Name: tobacco hornworm as an insect model system for cannabinoid pre-clinical studies
Uploaded: 2021-12-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Institute of Cannabis Research ved Colorado State University-Pueblo og Ministeriet for Videnskab og IKT (2021-DD-UP-0379) og Chuncheon by (Hemp R &D og industrialisering, 2020-2021).

1. Hornorm forberedelse og cannabidiol behandling
<ol><li>Opnå 150-200 levedygtige M. sextaæg og kunstig kost af hvedekim (se Materialetabel).</li>
	<li>Læg hornormæggene i en polystyren petriskål med et hvedekimbaseret kunstigt kostlag (AD), og overfør æggene til et insektopdrætskammer (se materialetabellen), der holdes ved 25 °C med 40%-60% relativ luftfugtighed.</li>
	<li>Lad tobakshornormæg i 1-3 dage klække inde i insektopdrætskammere...

<ol>
	<li>Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+attenuates+seizures+and+social+deficits+in+a+mouse+model+of+Dravet+syndrome.">Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).</li><li>Leehey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+of+cannabidiol+in+Parkinson+Disease:+An+open+label,+dose-escalation+study.">Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).</li><li>Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+cannabinoids,+delta+9-+tetrahydrocannabinol+and+cannabidiol,+ameliorates+experimental+multiple+sclerosis+by+suppressing+neuroinflammation+through+regulation+of+miRNA-mediated+signaling+pathways.">Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).</li><li>Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+(CBD)+as+a+promising+anti-cancer+drug.">Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug.</a> Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).</li><li>Garcia-Morales, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBD+reverts+the+mesenchymal+invasive+phenotype+of+breast+cancer+cells+induced+by+the+inflammatory+cytokine+IL-1beta).">CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta).</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).</li><li>Jeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+promotes+apoptosis+via+regulation+of+XIAP/Smac+in+gastric+cancer.">Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer.</a> Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).</li><li>Devinsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-label+use+of+highly+purified+CBD+(Epidiolex&#174;)+in+patients+with+CDKL5+deficiency+disorder+and+Aicardi,+Dup15q,+and+Doose+syndromes.">Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex&#174;) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes.</a> Epilepsy &amp; Behavior. 86, 131-137 (2018).</li><li>de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBD+activation+of+TRPV1+induces+oxidative+signaling+and+subsequent+ER+stress+in+breast+cancer+cell+lines.">CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).</li><li>Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+and+sertraline+regulate+behavioral+and+brain+gene+expression+alterations+in+an+animal+model+of+PTSD.">Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).</li><li>Aso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol-enriched+extract+reduced+the+cognitive+impairment+but+not+the+epileptic+seizures+in+a+Lafora+disease+animal+model.">Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).</li><li>Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+recruitment+and+retention+of+clinical+trial+subjects.">Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects.</a> Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+disrupts+apoptosis,+autophagy+and+invasion+processes+of+placental+trophoblasts.">Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>. Trophoblast Available from: <a target="_blank" href="https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast">https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast</a> (2021)</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+inhibited+pancreatic+cancer+via+P-21+activated+kinase+1+mediated+pathway.">Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).</li><li>Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol-induced+apoptosis+is+mediated+by+activation+of+Noxa+in+human+colorectal+cancer+cells.">Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells.</a> Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).</li><li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+as+biological+models:+Practical+steps+for+more+reliable+research.">Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).</li><li>Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+antiseizure+efficacy+of+cannabidiol+and+clonazepam+in+a+conditional+mouse+model+of+Dravet+syndrome.">Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome.</a> Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).</li><li>Orvos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrophysiological+effect+of+cannabidiol+on+hERG+current+and+in+guinea-pig+and+rabbit+cardiac+preparations.">The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).</li><li>Verrico, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study+of+daily+cannabidiol+for+the+treatment+of+canine+osteoarthritis.">A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis.</a> Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).</li><li>Barata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+cannabidiol+and+hypothermia+in+a+piglet+model+of+newborn+hypoxic-ischemic+brain+damage.">Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage.</a> Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).</li><li>Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+agonistic+activity+of+delta+9-11-tetrahydrocannabinol+in+mice,+dogs+and+rhesus+monkeys+and+its+interactions+with+delta+9-tetrahydrocannabinol.">Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).</li><li>Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+effects+on+arachidonic+acid+metabolism+of+low+doses+of+cannabidiol+following+oral+administration+to+horses.">Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses.</a> Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).</li><li>Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mighty+Mouse:+The+impact+of+rodents+on+advances+in+biomedical+research.">The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBD+promotes+oral+ulcer+healing+via+inhibiting+CMPK2-mediated+inflammasome.">CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome.</a> Journal of Dental Research. , (2021).</li><li>Mastinu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prosocial+effects+of+nonpsychotropic+Cannabis+sativa+in+mice.">Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).</li><li>Justice, M. J., Dhillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+mouse+to+model+human+disease:+increasing+validity+and+reproducibility.">Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).</li><li>Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Models for Biomedical Research. , 61-72 (1989).</li><li>He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+modulate+food+preference+and+consumption+in+Drosophila+melanogaster.">Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).</li><li>Kanost, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+biological+insights+from+a+draft+genome+sequence+of+the+tobacco+hornworm+moth,+Manduca+sexta.">Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+roles+of+cannabidiol+as+an+insecticide+and+rescuing+agent+for+ethanol-induced+death+in+the+tobacco+hornworm+Manduca+sexta.">Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).</li><li>Tukey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Mantel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+survival+data+and+two+new+rank+order+statistics+arising+in+its+consideration.">Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration.</a> Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).</li><li>Watts, S., Kariyat, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picking+sides:+Feeding+on+the+abaxial+leaf+surface+is+costly+for+caterpillars.">Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars.</a> Planta. 253 (4), 77 (2021).</li><li>McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+receptors+in+invertebrates.">Cannabinoid receptors in invertebrates.</a> Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).</li></ol>

Fodringsundersøgelsen viste, at høje doser af CBD (2 mM) hæmmede insektets vækst og øgede dødelighed31. Insektmodellen viste også følsomhed over for ethanol; CBD afgiftede dog effektivt ethanoltoksiciteten og øgede deres overlevelsesrate, kostforbrug og madsøgningsadfærd til lignende niveauer som kontrolgruppen (Figur 3A, B)31. Det beskrevne insektmodelsystem består af tre kritiske trin: (1) at sikre , at M. sex...

I løbet af de seneste år har offentlighedens opmærksomhed været centreret om cannabinoider på grund af deres terapeutiske potentiale, herunder behandling af epilepsi1, Parkinsons sygdom2, multipel sklerose3 og forskellige former for kræft4,5,6 med cannabidiol (CBD). Da Cannabis er legaliseret som en landbrugsvare i Agricultural Improvement Act of 2018, er offentlig lov 115-334 (farm billen fra 2018), cannabis og dets cannabinoidderivater i fødevare-, kosmetik- og medicinalindustrien steget eksponentielt. Derudover, kliniske kvalitet isolater af enkelte cannabinoider og cannabinoid blandinger er blevet testet med succes i mennesker7, cellelinjer5,8, og forskellige dyr model systemer9,10.
Et klinisk forsøg ville være ideelt til validering af effekten og bivirkningerne af cannabinoider på en bestemt sygdom. Der er dog mange udfordringer i kliniske forsøg, herunder etisk/IRB-godkendelse, rekruttering og fastholdelse af forsøgspersonerne11. For at overvinde disse forhindringer blev forskellige menneskelige cellelinjer brugt, fordi menneskeafledte cellelinjer er omkostningseffektive, nemme at håndtere, kan omgå de etiske spørgsmål og give ensartede og reproducerbare resultater, da cellelinjerne er en 'ren population af celler, der ikke har krydskontaminering af andre celler og kemikalier'12.
Alves et al. (2021)13 testede CBD på en dosisafhængig måde i placental trofoblaster, som er specialiserede celler i moderkagen, der spiller en væsentlig rolle i embryoimplantatering og interaktion med den cidualiserede moderlige livmoder14. Deres resultater viste, at CBD forårsagede tab af celle levedygtighed, afbrydelse af cellecyklusforløbet og apoptose induktion. Disse observationer viser de potentielle negative virkninger af cannabisbrug af gravide kvinder13. Ligeledes blev en række cellelinjer også brugt til at undersøge de farmakologiske virkninger af CBD i menneskelige sygdomme, især forskellige former for kræft. In vitro-undersøgelserne viste med succes anti-cancer effekter i bugspytkirtlen15, bryst8, og kolorektal cancerceller16. Men, mens der er bredt tilgængelige og let at håndtere, specifikke cellelinjer såsom HeLa, HEK293 er tilbøjelige til genetiske og fænotypiske ændringer på grund af ændringer i deres vækstbetingelser eller håndtering17.
I Cannabis forskning, forskellige dyr model systemer, lige fra små dyr som mouse18, marsvin19, og kanin19 til store dyr som hunde20, gris21, monkey22, horse23, er blevet brugt til at udforske ukendte terapeutiske virkninger. Mus har været det mest foretrukne dyremodelsystem til cannabinoidforskning på grund af deres anatomiske, fysiologiske og genetiske lighed med mennesker24. Mest markant har mus CB1/2 receptorer i deres nervesystem, som er til stede hos mennesker. De har også en kortere livscyklus end mennesker, med lettere vedligeholdelse og rigelige genetiske ressourcer, hvilket gør det meget lettere at overvåge virkningerne af cannabinoider gennem en hel livscyklus. Pattedyrsystemet er meget udbredt og har med succes vist, at CBD lindrer anfaldsforstyrrelser1, posttraumatisk stressforstyrrelse9, orale sår25 og demenslignende symptomer10. Musemodellen har også muliggjort en social interaktionsundersøgelse af individer i et samfund, som er yderst vanskeligt hos store dyr og mennesker26.
På trods af alle fordelene ved dyremodelsystemet er det stadig dyrt og kræver intensiv pleje under lægemiddeladministration og dataindsamling. Derudover er der kontrol af at bruge mus i forskning på grund af uigenkaldelighed og dårlig rekapitulation af menneskelige forhold på grund af begrænsninger i eksperimentelt design og stringens27.
Med den stigende efterspørgsel efter medicinske / prækliniske undersøgelser af cannabinoider er der behov for et ikke-pattedyrmodelsystem. Hvirvelløse modeller traditionelt tillagt karakteristiske fordele i forhold til hvirveldyr modeller. De betydelige fordele omfatter den lette og lave pris ved at opdrætte mange prøver og gøre det muligt for forskere at overvåge flere generationer af genetisk homogene populationer28. En nylig undersøgelse viste, at frugtfluen, Drosophila melanogaster, var et effektivt insektmodelsystem til at undersøge farmakologiske funktioner af cannabinoider i modulerende fodringsadfærd29. Blandt insektmodelsystemerne fokuserede forfatterne på tobakshornormen Manduca sexta, også kendt som Carolina sfinxmot eller hawk moth, som et nyt insektmodelsystem til cannabinoidforskning.
Manduca sexta tilhører Sphingidaes familie. Insektet er det mest almindelige plante skadedyr i det sydlige USA, hvor de fodrer med solanaceous planter. Insektmodellen har en lang historie inden for forskning i insektfysiologi, biokemi, neurobiologi og lægemiddelinteraktionsstudier. Manduca sextas forskningsportefølje omfatter et udkast til genomsekvens, der giver mulighed for en molekylær forståelse af væsentlige cellulære processer30. En anden afgørende fordel ved dette modelsystem er dets store størrelse og når mere end 100 mm i længden og 10 g i vægt i de 18-25 dages larveudvikling. Den store størrelse gør det muligt for forskere nemt at overvåge morfologiske og adfærdsmæssige ændringer i realtid som reaktion på CBD-behandlingen. På grund af størrelsen blev elektrofysiologiske reaktioner også undersøgt med abdominalnervesystemet, herunder ganglier dissekeret fra larverne uden mikroskopindstillinger i høj opløsning. Den unikke funktion gør det muligt for forskere at let undersøge akutte og langsigtede reaktioner på de administrerede cannabinoid(er).
På trods af en sådan alsidighed er M. sexta først for nylig blevet undersøgt for sin egnethed som en eksperimentel model for Cannabis og cannabinoidstudier. I 2019 brugte forfatterne insektmodelsystemet for første gang til at adressere hypotesen om, at Cannabis har udviklet sig til at producere Cannabidiol for at beskytte sig mod insekt planteædere30,31. Resultatet viste tydeligt, at planterne udnyttede CBD som en fodrings afskrækkende virkning og hæmmede væksten af skadedyrsinsekttet M. sexta larve, samt forårsagede øget dødelighed31. Undersøgelsen viste også, at CBD's redning af virkningerne på berusede ethanollarver identificerede den potentielle køretøjseffekt af ethanol som bærer af CBD. Som vist undersøgte insektmodelsystemet effektivt de terapeutiske virkninger af cannabinoider inden for 3-4 uger med mindre arbejdskraft og omkostninger end andre dyresystemer. Selvom insektmodellen mangler cannabinoidreceptorer (dvs. ingen CB1/2-receptorer), giver modelsystemet et værdifuldt værktøj til at forstå cannabinoidernes farmakologiske roller gennem en cannabinoid receptor-uafhængig måde.
Forfatterne af denne undersøgelse har tidligere arbejdet med tobak hornorm som et modelsystem for cannabinoid forskning31. Efter nøje overvejelse af fordele og risici ved at bruge M. sexta, har vi givet en metode, der involverer korrekt pleje og forberedelse af kost til prækliniske forsøg, der giver mulighed for fremtidig præklinisk laboratoriebrug.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analytic balance</td>
			<td>Mettler Instrument Corp.</td>
			<td>AE100S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannabidiol isolate (&#62;99.4%)</td>
			<td>Lilu&#39;s Garden</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL</td>
			<td>470150-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89093-192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, 200 Proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fear conditioning chamber</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect rearing chamber</td>
			<td>Darwin Chambers</td>
			<td>INR034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium chain triglycerides (MCT) oil</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion detection software (Actimetrics)</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco hormworm artificial diet</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>Item # 143908</td>
			<td>Ready-To-Use-Hornworm-Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco hormworm eggs</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>Item # 143880</td>
			<td>Unit of 30-50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tobacco hornworm as an insect model system for cannabinoid pre-clinical studies

Med øget opmærksomhed på cannabinoider i medicin er flere pattedyrsmodelorganismer blevet brugt til at belyse deres ukendte farmaceutiske funktioner. Der er dog stadig mange vanskeligheder i pattedyrsforskning, hvilket kræver udvikling af ikke-pattedyrs modelorganismer til cannabinoidforskning. Forfatterne foreslår tobak hornorm Manduca sexta som en ny insekt model system. Denne protokol giver oplysninger om forberedelse af den kunstige kost med varierende mængder cannabidiol (CBD), opsætning af et dyrkningsmiljø og overvågning af deres fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer som reaktion på CBD-behandling. Kort sagt, efter at have modtaget hornorm æg, æggene fik lov 1-3 dage ved 25 °C på en 12:12 lyse-mørk cyklus til at luge, før de tilfældigt distribueres til kontrol (hvedekim-baseret kunstig kost; AD), køretøj (AD + 0,1% mellemkædet triglyceridolie; MCT olie) og behandlingsgrupper (AD + 0,1% MCT + 1 mM eller 2 mM CBD). Når mediet var forberedt, blev 1. instar larver individuelt placeret i et 50 mL reagensglas med en træspydpind, og derefter blev reagensglasset dækket af en osteklud. Målinger blev taget med 2 dages intervaller for fysiologiske og adfærdsmæssige reaktioner på CBD-administrationen. Denne enkle dyrkningsprocedure gør det muligt for forskere at teste store prøver i et givet eksperiment. Derudover gør de relativt korte livscyklus det muligt for forskere at studere virkningen af cannabinoidbehandlinger over flere generationer af en homogen befolkning, hvilket giver mulighed for data til støtte for et eksperimentelt design i højere pattedyrmodelorganismer.

Manduca sexta som model system til at undersøge cannabinoider toksicitet Figur 1 skildrer de vigtigste komponenter i CBD-eksperimentet ved hjælp af tobakshornorm Manduca sexta. Et stort antal insekter (>20) blev individuelt opdrættet ved 25 °C på en 12 h:12 h = lys: mørk cyklus. Insekternes størrelse, vægt og dødelighed blev målt med 2 dages mellemrum for at overvåge for kort- og langsigtede reaktioner efter højdosis CBD (2 m...

Watch this Scientific Journal Video about Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies at JoVE.com

Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies

Den nuværende protokol giver instruktionsinformation til brug af tobak hornorm Manduca sexta i cannabinoid forskning. Den metode, der er beskrevet her, omfatter alle nødvendige forsyninger og protokoller til at overvåge fysiologiske og adfærdsmæssige ændringer af insektmodellen som reaktion på cannabidiol (CBD) behandling.

Tobak Hornorm som et insekt model system for cannabinoid prækliniske undersøgelser

With increased attention on cannabinoids in medicine, several mammalian model organisms have been used to elucidate their unknown pharmaceutical ...

Protokollen foreslår at bruge tobak hornorm som et insekt model system for cannabinoid prækliniske undersøgelser. Dette system gør det muligt for forskere at undersøge akutte og langsigtede reaktioner på cannabinoider let. Insektmodelsystemet gør det muligt for forskere at undersøge cannabinoid terapeutiske virkninger i en stor befolkning inden for tre til fire uger med mindre arbejdskraft og omkostninger end andre dyresystemer.Opnå 150 til 200 levedygtige M.sexta æg og hvedekim-baserede kunstige kostvaner. Placer hornormæggene i en polystyren petriskål med et hvedekimbaseret kunstigt kostlag og overfør æggene til et insektopdrætskammer, der opretholdes ved 25 grader Celsius med 40 til 60% relativ fugtighed. Lad æggene klække i en til tre dage inde i insektopdrætskammeret.For at forberede en 200 millimolar cannabidiol lageropløsning tilsættes 1,26 gram større end 98% renhed cannabidiol isolere i 20 milliliter ethanol eller 100% medium kæde triglyceridolie. Tilsæt fem milliliter og 10 milliliter af 200 millimolar cannabidiol lageropløsning til 1.000 gram kunstig kost for henholdsvis en millimolar og to millimolar cannabidiol. Dispenser 20 gram kontrolkøretøj og cannabidiolholdige medier til bunden af 50-milliliterrøret.Tilfældigt distribuere cirka to millimeter lange første instar larver individuelt i en 50-milliliter reagensglas og dække med en perforeret låg eller cheesecloth. Dyrk dem inde i et insektopdrætskammer, der opretholdes ved 25 grader Celsius med en 12-timers lys mørk cyklus. For at måle larvevæksten skal du registrere hver gruppes oprindelige masse og størrelse med henholdsvis en analytisk balance og lineal og introducere larverne til deres respektive kostvaner.Træk larvernes masse ved hver måling med to dages mellemrum fra den oprindelige masse for at bestemme massegevinster mellem larvernes udviklingsstadier. Registrer også antallet af dage mellem instar udviklingsstadierne for at forstå forskelle i udviklingsfristen indtil hvalp. For at måle kostforbruget skal du registrere de første gram kost i begyndelsen ved eksperimentet og trække det fra den resterende mængde kost, da larverne kom ind i det komplette hvalpstadium.Til larvemobilitetsmålingen skal det udsatte insekt akklimatere sig til frygtkonditioneringskammeret i mindst fem minutter og spore de afstande, som de tre grupper af femte instar insekter rejste i fem minutter. Kør derefter bevægelsesregistreringssoftwaren for at analysere mobilitetsresponset. Insekterne opdrættet på en kunstig kost viste den bedste vækstpræstation.Køretøjets kontrol, der brugte 0,1% medium kæde triglyceridolie som opløsende middel til CBD-isolate, viste også normal vækst uden skadelige virkninger. Men en høj dosis CBD på to millimeter induceret vægttab og førte til en højere dødelighed end kontrol og køretøjsgrupper. M.sexta larver opdrættet på AD med en millimeter CBD forbruges mindst 3,1 gange større kost end dem, der opdrættes på en ethanol-tilsat kost.Kostforbruget af de insekter, der blev opdrættet på to millimolar CBD-tilsatte medier, var imidlertid ikke signifikant forskelligt fra larverne, der blev opdrættet på ethanol-only kostvaner. Det mobile indeks for M.sexta larve opdrættet under forskellige forhold viser, at 1% ethanol og en millimolar CBD-behandlede larver ikke påvirkede mobiliteten. De 2% ethanol behandlinger viste sig at være dødbringende.Tilføjelse af en høj dosis CBD i AD, der indeholder 2% ethanol genoprettet lav mobilitet. Når CBD er tilsat til kostvaner, homogeniser du kosten CBD-blandingen fuldstændigt og vokser insekter i insektopdrætskammeret, der opretholdes ved 25 grader Celsius med 40 til 60% fugtighed for at undgå et svampeudbrud. Elektrofysiologiske reaktioner kan også overvåges med ventral kæde ganglier dissekeret fra Manduca sexta for at afgøre, om CBD påvirker tobakshornormens centralnervesystem.Insektmodelsystemet vil gøre det muligt for forskere at udforske andre større og mindre cannabinoiders farmaceutiske roller ved at teste over flere generationer, hvilket giver mulighed for et eksperimentelt design hos højere pattedyr.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effektiv Produktion og oprensning af rekombinant murin Kindlin-3 fra Insect Celler til Biofysiske Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

En eksperimentel og Bioinformatik Protokol for RNA-seq Analyser af Fotoperiodisk diapause i den asiatiske Tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Rumlig Reorganisering af et MAPK signalvej Brug af tobak Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Etablering af en ekstracellulære sure pH kultur System

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Forsøgsplan for at bruge Drosophila som hvirvelløse modelsystem for afprøvning af toksicitet i laboratoriet

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

Massespektrometri analyse til at identificere allestedsnærværendelation af EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Forberedelse og injektion af embryoner af Culex-myg til generering af Null-mutationer ved hjælp af CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...