Name: tobacco hornworm as an insect model system for cannabinoid pre-clinical studies
Uploaded: 2021-12-29T15:00:00
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Cette recherche a été soutenue par l’Institut de recherche sur le cannabis de la Colorado State University-Pueblo et le ministère des Sciences et des TIC (2021-DD-UP-0379) et la ville de Chuncheon (R&D et industrialisation du chanvre, 2020-2021).

1. Préparation du ver de corne et traitement au cannabidiol
<ol><li>Obtenir 150-200 M viable. les œufs de sexta et les régimes artificiels à base de germe de blé (voir tableau des matières).</li>
	<li>Placer les œufs de vers de corne dans une boîte de Petri en polystyrène avec une couche de régime artificiel (DA) à base de germe de blé et transférer les œufs dans une chambre d’élevage d’insectes (voir tableau des matériaux) mainten...

<ol>
	<li>Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+attenuates+seizures+and+social+deficits+in+a+mouse+model+of+Dravet+syndrome.">Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).</li><li>Leehey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+of+cannabidiol+in+Parkinson+Disease:+An+open+label,+dose-escalation+study.">Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).</li><li>Al-Ghezi, Z. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+disrupts+apoptosis,+autophagy+and+invasion+processes+of+placental+trophoblasts.">Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study+of+daily+cannabidiol+for+the+treatment+of+canine+osteoarthritis.">A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis.</a> Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).</li><li>Barata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+cannabidiol+and+hypothermia+in+a+piglet+model+of+newborn+hypoxic-ischemic+brain+damage.">Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage.</a> Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).</li><li>Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. 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J., Dhillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+mouse+to+model+human+disease:+increasing+validity+and+reproducibility.">Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).</li><li>Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Models for Biomedical Research. , 61-72 (1989).</li><li>He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+roles+of+cannabidiol+as+an+insecticide+and+rescuing+agent+for+ethanol-induced+death+in+the+tobacco+hornworm+Manduca+sexta.">Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).</li><li>Tukey, J. 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M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+receptors+in+invertebrates.">Cannabinoid receptors in invertebrates.</a> Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).</li></ol>

L’étude sur l’alimentation a démontré que de fortes doses de CBD (2 mM) inhibaient la croissance de l’insecte et augmentaient la mortalité31. Le modèle d’insecte a également montré une sensibilité à l’éthanol; cependant, le CBD a effectivement détoxiqué la toxicité de l’éthanol, augmentant leur taux de survie, leur consommation alimentaire et leurs comportements de recherche alimentaire à des niveaux similaires à ceux du groupe témoin (Figure 3A</s...

Au cours des dernières années, l’attention du public a été centrée sur les cannabinoïdes en raison de leur potentiel thérapeutique, y compris le traitement de l’épilepsie1, de la maladie de Parkinson2, de la sclérose en plaques3 et de diverses formes de cancer4,5,6 avec le cannabidiol (CBD). Depuis que le cannabis est légalisé en tant que produit agricole dans la loi sur l’amélioration agricole de 2018, la loi publique 115-334 (le Farm Bill de 2018), le cannabis et ses dérivés cannabinoïdes dans les industries alimentaire, cosmétique et pharmaceutique ont augmenté de manière exponentielle. De plus, des isolats de qualité clinique de cannabinoïdes simples et de mélanges de cannabinoïdes ont été testés avec succès chez des sujets humains7, des lignées cellulaires5,8 et divers systèmes de modèles animaux9,10.
Un essai clinique serait idéal pour valider l’efficacité et les effets indésirables des cannabinoïdes sur une maladie spécifique. Cependant, les essais cliniques présentent de nombreux défis, notamment l’approbation éthique/IRB, le recrutement et la rétention des sujets11. Pour surmonter ces obstacles, diverses lignées cellulaires humaines ont été utilisées parce que les lignées cellulaires d’origine humaine sont rentables, faciles à manipuler, peuvent contourner les questions éthiques et fournir des résultats cohérents et reproductibles, car les lignées cellulaires sont une « population pure de cellules qui n’ont pas de contamination croisée d’autres cellules et produits chimiques»12.
Alves et al. (2021)13 ont testé le CBD de manière dose-dépendante dans les trophoblastes placentaires, qui sont des cellules spécialisées du placenta qui jouent un rôle essentiel dans l’implantation embryonnaire et l’interaction avec l’utérus maternel décidualisé14. Leurs résultats ont montré que le CBD causait une perte de viabilité cellulaire, une perturbation de la progression du cycle cellulaire et une induction de l’apoptose. Ces observations démontrent les effets négatifs potentiels de la consommation de cannabis chez les femmes enceintes13. De même, une série de lignées cellulaires ont également été utilisées pour examiner les effets pharmacologiques du CBD dans les maladies humaines, en particulier diverses formes de cancer. Les études in vitro ont démontré avec succès les effets anticancéreux dans les cellules cancéreuses du pancréas15, du sein8 et colorectal16. Cependant, tout en étant largement disponibles et faciles à manipuler, des lignées cellulaires spécifiques telles que HeLa, HEK293 sont sujettes à des changements génétiques et phénotypiques dus à des altérations de leurs conditions de croissance ou de leur manipulation17.
Dans la recherche sur le cannabis, divers systèmes de modèles animaux, allant de petits animaux tels que mouse18, guinea-pig19 et rabbit19 à de grands animaux tels que canine20, piglet21, monkey22, horse23, ont été utilisés pour explorer des effets thérapeutiques inconnus. Les souris ont été le système modèle animal le plus préféré pour la recherche sur les cannabinoïdes en raison de leur similitude anatomique, physiologique et génétique avec les humains24. Plus important encore, les souris ont des récepteurs CB1/2 dans leur système nerveux, qui sont présents chez l’homme. Ils ont également un cycle de vie plus court que les sujets humains, avec un entretien plus facile et des ressources génétiques abondantes, ce qui facilite grandement la surveillance des effets des cannabinoïdes tout au long d’un cycle de vie. Le système des mammifères est largement utilisé et a démontré avec succès que le CBD soulage les troubles épileptiques1, le trouble de stress post-traumatique9, les ulcères buccaux25 et les symptômes de type démence10. Le modèle murin a également permis une étude de l’interaction sociale des individus au sein d’une communauté, ce qui est extrêmement difficile chez les grands animaux et les humains26.
Malgré tous les avantages du système de modèle animal, il est toujours coûteux et nécessite des soins intensifs lors de l’administration des médicaments et de la collecte de données. En outre, l’utilisation de souris dans la recherche fait l’objet d’un examen minutieux en raison de l’irreproductibilité et de la mauvaise récapitulation des conditions humaines en raison des limites de la conception expérimentale et de la rigueur27.
Avec la demande croissante d’études médicales / précliniques sur les cannabinoïdes, un système modèle non mammifère est nécessaire. Les modèles d’invertébrés conféraient traditionnellement des avantages distincts par rapport aux modèles de vertébrés. Les avantages significatifs comprennent la facilité et le faible coût de l’élevage de nombreux spécimens et permettant aux chercheurs de surveiller plusieurs générations de populations génétiquement homogènes28. Une étude récente a prouvé que la mouche des fruits, Drosophila melanogaster, était un système modèle d’insecte efficace pour étudier les fonctions pharmacologiques des cannabinoïdes dans la modulation des comportements alimentaires29. Parmi les systèmes modèles d’insectes, les auteurs se sont concentrés sur le ver du tabac, Manduca sexta, également connu sous le nom de papillon de nuit du sphinx de Caroline ou papillon faucon, en tant que nouveau système modèle d’insecte pour la recherche sur les cannabinoïdes.
Manduca sexta appartient à la famille des Sphingidae. L’insecte est le ravageur des plantes le plus commun dans le sud des États-Unis, où il se nourrit de plantes solanacées. Le modèle d’insecte a une longue histoire dans la recherche en physiologie des insectes, biochimie, neurobiologie et études d’interaction médicamenteuse. Le portefeuille de recherche de Manduca sexta comprend un projet de séquence du génome, permettant une compréhension au niveau moléculaire des processus cellulaires essentiels30. Un autre avantage crucial de ce système modèle est sa grande taille, atteignant plus de 100 mm de longueur et 10 g de poids dans les 18-25 jours de développement larvaire. La grande taille permet aux chercheurs de surveiller facilement les changements morphologiques et comportementaux en temps réel en réponse au traitement au CBD. En outre, en raison de la taille, les réponses électrophysiologiques ont été examinées avec le système nerveux abdominal, y compris les ganglions disséqués des larves sans réglages de microscope à haute résolution. Cette caractéristique unique permet aux chercheurs d’étudier facilement les réponses aiguës et à long terme au(x) cannabinoïde(s) administré(s).
Malgré cette polyvalence, M. sexta n’a été exploré que récemment pour sa pertinence en tant que modèle expérimental pour les études sur le cannabis et les cannabinoïdes. En 2019, les auteurs ont utilisé pour la première fois le système de modèle d’insecte pour répondre à l’hypothèse selon laquelle le cannabis a évolué pour produire du cannabidiol afin de se protéger des insectes herbivores30,31. Le résultat a clairement montré que les plantes exploitaient le CBD comme moyen de dissuasion alimentaire et inhibaient la croissance de la chenille de l’insecte ravageur M. sexta, tout en provoquant une mortalité accrue31. L’étude a également démontré les effets de sauvetage du CBD sur les larves d’éthanol intoxiquées, identifiant l’effet véhicule potentiel de l’éthanol en tant que porteur du CBD. Comme montré, le système de modèle d’insecte a efficacement étudié les effets thérapeutiques des cannabinoïdes en 3-4 semaines avec moins de main-d’œuvre et de coûts que les autres systèmes animaux. Bien que le modèle d’insectes manque de récepteurs cannabinoïdes (c’est-à-dire pas de récepteurs CB1/2), le système modèle fournit un outil précieux pour comprendre les rôles pharmacologiques des cannabinoïdes d’une manière indépendante des récepteurs cannabinoïdes.
Les auteurs de cette étude ont déjà travaillé avec le ver du tabac comme système modèle pour la recherche sur les cannabinoïdes31. Après un examen attentif des avantages et des risques de l’utilisation de M. sexta, nous avons fourni une méthode impliquant les soins appropriés et la préparation du régime alimentaire pour les essais précliniques qui permettent des possibilités d’utilisation future en laboratoire préclinique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analytic balance</td>
			<td>Mettler Instrument Corp.</td>
			<td>AE100S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannabidiol isolate (&#62;99.4%)</td>
			<td>Lilu&#39;s Garden</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL</td>
			<td>470150-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89093-192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, 200 Proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fear conditioning chamber</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect rearing chamber</td>
			<td>Darwin Chambers</td>
			<td>INR034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium chain triglycerides (MCT) oil</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion detection software (Actimetrics)</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco hormworm artificial diet</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>Item # 143908</td>
			<td>Ready-To-Use-Hornworm-Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco hormworm eggs</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>Item # 143880</td>
			<td>Unit of 30-50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tobacco hornworm as an insect model system for cannabinoid pre-clinical studies

Avec une attention accrue portée aux cannabinoïdes en médecine, plusieurs organismes modèles de mammifères ont été utilisés pour élucider leurs fonctions pharmaceutiques inconnues. Cependant, de nombreuses difficultés subsistent dans la recherche sur les mammifères, ce qui nécessite le développement d’organismes modèles non mammifères pour la recherche sur les cannabinoïdes. Les auteurs suggèrent le ver du tabac Manduca sexta comme un nouveau système modèle d’insecte. Ce protocole fournit des informations sur la préparation du régime artificiel avec des quantités variables de cannabidiol (CBD), la mise en place d’un environnement de culture et la surveillance de leurs changements physiologiques et comportementaux en réponse au traitement au CBD. Brièvement, après avoir reçu des œufs de vers de corne, les œufs ont été autorisés à éclore 1 à 3 jours à 25 ° C sur un cycle clair-sombre de 12:12 avant d’être répartis au hasard dans le contrôle (régime artificiel à base de germe de blé; AD), véhicule (AD + 0,1 % d’huile de triglycérides à chaîne moyenne; HUILE MCT) et groupes de traitement (AD + 0,1% MCT + 1 mM ou 2 mM de CBD). Une fois le milieu préparé, les larves du 1er stade ont été placées individuellement dans un tube à essai de 50 ml avec un bâton de brochette en bois, puis le tube à essai a été recouvert d’une étamine. Des mesures ont été prises à intervalles de 2 jours pour les réponses physiologiques et comportementales à l’administration de CBD. Cette procédure de culture simple permet aux chercheurs de tester de grands spécimens dans une expérience donnée. De plus, les cycles de vie relativement courts permettent aux chercheurs d’étudier l’impact des traitements aux cannabinoïdes sur plusieurs générations d’une population homogène, ce qui permet d’obtenir des données à l’appui d’une conception expérimentale dans des organismes modèles de mammifères supérieurs.

Manduca sexta comme système modèle pour examiner la toxicité des cannabinoïdes La figure 1 illustre les composants clés de l’expérience CBD utilisant le ver du tabac Manduca sexta. Un grand nombre d’insectes (>20) ont été élevés individuellement à 25 °C sur un cycle 12 h:12 h = lumière: obscurité. La taille, le poids et la mortalité des insectes ont été mesurés à des intervalles de 2 jours pour surveiller les répo...

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Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies

Le présent protocole fournit des informations pédagogiques sur l’utilisation du ver du tabac Manduca sexta dans la recherche sur les cannabinoïdes. La méthode décrite ici comprend toutes les fournitures et protocoles nécessaires pour surveiller les changements physiologiques et comportementaux du modèle d’insecte en réponse au traitement au cannabidiol (CBD).

Le ver du tabac comme système modèle d’insecte pour les études précliniques sur les cannabinoïdes

With increased attention on cannabinoids in medicine, several mammalian model organisms have been used to elucidate their unknown pharmaceutical ...

Le protocole propose d’utiliser le ver du tabac comme système modèle d’insecte pour les études précliniques sur les cannabinoïdes. Ce système permet aux chercheurs d’étudier facilement les réponses aiguës et à long terme aux cannabinoïdes. Le système de modèle d’insecte permet aux chercheurs d’étudier les effets thérapeutiques des cannabinoïdes dans une grande population en trois à quatre semaines avec moins de main-d’œuvre et de coûts que les autres systèmes animaux.Obtenez 150 à 200 œufs M.sexta viables et des régimes artificiels à base de germe de blé. Placez les œufs de vers cornos dans une boîte de Petri en polystyrène avec une couche de régime artificiel à base de germe de blé et transférez les œufs dans une chambre d’élevage d’insectes maintenue à 25 degrés Celsius avec une humidité relative de 40 à 60%. Laissez les œufs éclore pendant un à trois jours à l’intérieur de la chambre d’élevage d’insectes.Pour préparer une solution mère de cannabidiol de 200 millimolaires, ajoutez 1,26 gramme d’isolat de cannabidiol d’une pureté supérieure à 98% dans 20 millilitres d’éthanol ou d’huile de triglycérides à chaîne moyenne à 100%. Ajouter cinq millilitres et 10 millilitres de la solution mère de cannabidiol de 200 millimolaires aux 1 000 grammes d’un régime artificiel pour un millimolaire et deux millimolaires de cannabidiol, respectivement. Distribuer 20 grammes de véhicule de contrôle et de milieu contenant du cannabidiol au fond du tube de 50 millilitres.Répartissez au hasard individuellement les larves du premier stade d’environ deux millimètres de long dans un tube à essai de 50 millilitres et recouvrez d’un couvercle perforé ou d’une étamine. Cultivez-les à l’intérieur d’une chambre d’élevage d’insectes maintenue à 25 degrés Celsius avec un cycle lumière-obscurité de 12 heures. Pour mesurer la croissance larvaire, enregistrez la masse et la taille initiales de chaque groupe avec une balance analytique et une règle, respectivement, et introduisez les larves dans leur régime alimentaire respectif.Soustrayez la masse des larves à chaque mesure à des intervalles de deux jours de la masse initiale pour déterminer les gains de masse entre les stades de développement des larves. De plus, notez le nombre de jours entre les stades de développement de l’enfant pour comprendre les différences dans la période de développement jusqu’à la nymphose. Pour mesurer la consommation de régime, enregistrez les grammes initiaux de régime au début de l’expérience et soustrayez-le de la quantité restante de régime alimentaire lorsque les larves sont entrées dans la phase complète de nymphose.Pour la mesure de la mobilité larvaire, laissez l’insecte soumis s’acclimater à la chambre de conditionnement de la peur pendant au moins cinq minutes et suivez les distances parcourues par les trois groupes d’insectes du cinquième stade pendant cinq minutes. Ensuite, exécutez le logiciel de détection de mouvement pour analyser la réponse de mobilité. Les insectes élevés sur un régime artificiel ont montré les meilleures performances de croissance.Le contrôle du véhicule qui a utilisé de l’huile de triglycérides à chaîne moyenne à 0,1% comme agent dissolvant pour l’isolat de CBD a également montré une croissance normale sans aucun effet néfaste. Cependant, une forte dose de CBD de deux millimètres a induit une perte de poids et a conduit à un taux de mortalité plus élevé que les groupes témoins et les groupes de véhicules. Les larves de M.sexta élevées sous AD avec un millimètre de CBD ont consommé au moins 3,1 fois plus de régime alimentaire que celles élevées avec un régime à l’éthanol ajouté.Cependant, la consommation alimentaire des insectes élevés sur deux milieux millimolaires ajoutés au CBD n’était pas significativement différente de celle des larves élevées avec des régimes à base d’éthanol uniquement. L’indice mobile de la larve de M.sexta élevée dans différentes conditions montre que 1% d’éthanol et une larve millimolaire traitée au CBD n’ont pas affecté la mobilité. Les traitements à l’éthanol à 2% se sont avérés mortels.L’ajout d’une forte dose de CBD dans la MA contenant 2% d’éthanol a restauré une faible mobilité. Une fois que le CBD est ajouté aux régimes, homogénéisez complètement le mélange de CBD diététique et cultivez des insectes dans la chambre d’élevage d’insectes maintenue à 25 degrés Celsius avec 40 à 60% d’humidité pour éviter une épidémie fongique. Les réponses électrophysiologiques peuvent également être surveillées avec les ganglions de la chaîne ventrale disséqués de Manduca sexta pour déterminer si le CBD affecte le système nerveux central du ver du tabac.Le système de modèle d’insectes permettra aux chercheurs d’explorer les rôles pharmaceutiques d’autres cannabinoïdes majeurs et mineurs en effectuant des tests sur plusieurs générations, ce qui permettra une conception expérimentale chez les mammifères supérieurs.

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