse-stackbilden för EGFP. I listrutan i det grafiska användargränssnittet väljer du GFP innan du klickar på ROI för att ange rektangelområdet av intresse, inklusive tillväxtkonen, genom att klicka på två punkter på den visade cellbilden. När du är klar klickar du på spara-knappen på det grafiska användargränssnittet för att spara de valda stackbilderna tillsammans med AVKASTNINGEN i en matfil.Klicka sedan på spot identifiera och mata in ett önskat värde i dialogrutan för att bestämma ett tröskelvärde för pärlidentifiering. Slå okej för att starta beräkningen. När du har avslutat beräkningen klickar du på ritbanan för att förstora det område som valts tidigare och visar de upptäckta pärlorna som vita prickar.Använd utvalda pärlor för att avgränsa en polygonal region som innehåller rätt prickar under tillväxtkonen. Genom att trycka på enter på tangentbordet ändras de vita prickarna inom polygonområdet till rött. Klicka på uppskattningskraften i det grafiska användargränssnittet.Mata sedan in värden för pixelstorleken och Youngs modulus som förklaras i manuskriptet. Sätt värdet för Poissons förhållande till 0,3 och utför uppskattningskraft för att initiera beräkningen. Programvaran sparar beräkningsresultaten i en kalkylbladsformatfil.Fluorescens bilder av en neuronal tillväxt kon visade en hög Lifeact uttryck tillåter visualisering av tillväxt kon morfologi under en helt öppen och smal membran. HaloTag-aktin uttryck nivåer var mycket låg med dim signaler. När membranet är en lämpligt smal, minskar bakgrundssignalerna och en enda handling i fläckar uppträder i tillväxtkonen.Forskare som på lämpligt sätt uppnår alla steg kommer att observera F-actin retrograde flöde i tillväxtkonen. Polyakrylamidgelens styvhet bestämdes genom att beräkna djupet av indragning orsakad på grund av mikrosfärens vikt. Ett laserskanningskonfokalt mikroskop användes för att fånga bilder av gelytan och botten av mikrosfären.Signalerna från fluorescing pärlor var inte synliga på gel ytan i den indragna regionen. Fluorescens bilder av pärlor inbäddade i polyakrylamid gel och neurala tillväxt kon, visade pärlor i deras ursprung och förskjutna positioner. EGFP-signalen från tillväxtkonen observerades också.Kymografierna visade pärlans rörelser jämfört med en referenspärla. När du utför en enda fläckavbildning, viktiga saker att välja en neuron som varje vecka uttrycker hur man agerar under två ett minsta område. Vid utförande av en dragkraftmikroskopi är hög förstoringsavbildning viktigt för noggrann koncentration av dragkraft.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones Video (Video) | JoVE

Märkning F-aktin Barbed Slutar med Rhodamine-aktin i Permeabilized Neuronal Tillväxt Kottar

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric Analyses of Retinal Sections Video (Video) | JoVE

Morfometriska Analyser av näthinnans avsnitt

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses Video (Video) | JoVE

Transretinal ERG Inspelningar från mus Retina: Stång och Photoresponses Cone

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish Video (Video) | JoVE

Långsiktig Behavioral Spårning av fritt Simning Svagt Electric Fish

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types Video (Video) | JoVE

Flödescytometri protokoll för Surface och intracellulära Antigen Analyser av neurala celltyper

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina Video (Video) | JoVE

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dynamik i Cone ljusmätare Axon terminaler i Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons Video (Video) | JoVE

Kvantifiering av fintrådiga aktin (F-aktin) puncta i Rat kortikala Neuroner

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy Video (Video) | JoVE

Peering på Brain polysomer med atomkraftsmikroskopi

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography Video (Video) | JoVE

Mikrotillstånd och Omega komplexitet analyser av den vilande-state elektroencefalografi

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid Î² Effects in Cultured Mouse Neurons Video (Video) | JoVE

Visualisera Axonal tillväxt Cone kollaps och tidiga Amyloid β effekter i odlade mus nervceller

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...