Name: analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance
Uploaded: 2021-10-21T15:00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video at JoVE.com

Bu araştırma kısmen AMED tarafından 21gm0810011h0005 (N.I. ve Y.S.), JSPS KAKENHI (JP19H03223, N.I.) ve JSPS Erken Kariyer Bilimcileri için Yardım Hibeleri (JP19K16258, T.M.), Osaka Tedavi Edilemez Hastalıklar Tıbbi Araştırma Vakfı (T.M.) ve NAIST Yeni Nesil Disiplinlerarası Araştırma Projesi (Y.S.).

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bu çalışmada açıklanan protokollerde, tüm laboratuvarlarda, enstitülerde ve üniversitelerde rutin olarak bulunan ticari olarak mevcut malzemeler ve mikroskopi ekipmanları sunulmuştur. Bu nedenle, araştırmacılar çalışmalarında mevcut tek benek görüntüleme ve çekiş kuvveti mikroskopisini kolayca benimseyebilirler.
Benek görüntüleme, aksin polimerizasyonunu ve debriyaj kavramasını analiz edebilir. Ek olarak, benek görüntüleme, F-actin retrograd akışı ile etkileşime giren shootin1 ve kortektin gibi debriyaj moleküllerinin retrograd akışını izleyebilir. Bir TIRF mikroskobu kullanılarak, hücre yapışma molekülü L1-CAM'ın retrograd akışı da izlenebilir23,41; L1-CAM, debriyaj kavrama verimliliğini yansıtan kavrama ve kayma davranışlarından geçer23,41. Bu çalışmada benek görüntüleme için TMR-HaloTag sistemi kullanılsa da, EGFP ve monomerik kırmızı floresan protein gibi diğer floresan proteinler de analizde mevcuttur16,18,20,23,24,27,39. Aksin beneklerini görselleştirmek için gerekli olan, floresan akinin düşük ifade seviyesi ve minimum alanın aydınlatılmasıdır (Şekil 2). Bu protokolde, Lifeact ve HaloTag-actin sinyalleri ardışık olarak elde edilir. Aksin retrograd akışı nispeten yavaş olduğundan (4,5 ± 0,1 μm/dk)24, F-actin retrograd akışı ve aksin polimerizasyonunun analizi farklı floresan kanalların (~1 s aralık) sıralı görüntü alımından etkilenmez. Lifeact yaygın olarak kullanılan bir F-actin belirtecidir, ancak akin bağlayıcı proteinlerle rekabet edebilir47. Daha da önemli olan Lifeact, aktüen dinamiklerini değiştirebilir, böylece F-aktüin yapılarını ve hücre morfolojisini 47,48,49 yönden etkileyebilir.
Çekiş kuvveti mikroskopisi, büyüme konisi ilerlemesini sağlamak için kuvvetleri tespit edebilir. Araştırmacılar, nöronları hücre dışı bir matrise monte ederek, yarı 3D bir ortamda üretilen kuvvetleri de analiz edebilir11. Yüksek büyütme görüntüleme, çekiş kuvvetinin doğru ölçülmesi için önemlidir, çünkü büyüme konileri zayıf çekiş kuvvetleri oluşturur7. Her ne kadar nanopillar veya strese duyarlı biyosensörler içeren diğer yöntemler de çekiş kuvvetini ölçmek için kullanılsa da, PAA jel bazlı yöntem son derece uyarlanabilir ve akrilamid ve bis-akrilamid konsantrasyonlarını değiştirerek substrat sertliğinin ayarlanmasına izin verir41,44,52. Bu protokolde, PAA jeli% 3.75 akrilamid ve% 0.03 bis-akrilamid nihai konsantrasyonda hazırlanır; Young'ın modülü ~270 Pa22'dir ve bu sertlik beyin dokusu aralığındadır (100-10.000 Pa)53.54,55. PAA jelinin kalınlığı (~100 μm) nedeniyle, bu yöntem mikroskopi sırasında yüksek büyütme lenslerinin kullanımını sınırlar. Yüksek büyütme görüntüleri elde etmek için, araştırmacılar lazer tarama konfokal mikroskopta yakınlaştırma işlevini kullanmalıdır.
Sonuç olarak, mevcut benek görüntüleme ve çekiş kuvveti mikroskopisi, kuvvet nesillerindeki önemli olayların nicel analizlerini sağlar. Bu bilgiler, büyüme konisinin ilerlemesinin ve navigasyonun altında yatan mekanizmaların anlaşılmasını geliştirmek için paha biçilmez olacaktır.

Gelişmekte olan omurgalı beyinde, nöronlar işlevsel nöronal ağlar kurmak için uygun sinaptik ortaklara doğru ayrıntılı olarak organize edilmiş göçlerden geçer ve aksonlar yansıtır1,2,3. Nötrallerin ucunda bulunan duyusal ve hareketli yapılar olan büyüme konileri, nöronal göç ve akson büyümesinin hızını ve yönünü belirler3,4,5. Nöronlar sıkıca paketlenmiş ortamlarla çevrili olduğundan, büyüme konileri ilerlemek için çevrelerine karşı güç uygulamalıdır6,7. Nöronal göçün ve aksonal rehberliğin altında kalan mekanizmaları anlamak için, büyüme konisi ilerlemesi için moleküler mekaniğin analizleri esastır.
Onlarca yıllık analiz, büyüme koni ilerlemesini sağlamak için çekiş kuvvetinin 'debriyaj' mekanizması tarafından üretildiğini ortaya koydu; bu mekanizmanın sadece aksonal büyüme konisinde değil, aynı zamanda göç eden nöronların önde gelen proses büyüme konisinde de işlev göremediği düşünülmektedir8,9,10,11,12. Yani, büyüme konilerindeki aktin filamentler (F-actinler) öndeki kenarda polimerize olur ve proksimal olarak depolimerize olur ve öncü membranı dışarı iterek13,14,15. Elde eden kuvvet, aktomiyosin kasılması ile birlikte, retrograd akış olarak adlandırılan F-aktisinlerin geriye doğru hareketini teşvik eder7,11,16,17,18,19,20,21. Debriyaj ve hücre yapışma molekülleri, F-actin retrograd akışı ile yapışkan substrat arasındaki mekanik bağlantıya aracılık eder ve F-aktiin akışının kuvvetini substrata iletir, böylece büyüme konisi ilerlemesi için çekiş kuvveti üretir7,8,9,11,12,22 . Eşzamanlı olarak, aksin-substrat kavraması F-aktüer akış hızını azaltır ve aksin polimerizasyonunu önde gelen membran9,10'a çıkıntı yapmak için kuvvete dönüştürür.
Aksonal büyüme konileri yerel kimyasal ipuçlarını algılar ve bunları büyüme konisi navigasyonu için yönlü bir itici güce çevirir3,23,24,25. Örneğin, bir akson kılavuz molekülü netrin-1 kolorektal kanserde (DCC) silinen reseptörü uyarır ve Rho guanosine trifosfat (GTP)- bağlayıcı proteinler hücre bölünmesi kontrol proteini 42 (Cdc42) ve Ras ile ilgili C3 botulinum toksin substratı 1 'i (Rac1) ve bunların aşağı akış kinaz p21-aktive kinaz 1'ini (Pak1) aktive eder. Cdc42 ve Rac1 1) aksin polimerizasyonunu teşvik eder ve Pak1 bir debriyaj molekülü çekimini 122,26 fosforilasyon eder. Shootin1, aktiin bağlayıcı protein kortektin27 aracılığıyla F-actin retrograd akışı ile etkileşime girer. Shootin1 ayrıca L1 hücre yapışma molekülü (L1-CAM)20,24 ile etkileşime girer. Shootin1 fosforilasyon, kortaktin ve L1-CAM için bağlayıcı yakınlıkları arttırır ve shootin1 aracılı 2) debriyaj kavramasını geliştirir24,27. Büyüme konisi içinde, akrin polimerizasyonunun asimetrik aktivasyonları ve debriyaj kavraması, netrin-1 kaynağının yan tarafındaki 3) çekiş kuvvetini arttırır, böylece büyüme konisi tornalaması için yönlü itici güç üretir (Şekil 1)24. Nöronal göç ve akson rehberliği ile ilgili son birkaç on yıldaki yoğun araştırmalar, kılavuz moleküllerin, reseptörlerinin ve ilişkili aşağı akış sinyal basamaklarının anlaşılmasını artırmıştır2,10,28,29,30. Bununla birlikte, büyüme konisi ilerlemesi için kuvvetler üretecek moleküler makineler yeni yeni aydınlatılmaya başlıyor; bu, mekanobiyolojik analizler için protokollerin sınırlı kullanımına bağlanabilir.
Bu çalışma, F-actin retrograd akışını tek benek görüntüleme ile izlemek için ayrıntılı bir protokolü açıklar16,18. F-aktipin retrograd akışının izlenmesi, süper çözünürlüklü mikroskopi, iplik disk konfokal mikroskopi ve toplam girişim yansıma floresan (TIRF) mikroskopisi25,31,32,33,34,35,36,37,38 kullanılarak kapsamlı bir şekilde gerçeklendirilmiştir. . Bununla birlikte, bu çalışmadaki protokol standart bir epifluoresans mikroskobu kullanır ve bu nedenle kolayca benimsenebilir11,16,18,20,22,23,24,27,39,40,41,42. Lifeact43 tarafından F-actin etiketleme ile birleştirildiğinde, tek benekli görüntüleme, aktüer polimerizasyon oranının ve F-actin retrograd akışı ile yapışkan substrat39,42 arasındaki debriyaj kavrama verimliliğinin nicelleştirilmesine izin verir. Bu çalışma ayrıca floresan boncuk gömülü poliakrilamid (PAA) jel11,22,23,24,27,39,41,42,44 kullanarak traction kuvveti mikroskopisinin ayrıntılı bir protokolünü açıklamaktadır. Bu yöntem, kuvvet kaynaklı boncuk hareketlerini izleyerek büyüme konisi altındaki çekiş kuvvetini algılar ve ölçer44,45. Açık kaynaklı bir çekiş kuvveti analiz kodu sağlanır ve büyüme konisi göçü sırasında çekiş kuvvetini ölçme yöntemi ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Tek benek görüntüleme ve çekiş kuvveti mikroskopisi yardımıyla, büyüme konisi göçü ve navigasyonunun altında kalan moleküler mekaniği anlamak kolaylaştırılacaktır. Bu teknikler, öğrenme ve hafızada önemli olduğu bilinen dendritik omurga genişlemesinin altında kalan moleküler mekaniği analiz etmek için de geçerlidir42.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5% trypan blue stain solution</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>29853-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-aminopropyltrimethyoxysilane</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>281778-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide monomer</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>00809-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium persulphate</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17-1311-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio Observer Z1</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>431007-9902-000</td>
			<td>Epi-fluorescence microscope (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement (50x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albmine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Apochromat 63x/1.2 W Corr</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>421787-9970-799</td>
			<td>Objective lens (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip (diameter 18 mm)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>C018001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16806-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNaseI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>Open source software package</td>
			<td>https://imagej.net/software/fiji/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoSpheres carboxylate-modified 0.2 mm, red (580/605), 2% solid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>F8810</td>
			<td>carboxylate-modified microspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (14 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1130H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dish (27 mm diameter)</td>
			<td>Matsunami</td>
			<td>D1140H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882-10X10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HaloTag TMR ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBO103 W/2</td>
			<td>Osram</td>
			<td>4050300382128</td>
			<td>Mercury lamp (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/image.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin solution from mouse EHS tumor</td>
			<td>Wako</td>
			<td>120-05751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz&#8217;s L-15 medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11415064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>16919-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM710</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Conforcal laser microscope (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLAB2018a</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/new_products/release2018a.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse C57BL/6</td>
			<td>Japan SLC</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse neuron nucleofector kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPG-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8217;,N&#8217;-tetramethylethylenediamine (TEMED)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>33401-72</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N&#8217;-methylenebisacrylamide</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>22402-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector I</td>
			<td>Amaxa</td>
			<td>AAD-1001</td>
			<td>Electroporation apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA Flash 4.0 V2</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C11440-22CU</td>
			<td>CMOS camera (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26036-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parallel Computing Toolbox</td>
			<td>MathWork</td>
			<td>https://www.mathworks.com/products/parallel-computing.html</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>1528177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin (100x)</td>
			<td>Nacalai Tesque</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFN21A-HaloTag-actin</td>
			<td>(Minegishi et al., 2018)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 (10x)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plan-Apochromat 100x/1.4 Oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>420790-9901-000</td>
			<td>Objective lens (single speckle imaging)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pmNeonGreen-N1-Lifeact</td>
			<td>(Kastian et al., 2021)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6407-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slulfo-SAMPHA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>22589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08933-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrate (NaOH)</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel ball</td>
			<td>Sako tekkou</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microshpere to determin PAA gel rigidity. 0.6 mm diameter, 7.87 g/cm3.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2009</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (traction force microscopy)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN2012</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html#introduction</td>
			<td>Image acquisition software (single speckle imaging)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analyses of actin dynamics, clutch coupling and traction force for growth cone advance

İşlevsel ağlar kurmak için nöronların uygun hedeflerine geçmeleri ve ardından aksonları hedef hücrelerine doğru genişletmeleri gerekir. Bu süreçler, nötroritlerin uçlarında bulunan büyüme konilerinin ilerlemelerine bağlıdır. Aksonal büyüme konileri, yerel mikroçevrimlerini algılayarak ve sitoskeletal dinamikleri ve aktin-yapışma kavramasını (kavrama kavraması) modüle ederek itici güçler üretir. Onlarca yıllık araştırmalar, nöronal göçü ve aksonal rehberliği düzenlemek için kılavuz moleküllerinin, reseptörlerinin ve aşağı akış sinyal basamaklarının tanımlanmasına yol açmıştır; bununla birlikte, büyüme konisi ilerlemesini ve navigasyonu yönlendirmek için kuvvetler üretmek için gereken moleküler makineler yeni yeni aydınlatılmaya başlıyor. Nöronal büyüme konilerinin öncü kenarında, aksin filamentleri, aksin polimerizasyonu ve akromiyosin kasılması ile desteklenen retrograd akışa tabir edilir. F-actin retrograd akışı ile yapışkan substrat arasındaki debriyaj bağlantısı, büyüme konisi ilerlemesi için çekiş kuvvetleri oluşturur. Bu çalışmada F-actin retrograd akışının tek benekli görüntüleme ile izlenmesi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Daha da önemlisi, bir F-actin işaretleyici Lifeact ile birleştirildiğinde, bu teknik 1) F-actin polimerizasyon oranını ve 2) F-actin retrograd akışı ile yapışkan substrat arasındaki debriyaj kavrama verimliliğini ölçebilir. Her ikisi de büyüme konisi ilerlemesi ve navigasyon için kuvvetler üretmek için kritik değişkenlerdir. Ek olarak, bu çalışma, büyüme konileri tarafından üretilen 3) çekiş kuvvetini ölçebilen ayrıntılı bir çekiş kuvveti mikroskopisi protokolünü açıklar. Böylece, araştırmacılar tek benek görüntüleme ve çekiş kuvveti mikroskopisinin analizlerini bir araya getirebilirler, büyüme konisi ilerlemesini ve navigasyonunu temel alan moleküler mekaniği izleyebilirler.

Aksin polimerizasyon oranını ve debriyaj kavrama verimliliğini ölçmek için tek benekli görüntüleme Yüksek bir Lifeact ifadesi, büyüme konisi içinde F-actin görselleştirmeye izin veriyor; düşük halotag-actin ifadesi F-actin retrograd akışının izlenmesini sağlar (Şekil 3, Ek Dosya 2). Aktiin beneklerinin izlenmesi F-aktüen akış hızının ölçülmesine izin verir (Şekil 3C, D). F-actin retrograd akışının mekanik bağlantısı ve yapışkan substrat F-actin akış hızını azalttığından, debriyaj kavrama verimliliği hızdan tahmin edilebilir. Ayrıca, Lifeact ile F-actin etiketlemesi F-actin uzantısının görselleştirilmesine yardımcı olur ve akrin polimerizasyon oranını ölçmek için yararlıdır (Şekil 3E, F).
Çekiş kuvvetinin nicel analizi Burada sunulan metodolojiye sıkı sıkıya bağlı kalmak, floresan boncukların büyüme konisi altındaki hareketlerini ortaya çıkaracaktır (Şekil 6C, Ek Dosya 4). Alt tabakaya F-actin retrograd akışı, floresan boncukların büyüme konisinin altında arkaya doğru hareket etmesine neden olan çekiş kuvveti oluşturur. Çekiş kuvveti analiz kodu, floresan boncuk yerinden deplasmanından gelen çekiş kuvvetini tahmin eder ve hesaplanan çekiş kuvvetini bir kuvvet vektörü olarak ifade eder. Çekiş kuvvetinin yönü ve büyüklüğü kuvvet vektörün x ve y bileşenlerinden belirlenir (Şekil 8C,D). Şekil 8D'deki kırmızı kutu, bir kuvvet vektörün x ve y bileşenlerini temsil eder; Şekil 8C karşılık gelen büyüme konisini tasvir eder. x-y koordinatları açısından, vektör x eksenine karşı -93.8 ° işaret eder; bu yönelim büyüme konisinin arkasına yönlendirilir (Şekil 8C). Çekiş kuvveti F'nin büyüklüğü aşağıdaki gibi hesaplanmıştır:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63227/63227eq02.jpg">
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig01.jpg"> Şekil 1: Kuvvet üretimi ve büyüme konisi navigasyonu için bir büyüme koni makinesi. Netrin-1 kemoattraktant gradyanı, reseptör DCC'sinde aksonal büyüme konisi üzerinde asimetrik stimülasyona neden olur. Bu, Rac1 ve Cdc42'yi ve aşağı akış kinaz Pak1'i etkinleştirir. Rac1 ve Cdc42 (1) aksin polimerizasyonunu teşvik ederken, Pak1 fosforilasyonlar shootin1'i güçlendirerek shootin1 aracılı (2) debriyaj kavramasını geliştirir. Akrin dinamiklerinin asimetrik aktivasyonu ve büyüme konisi içindeki debriyaj bağlantısı, netrin-1 kaynağının yan tarafındaki (3) çekiş kuvvetini arttırır ve böylece büyüme konisi cazibesi için yönlü bir itici güç oluşturur. Burada sunulan protokoller, büyüme konisi navigasyonu için anahtar değişkenlerin (1)-(3) ölçülmesine izin verir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig02.jpg"> Şekil 2: Tamamen açılmış ve daraltılmış bir diyafram altında nöronal büyüme konisinin floresan görüntüleri. Büyüme konisi Lifeact ve HaloTag-actin'i ifade eder. (A) Yüksek bir Lifeact ifadesi büyüme konisi morfolojisinin görselleştirilmesine izin eder. Öte yandan, HaloTag-actin ifade seviyeleri çok düşüktür ve diyafram tamamen açıldığında loş sinyaller verilir. (B) Diyafram uygun şekilde daraltıldığında, arka plan sinyalleri azalır ve büyüme konisinde tek akrin benekleri görülür. Ölçek çubukları: 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2.jpg"> Şekil 3: Bir görüntü işleme ve analiz yazılımı kullanarak F-actin akış hızını ve aksin polimerizasyon hızını ölçme adımları Fiji. (A) Analiz için görüntünün açısını ayarlayın. (1) F-actin demetinde akan bir aktüen benek (ok ucu) bulun ve seçin. (2) Dönüştür > Döndür > Görüntü'yü seçin. (3) Açıyı F-actin demetinin yukarı yönlendirilmesi için ayarlayın. (4) Görüntünün açısı değiştirilecektir. (B) Akin benek ve F-actin demeti de dahil olmak üzere bölgeyi çizin. (1) Araç çubuğundaki Dikdörtgen'e tıklayın. (2) Görüntüdeki bir bölgeyi tanımlama. Görüntünün parlaklığı ve kontrastı, aksin lekesinin ve F-actin demetinin ucunun net bir şekilde görselleştirilmesine izin vermek için artırılmıştır. (3) Resim > Çoğalt'ı seçin. (4) F-actin demetinde aktüen benek akışını gösteren beş zaman dilimini girin. (5) Seçilen yığın görüntüsü ekranda görünecektir. (C) Aktüen benek üzerindeki daireleri kaplar. (1) Araç çubuğunda Oval'e tıklayın. (2) Aktüer benek üzerine daire çizin. (3) Resim > Yer Paylaşımı'> Seçim Ekle'yi seçin. (4) Daire kaplanmıştır. 5) Kalan aktüen beneklerindeki dairelerin üzerine bindirmeyi tekrarlayın. (D) Beş zaman dilimi boyunca aktiin beneklerinin translokasyon mesafesini ölçün. (1) Araç çubuğunda Düz'e tıklayın. (2) Dairelerin merkezlerini birbirine bağlayan bir çizgi çizin. (3) Ölçü > Analiz Et'i seçin. Actin benek translokasyon mesafesini aktaran Yükseklik (kırmızı kutu) parametresi ile gösterilen sonuç. (E) Beş zaman dilimi boyunca F-aktüen çıkıntısının uzunluğundaki değişimi ölçün. (1) F-actin çıkıntısının uçlarını birbirine bağlayan bir çizgi çizin. (2) Ölçü > Analiz Et'i seçin. Sonuç (kırmızı kutu), Yükseklik, F-actin demetinin uzatma uzunluğunu gösterir. (F) Aktisin polimerizasyon oranı, F-aktüer akış hızı ve uzatma oranının toplamından hesaplanır. Ayrıca bkz. Ek Dosya 3, araştırmacıların yukarıda açıklanan metodolojiyi uygulamalarına yardımcı oluyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig04.jpg"> Şekil 4: PAA jel hazırlama adımları. Ayrıntılı bir açıklama için lütfen 7.1 adımına bakın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig05.jpg"> Şekil 5: PAA jel sertliğinin belirlenmesi. (A) Mikroküreden girinti yöntemi. Floresan boncuk gömülü PAA jel üzerine bir mikroküreç yerleştirildiğinde, mikro kürenin ağırlığı jelde girintiye neden olur. Girinti derinliği, PAA jel yüzeyinin z-konumlarının mikrokürenin altından çıkarılarak hesaplanır (B,C) Bir paa jelinin mikroküreç tarafından girintilenmiş ve floresan boncuklar içeren floresan görüntüleri. Jel yüzeyinin (B) ve mikrosferin (C) tabanının görüntülerini yakalamak için lazer taramalı konfokal mikroskop kullanıldı. Floresan boncuklardan gelen sinyaller girintili bölgedeki jel yüzeyinde görünmez (B, daire). Bununla birlikte, mikro kürenin dibinde gözlemlenebilirler. Ölçek çubukları: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig06.jpg"> Şekil 6: Nöronal büyüme konisinin zorla haritalandırılması. (A-C) EGFP ile görselleştirilmiş bir PAA jeline ve nöral büyüme konilerine gömülü boncukların floresan görüntüleri. Zaman atlamalı görüntülerin (A) elde edilmesi sonrasında, nöron SDS çözeltisi uygulanarak jel substratından serbest bırakıldı ve kısıtlanmamış substrattaki boncukların bir görüntüsü yakalandı (B). (C) Mezupların sınırlandırılmamış alt tabakadaki görüntüsü, boncukları orijinal (yeşil) ve yer değiştirmiş (kırmızı) konumlarında gösterir. Büyüme konisinin EGFP sinyali mavi renkte gösterilir. Kimograflar (sağda), 1 ve 2' nci kutulu alanlardaki oklarla gösterilen 147 s süre boyunca boncukların hareketlerini 3 s aralıklarla gösterir. Alan 2'deki boncuk bir referans boncuk. Ölçek çubukları: (A), (B) ve (C, sol) için 2 μm ve (C, orta) için 1 μm. Ayrıca bkz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig07.jpg"> Şekil 7: Boncuk görüntüsünün Fiji kullanarak sınırlandırılmamış substrattaki x-y konumunu düzeltme adımları. (A) Boncuk görüntüsünü, floresan boncukların zaman atlamalı yığın görüntüsüyle sınırlandırılmamış substratta bir araya getirin. (1) Birleştirme > Resim > Yığınları > Araçları'nı seçin. (2) Sırasıyla, kısıtlanmamış substrattaki boncuk görüntüsünü ve Image1 ve Image2'deki floresan boncukların zaman atlamalı yığın görüntüsünü seçin. Tamam'a tıklayın. (3) Sınırlandırılmamış alt tabakadaki boncuk görüntüsü, zaman atlamalı yığın görüntüsüne eklenir. (B) Floresan boncuk görüntüsünün x-y konumunu düzeltin. (1) Görüntü yığınındaki ikinci kareyi (kırmızı ok) seçmek için kaydırma çubuğunu (kırmızı çerçeve) kullanın. (2) StackReg > Eklentileri seçin. (3) Açılan listeden (kırmızı çerçeve) Sert Gövde'yi seçin ve Tamam'a tıklayın. X-y pozisyonunun düzeltilmesine başlanacak. (C) X-y konum düzeltilmiş boncuk görüntüsünü kaydedin. x-y konum düzeltilmiş yığın görüntüsünün ilk karesini seçtikten sonra(1) Görüntü > Çoğalt'ı seçin. (2) Aralığa 1 girin ve Yinelenen yığının seçimini kaldırın. Ardından Tamam'a tıklayın. (3) sınırlandırılmamış alt tabakadaki x-y konum düzeltilmiş boncuk görüntüsü ekranda görünecektir. Bu görüntüyü tiff dosyası olarak kaydedin. Ek Dosya 6, araştırmacıların yukarıda açıklanan metodolojiyi uygulamalarına yardımcı oluyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63227/63227fig08.jpg"> Şekil 8: Açık kaynaklı bir çekiş kuvveti analiz kodu kullanılarak nöronal büyüme konisi altında çekiş kuvvetinin analizi. (A) Çekiş kuvvetini analiz etmek için GUI. GUI'de seçilen hızlandırılmış görüntüler açılan listeden ve kaydırıcı belirtilerek (kırmızı kutu) onaylanabilir. (B) Büyüme konisini içeren bir bölge seçin. (1) GUI'deki yatırım getirisi üzerine tıklayın. Fare imleciyle, hücre görüntüsünde iki nokta (ok uçları) belirtin. (2) Hücre görüntüsünde kırmızı bir kutu görünecektir. İki köşenin konumlarını iki tıklama belirler. (C) Büyüme konisinin altında algılanan boncukları (beyaz noktalar) seçin. (1) GUI'de Boncuk seç'e tıklayın ve tıklayarak büyüme konisini içeren çokgen bir bölgeyi sınırlayın. Enter tuşuna basın. (2) Çokgen bölgedeki beyaz noktalar kırmızı bir renge dönüşecektir. (D) Çekiş kuvvetinin yönünün ve büyüklüğünün hesaplanan sonuçları. Elektronik tablodaki kırmızı kutu, çekiş kuvveti analizi ile tahmin edilen kuvvet vektörün x ve y bileşenlerini temsil eder. Sağ paneldeki x-y koordinatında, büyüme konisi tarafından oluşturulan kuvvet vektörü x eksenine karşı -93,8 ° 'yi gösterir; bu yönelim (C) büyüme konisinin arkasına yönlendirilir. Ek Dosya 6 , araştırmacıların yukarıda açıklanan metodolojiyi uygulamalarına yardımcı oluyor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/63227fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Bu çalışmada kullanılan çözüm ve ortam tarifleri. Ayrıntılı kullanım için metne bakın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%201-63227R1.xlsx" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 2: Sinir büyüme konisinde Lifeact floresan görüntüleme ve HaloTag-actin floresan benek görüntüleme. Lifeact (yeşil) ve HaloTag-actin (macenta). Görüntüler her 3 sn toplam 147 s süreyle elde edildi. Ölçek çubuğu: 2 μm. Ayrıca bkz. Şekil 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%202.mp4" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 3: F-actin akış hızını ve aktin polimerizasyon oranını ölçmek için verileri uygulayın. Lifeact (yeşil) ve HaloTag-actin (macenta) çok kanallı zaman atlamalı yığın görüntüsü. Ayrıca bkz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/Supplemental%20file%203.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 4: Nöronal büyüme konisinde çekiş kuvveti algılayan bir kuvvet haritalama videosu. Boncukların orijinal (yeşil) ve yer değiştirmiş (kırmızı) konumları. Büyüme konislerindeki EGFP sinyali mavi renkte gösterilir. Görüntüler 147 s için her 3 sn'de bir alındı. Ölçek çubuğu: 2 μm. Ayrıca bkz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20File%204.mp4" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 5: Çekiş kuvveti analiz kodu. Ayrıntılı kullanım için lütfen Adım 8.12'ye bakın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%205.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Ek Dosya 6: Çekiş kuvveti ölçmek için pratik verileri. Sınırsız substrattaki boncukların tek kanallı RGB görüntüsü ve büyüme konisi, EGFP ve parlak alan altındaki floresan boncukların tek kanallı zaman atlamalı yığın RGB görüntüleri. Ayrıca bkz . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63227/JoVE%20Review%20-%20Supplemental%20file%206.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video at JoVE.com

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance Video (Video) | JoVE

İlerlemek için, büyüme konileri dış ortama karşı çekiş kuvvetleri uygulamalıdır. Çekiş kuvvetlerinin üretimi akin dinamiklerine ve debriyaj kavramasına bağlıdır. Bu çalışmada büyüme konisi ilerlemesi için akin dinamiklerini, debriyaj kavramasını ve çekiş kuvvetlerini analiz etme yöntemleri açıklanmaktadır.

Büyüme Konisi İlerlemesi için Actin Dynamics, Debriyaj Kavrama ve Çekiş Kuvveti Analizleri

To establish functional networks, neurons must migrate to their appropriate destinations and then extend axons toward their target cells. These processes ...

Tek benek görüntüleme ve çekiş kuvveti mikroskobik kaplin analizi, büyüme konisi ilerlemesi ve navigasyonu için moleküler makineleri analiz edebilir. Teknikler ticari olarak mevcut malzemeleri ve standart mikroskopları kullandığından. Araştırmacılar çalışmalarındaki tekniklere kelimenin tam anlamıyla uyum sağlayabilirler.Nöronları tetrametril-rhodamin veya TMR ligand ile tedavi ederek başlayın ve in vitro 3'ün olduğu gün kültür ortamında 1 ila 2000 arasında bir seyreltmede. Daha sonra nöronları bir saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede koruyun. Kuluçkadan sonra, TMR ligandını önceden ısıtılmış PBS ile üç kez yıkayın.Nöronlara 0,5 mililitre ısıtılmış Leibovitz'in L-15 ortamını eklemeden önce PBS'yi çıkarın. Nöronları bir saat boyunca 37 santigrat derecede koruyun. Ardından, bir epifluoresans mikroskobu açın ve durum üst inkübatörü 37 santigrat dereceye ayarlayın.Daha sonra TMR ligand tedavi nöronlarını ısıtılmış sahne üst inkübatörüne cam alt tabağa yerleştirin. Lifeact ve HaloTag-actin floresan kanalları için pozlama süresi gibi görüntü alma parametrelerini 50 kare olarak ayarlayın ve 50 kare için üç saniyelik zaman aralığında piksel başına 0,065 mikron ile 0,065 mikron olarak binning. Lifeact'i güçlü bir şekilde ifade eden bir büyüme konisi seçtikten sonra ve haftalık HaloTag-actin'i ifade eder.Büyüme konisini içeren minimum alanı aydınlatmak ve zaman atlamalı görüntüler elde etmek için diyaframdaki alanı kapatın. In vitro 3 gününde, kültür ortamını 0,5 mililitre ısıtılmış Leibovitz'in L-15 ortamıyla değiştirin ve nöronları 37 santigrat derecede bir saat koruyun. Çekiş kuvveti mikroskopisi için lazer tarama konfokal mikroskobu açın ve sahne üst inkübatörü 37 santigrat dereceye ayarlayın.Nöronları önceden uyarılmış sahne üst inkübatöründeki cam alt kabın üzerine yerleştirin. Menü komut dosyasında açıklandığı gibi görüntü alma parametrelerini ayarlayın ve gelişmiş yeşil floresan proteinini veya EGFP'yi güçlü bir şekilde ifade eden bir büyüme konisi seçin. Jel yüzeye odaklanın ve hızlandırılmış görüntüler elde edin.Bittiğinde, tek kanallı zaman atlamalı RGB görüntü yığınları üretmek için bir görüntü işleme yazılımı kullanın. Ardından görüntüleri tiff dosyaları olarak kaydedin. Daha sonra, nöronları substrattan serbest bırakarak jel substratını gevşetmek için cam alt kabına, damıtılmış suda çözünmüş hacim sodyum dodecyl sülfat veya SDS ile% 10 ağırlıkta 100 mikrolitre uygulayın.Daha sonra sıcaklığı stabilize etmek için kabı sahne üst inkübatöründe 37 santigrat derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Lazer tarama konfokal mikroskopunda, kısıtlanmamış substrattaki boncukların görüntüsünü elde etmek için jel yüzeyine odaklanın. Sınırlandırılmamış alt tabakadaki boncukların tek kanallı RGB görüntüsünü üretin ve bu görüntüyü bir tiff dosyası olarak kaydedin.Çekiş kuvveti analiz kodunu indirin TFM2021 ve MATLAB'da TFM2021'i açın. Ana kapıyı açın. m TFM2021'de ve çalıştırın.Ekranda grafik kullanıcı arabirimi göründüğünde. Eğitimsiz, substrat görüntüsünü yükleyin ve kısıtlanılmamış alt tabakada X-Y konumu düzeltilmiş boncuk görüntüsünü seçin. Floresan boncuk görüntülerini yüklemek için gidin ve görüntü boncuklarının zaman atlamalı yığınını seçin.Ardından, parlak alanın zaman atlamalı yığın görüntüsünü seçmek için parlak alan görüntülerini yükle'ye tıklayın ve EGFP'nin zaman atlamalı yığın görüntüsünü seçmek için yük GFP görüntülerini kullanın. Grafik kullanıcı arabirimindeki açılan listeden, görüntülenen hücre görüntüsünde iki noktayı tıklatarak büyüme konisi de dahil olmak üzere ilgi çekici dikdörtgen bölgeyi belirtmek için yatırım getirisini tıklatmadan önce GFP'yi seçin. Tamamlandığında, seçilen yığın görüntülerini bir mat dosyasında yatırım getirisi ile birlikte kaydetmek için grafik kullanıcı arabirimindeki kaydet düğmesine tıklayın.Ardından, yerinde algıla'ya tıklayın ve boncuk algılama eşiğini belirlemek için diyalog kutusuna istediğiniz değeri girin. Hesaplamaya başlamak için Tamam'a bas. Hesaplamayı bitirdikten sonra, daha önce seçilen bölgeyi büyütmek ve algılanan boncukları beyaz noktalar olarak görüntülemek için çizim parçasına tıklayın.Büyüme konisinin altındaki doğru noktaları içeren çokgen bir bölgeyi sınırlandırmak için seçilmiş boncukları kullanın. Daha sonra klavyeye enter tuşuna basarak, çokgen bölgedeki beyaz noktalar kırmızıya dönüşür. Grafik kullanıcı arabiriminde tahmin kuvveti üzerine tıklayın.Daha sonra piksel boyutu ve Young'ın modülü için giriş değerleri yazıda açıklandığı gibi. Poisson'un oranının değerini 0,3 olarak koyun ve hesaplamayı başlatmak için tahmin kuvveti yürütün. Yazılım, hesaplama sonuçlarını elektronik tablo biçimli bir dosyaya kaydeder.Bir nöronal büyüme konisinin floresan görüntüleri, tamamen açık ve dar bir diyafram altında büyüme konisi morfolojisinin görselleştirilmesine izin veren yüksek bir Lifeact ifadesi gösterdi. HaloTag-actin ekspresyon seviyeleri loş sinyallerle çok düşüktü. Diyafram uygun şekilde daraltıldığında, arka plan sinyalleri azalır ve büyüme konisinde beneklerde tek bir hareket görülür.Tüm adımları uygun şekilde başaran araştırmacılar, büyüme konisinde F-actin retrograd akışını gözlemleyecektir. Poliakrilamid jelin sertliği, mikrosferin ağırlığından kaynaklanan girinti derinliği hesaplanarak belirlendi. Jel yüzeyinin ve mikrosferin tabanının görüntülerini yakalamak için lazer tarama konfokal mikroskobu kullanıldı.Floresan boncuklardan gelen sinyaller girintili bölgedeki jel yüzeyinde görünmüyordu. Poliakrilamid jel ve nöral büyüme koni içine gömülü boncukların floresan görüntüleri, boncukların kökenlerini ve yer değiştirmiş konumlarını gösterdi. Büyüme konisinin EGFP sinyali de gözlendi.Kimograflar, bir referans boncukla karşılaştırıldığında boncuk hareketlerini gösterdi. Tek bir benek görüntüleme yaparken, haftalık olarak minimum iki alanın altında nasıl hareket gerektiğini ifade eden bir nöron seçmek için önemli şeyler. Bir çekiş kuvveti mikroskopisi yapılırken, yüksek büyütme görüntüleme, çekiş kuvvetinin doğru konsantrasyonu için önemlidir.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Analyses of Actin Dynamics, Clutch Coupling and Traction Force for Growth Cone Advance

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones Video (Video) | JoVE

Nöronal Büyüme Konileri permeabilize rodamin-aktin ile F-aktin Dikenli Ends Etiketleme

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric Analyses of Retinal Sections Video (Video) | JoVE

Retina Bölüm morfometrik Analizleri

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses

Transretinal ERG Recordings from Mouse Retina: Rod and Cone Photoresponses Video (Video) | JoVE

Fare Retina gelen Transretinal ERG Kayıtlar: Rod ve Koni Photoresponses

There are two distinct classes of image-forming photoreceptors in the vertebrate retina: rods and cones. Rods are able to detect single photons of light ...

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish

Long-term Behavioral Tracking of Freely Swimming Weakly Electric Fish Video (Video) | JoVE

Serbestçe Yüzme Zayıf Elektrik Balık Uzun vadeli Davranış Takip

Long-term behavioral tracking can capture and quantify natural animal behaviors, including those occurring infrequently. Behaviors such as exploration and ...

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types Video (Video) | JoVE

Sinir Hücresi Tipleri Yüzey Akış Sitometri Protokolleri ve Hücre içi Antijen Analizleri

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina Video (Video) | JoVE

Görüntüleme Ca<sup&gt; 2+</supFare Retina Koni fotoreseptör Akson Terminalleri içinde&gt; Dinamikleri

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons Video (Video) | JoVE

Rat Kortikal Nöronlar Filamentli Aktin (F-aktin) puncta Niceleme

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy

Peering at Brain Polysomes with Atomic Force Microscopy Video (Video) | JoVE

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Beyin Polisomlar de Peering

The translational machinery, i.e., the polysome or polyribosome, is one of the biggest and most complex cytoplasmic machineries in cells. Polysomes, ...

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography

Microstate and Omega Complexity Analyses of the Resting-state Electroencephalography Video (Video) | JoVE

Microstate ve dinlenme-devlet elektroansefalografi Omega karmaşıklık analizleri

Microstate and omega complexity are two reference-free electroencephalography (EEG) measures that can represent the temporal and spatial complexities of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid Î² Effects in Cultured Mouse Neurons Video (Video) | JoVE

Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...