Name: tobacco hornworm as an insect model system for cannabinoid pre-clinical studies
Uploaded: 2021-12-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies at JoVE.com

Diese Forschung wurde vom Institut für Cannabisforschung an der Colorado State University-Pueblo und dem Ministerium für Wissenschaft und IKT (2021-DD-UP-0379) sowie der Stadt Chuncheon (Hanfforschung und -entwicklung und Industrialisierung, 2020-2021) unterstützt.

1. Hornwurmpräparation und Cannabidiol-Behandlung
<ol><li>Erhalten Sie 150-200 lebensfähige M. Sexta-Eier und weizenkeimbasierte künstliche Diäten (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Legen Sie die Hornwurmeier in eine Polystyrol-Petrischale mit einer weizenkeimbasierten künstlichen Diätschicht (AD) und übertragen Sie die Eier in eine Insektenaufzuchtkammer (siehe Materialtabelle), die bei 25 ° C mit 40% -60% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten ...

<ol>
	<li>Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+attenuates+seizures+and+social+deficits+in+a+mouse+model+of+Dravet+syndrome.">Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).</li><li>Leehey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+of+cannabidiol+in+Parkinson+Disease:+An+open+label,+dose-escalation+study.">Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).</li><li>Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+cannabinoids,+delta+9-+tetrahydrocannabinol+and+cannabidiol,+ameliorates+experimental+multiple+sclerosis+by+suppressing+neuroinflammation+through+regulation+of+miRNA-mediated+signaling+pathways.">Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).</li><li>Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBD+activation+of+TRPV1+induces+oxidative+signaling+and+subsequent+ER+stress+in+breast+cancer+cell+lines.">CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).</li><li>Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+and+sertraline+regulate+behavioral+and+brain+gene+expression+alterations+in+an+animal+model+of+PTSD.">Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).</li><li>Aso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol-enriched+extract+reduced+the+cognitive+impairment+but+not+the+epileptic+seizures+in+a+Lafora+disease+animal+model.">Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).</li><li>Kadam, R. 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H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+antiseizure+efficacy+of+cannabidiol+and+clonazepam+in+a+conditional+mouse+model+of+Dravet+syndrome.">Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome.</a> Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).</li><li>Orvos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrophysiological+effect+of+cannabidiol+on+hERG+current+and+in+guinea-pig+and+rabbit+cardiac+preparations.">The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).</li><li>Verrico, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study+of+daily+cannabidiol+for+the+treatment+of+canine+osteoarthritis.">A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis.</a> Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).</li><li>Barata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+cannabidiol+and+hypothermia+in+a+piglet+model+of+newborn+hypoxic-ischemic+brain+damage.">Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage.</a> Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).</li><li>Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. 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J., Dhillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+mouse+to+model+human+disease:+increasing+validity+and+reproducibility.">Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).</li><li>Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Models for Biomedical Research. , 61-72 (1989).</li><li>He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+roles+of+cannabidiol+as+an+insecticide+and+rescuing+agent+for+ethanol-induced+death+in+the+tobacco+hornworm+Manduca+sexta.">Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).</li><li>Tukey, J. 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Die Fütterungsstudie zeigte, dass hohe Dosen von CBD (2 mM) das Wachstum des Insekts hemmten und die Mortalität erhöhten31. Das Insektenmodell zeigte auch eine Empfindlichkeit gegenüber Ethanol; CBD entgiftete jedoch effektiv die Ethanoltoxizität und erhöhte ihre Überlebensrate, ihren Nahrungskonsum und ihr Lebensmittelsuchverhalten auf ein ähnliches Niveau wie die Kontrollgruppe (Abbildung 3A,B)31. Das beschriebene Ins...

In den letzten Jahren konzentrierte sich die öffentliche Aufmerksamkeit auf Cannabinoide aufgrund ihres therapeutischen Potenzials, einschließlich der Behandlung von Epilepsie1, Parkinson-Krankheit2, Multipler Sklerose3 und verschiedenen Krebsarten4,5,6 mit Cannabidiol (CBD). Seit Cannabis im Agricultural Improvement Act von 2018, Public Law 115-334 (farm bill 2018), als landwirtschaftliche Ware legalisiert ist, haben Cannabis und seine Cannabinoid-Derivate in der Lebensmittel-, Kosmetik- und Pharmaindustrie exponentiell zugenommen. Darüber hinaus wurden Isolate einzelner Cannabinoide und Cannabinoidmischungen in klinischer Qualität erfolgreich an menschlichen Probanden7, Zelllinien5,8 und verschiedenen Tiermodellsystemen getestet9,10.
Eine klinische Studie wäre ideal, um die Wirksamkeit und die Nebenwirkungen von Cannabinoiden auf eine bestimmte Krankheit zu validieren. Es gibt jedoch zahlreiche Herausforderungen in klinischen Studien, einschließlich ethischer/IRB-Zulassung, Rekrutierung und Bindung der Probanden11. Um diese Hürden zu überwinden, wurden verschiedene menschliche Zelllinien verwendet, da vom Menschen stammende Zelllinien kostengünstig und einfach zu handhaben sind, die ethischen Probleme umgehen können und konsistente und reproduzierbare Ergebnisse liefern, da die Zelllinien eine "reine Population von Zellen sind, die keine Kreuzkontamination anderer Zellen und Chemikalien aufweisen"12.
Alves et al. (2021)13 testeten CBD dosisabhängig in den Plazenta-Trophoblasten, spezialisierten Zellen der Plazenta, die eine wesentliche Rolle bei der Embryonenimplantation und interaktion mit der dezidualisierten mütterlichen Gebärmutter spielen14. Ihre Ergebnisse zeigten, dass CBD den Verlust der Zelllebensfähigkeit, die Störung der Zellzyklusprogression und die Apoptose-Induktion verursachte. Diese Beobachtungen zeigen die potenziellen negativen Auswirkungen des Cannabiskonsums durch schwangere Frauen13. Ebenso wurde eine Reihe von Zelllinien verwendet, um die pharmakologischen Wirkungen von CBD bei menschlichen Krankheiten, insbesondere verschiedenen Krebsarten, zu untersuchen. Die In-vitro-Studien zeigten erfolgreich krebshemmende Wirkungen in Bauchspeicheldrüsen-15-, Brust-8- und Darmkrebszellen16. Spezifische Zelllinien wie HeLa, HEK293 sind zwar weit verbreitet und einfach zu handhaben, aber anfällig für genetische und phänotypische Veränderungen aufgrund von Veränderungen ihrer Wachstumsbedingungen oder handhabung17.
In der Cannabisforschung wurden verschiedene Tiermodellsysteme, von Kleintieren wie Maus18, Meerschweinchen19 und Kaninchen19 bis hin zu großen Tieren wie Canine20, Ferkel21, Affe22, Pferd23, verwendet, um unbekannte therapeutische Wirkungen zu erforschen. Mäuse waren aufgrund ihrer anatomischen, physiologischen und genetischen Ähnlichkeit mit dem Menschen das am meisten bevorzugte Tiermodellsystem für die Cannabinoidforschung24. Am wichtigsten ist, dass Mäuse CB1/2-Rezeptoren in ihrem Nervensystem haben, die beim Menschen vorhanden sind. Sie haben auch einen kürzeren Lebenszyklus als menschliche Probanden, mit einfacherer Wartung und reichlich vorhandenen genetischen Ressourcen, wodurch es viel einfacher wird, die Auswirkungen von Cannabinoiden während eines gesamten Lebenszyklus zu überwachen. Das Säugetiersystem ist weit verbreitet und hat erfolgreich gezeigt, dass CBD Anfallsleiden1, posttraumatische Belastungsstörungen9, orale Geschwüre25 und demenzähnliche Symptome10 lindert. Das Mausmodell hat auch eine Studie zur sozialen Interaktion von Individuen innerhalb einer Gemeinschaft ermöglicht, die bei großen Tieren und Menschen äußerst schwierig ist26.
Trotz aller Vorteile des Tiermodellsystems ist es immer noch kostspielig und erfordert intensive Pflege bei der Verabreichung von Medikamenten und der Datenerhebung. Darüber hinaus wird die Verwendung von Mäusen in der Forschung aufgrund von Unreproduzierbarkeit und schlechter Rekapitulation menschlicher Bedingungen aufgrund von Einschränkungen im experimentellen Design und in der Strenge untersucht27.
Mit der steigenden Nachfrage nach medizinischen/präklinischen Studien zu Cannabinoiden wird ein Modellsystem für Nicht-Säugetiere benötigt. Wirbellose Modelle boten traditionell deutliche Vorteile gegenüber Wirbeltiermodellen. Zu den wesentlichen Vorteilen gehören die einfache und niedrige Kosten der Aufzucht vieler Exemplare und die Möglichkeit für Forscher, mehrere Generationen genetisch homogener Populationen zu überwachen28. Eine kürzlich durchgeführte Studie bewies, dass die Fruchtfliege , Drosophila melanogaster, ein wirksames Insektenmodellsystem ist, um pharmakologische Funktionen von Cannabinoiden bei der Modulation des Fressverhaltens zu untersuchen29. Unter den Insektenmodellsystemen konzentrierten sich die Autoren auf den Tabakhornwurm Manduca sexta, auch bekannt als Carolina-Sphinxmotte oder Falkenmotte, als neuartiges Insektenmodellsystem für die Cannabinoidforschung.
Manduca sexta gehört zur Familie der Schwärmer (Sphingidae). Das Insekt ist der häufigste Pflanzenschädling im Süden der Vereinigten Staaten, wo sie sich von Nachtschattengewächsen ernähren. Das Insektenmodell hat eine lange Geschichte in der Forschung in der Insektenphysiologie, Biochemie, Neurobiologie und Arzneimittelwechselwirkungsstudien. Das Forschungsportfolio von Manduca sexta umfasst einen Entwurf der Genomsequenz, der ein Verständnis wesentlicher zellulärer Prozesse auf molekularer Ebene ermöglicht30. Ein weiterer entscheidender Vorteil dieses Modellsystems ist seine Größe, die in den 18-25 Tagen der Larvenentwicklung mehr als 100 mm Länge und 10 g Gewicht erreicht. Die große Größe ermöglicht es den Forschern, morphologische und Verhaltensänderungen in Echtzeit als Reaktion auf die CBD-Behandlung einfach zu überwachen. Aufgrund der Größe wurden auch elektrophysiologische Reaktionen mit dem abdominalen Nervensystem untersucht, einschließlich Ganglien, die von den Larven ohne hochauflösende Mikroskopeinstellungen seziert wurden. Die einzigartige Funktion ermöglicht es den Forschern, akute und langfristige Reaktionen auf die verabreichten Cannabinoide leicht zu untersuchen.
Trotz dieser Vielseitigkeit wurde M. sexta erst vor kurzem auf seine Eignung als experimentelles Modell für Cannabis- und Cannabinoidstudien untersucht. Im Jahr 2019 verwendeten die Autoren das Insektenmodellsystem zum ersten Mal, um die Hypothese zu behandeln, dass Cannabis sich entwickelt hat, um Cannabidiol zu produzieren, um sich vor Insektenfressern zu schützen30,31. Das Ergebnis zeigte deutlich, dass die Pflanzen CBD als Nahrungsabschreckung nutzten und das Wachstum des Schädlingsinsekts M. sexta raupe hemmten sowie eine erhöhte Mortalität verursachten31. Die Studie zeigte auch die rettende Wirkung von CBD auf berauschte Ethanollarven und identifizierte den potenziellen Vehikeleffekt von Ethanol als Träger des CBD. Wie gezeigt, untersuchte das Insektenmodellsystem effektiv die therapeutischen Wirkungen von Cannabinoiden innerhalb von 3-4 Wochen mit weniger Arbeit und Kosten als andere Tiersysteme. Obwohl dem Insektenmodell Cannabinoidrezeptoren fehlen (d.h. keine CB1/2-Rezeptoren), bietet das Modellsystem ein wertvolles Werkzeug, um die pharmakologischen Rollen von Cannabinoiden auf cannabinoidrezeptorunabhängige Weise zu verstehen.
Die Autoren dieser Studie haben zuvor mit dem Tabakhornwurm als Modellsystem für die Cannabinoidforschung gearbeitet31. Nach sorgfältiger Abwägung der Vorteile und Risiken der Anwendung von M. sexta haben wir eine Methode zur Verfügung gestellt, die die richtige Pflege und Vorbereitung der Ernährung für präklinische Studien beinhaltet und Möglichkeiten für den zukünftigen präklinischen Laboreinsatz bietet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analytic balance</td>
			<td>Mettler Instrument Corp.</td>
			<td>AE100S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannabidiol isolate (&#62;99.4%)</td>
			<td>Lilu&#39;s Garden</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL</td>
			<td>470150-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89093-192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, 200 Proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fear conditioning chamber</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect rearing chamber</td>
			<td>Darwin Chambers</td>
			<td>INR034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium chain triglycerides (MCT) oil</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion detection software (Actimetrics)</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco hormworm artificial diet</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>Item # 143908</td>
			<td>Ready-To-Use-Hornworm-Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco hormworm eggs</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>Item # 143880</td>
			<td>Unit of 30-50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tobacco hornworm as an insect model system for cannabinoid pre-clinical studies

Mit zunehmender Aufmerksamkeit für Cannabinoide in der Medizin wurden mehrere Modellorganismen von Säugetieren verwendet, um ihre unbekannten pharmazeutischen Funktionen aufzuklären. In der Säugetierforschung bleiben jedoch viele Schwierigkeiten bestehen, die die Entwicklung von Nicht-Säugetier-Modellorganismen für die Cannabinoidforschung erfordern. Die Autoren schlagen den Tabakhornwurm Manduca sexta als neuartiges Insektenmodellsystem vor. Dieses Protokoll enthält Informationen zur Vorbereitung der künstlichen Diät mit unterschiedlichen Mengen an Cannabidiol (CBD), zur Einrichtung einer Anbauumgebung und zur Überwachung ihrer physiologischen und Verhaltensänderungen als Reaktion auf die CBD-Behandlung. Kurz gesagt, nach Erhalt der Hornwurmeier durften die Eier 1-3 Tage bei 25 ° C in einem 12:12-Hell-Dunkel-Zyklus schlüpfen, bevor sie zufällig in die Kontrolle verteilt wurden (Weizenkeim-basierte künstliche Diät; AD), Vehikel (AD + 0,1% mittelkettiges Triglyceridöl; MCT-Öl) und Behandlungsgruppen (AD + 0,1% MCT + 1 mM oder 2 mM CBD). Sobald das Medium vorbereitet war, wurden die Larven des 1. Stadiums einzeln mit einem Holzspieß in ein 50-ml-Reagenzglas gegeben, und dann wurde das Reagenzglas mit einem Käsetuch bedeckt. Die Messungen wurden in 2-Tage-Intervallen für physiologische und Verhaltensreaktionen auf die CBD-Verabreichung durchgeführt. Dieses einfache Kultivierungsverfahren ermöglicht es den Forschern, große Proben in einem bestimmten Experiment zu testen. Darüber hinaus ermöglichen die relativ kurzen Lebenszyklen den Forschern, die Auswirkungen von Cannabinoidbehandlungen über mehrere Generationen einer homogenen Population zu untersuchen, so dass Daten ein experimentelles Design in höheren Säugetiermodellorganismen unterstützen können.

Manduca sexta als Modellsystem zur Untersuchung der Toxizität von Cannabinoiden Abbildung 1 zeigt die Schlüsselkomponenten des CBD-Experiments mit dem Tabakhornwurm Manduca sexta. Eine große Anzahl von Insekten (>20) wurde einzeln bei 25 °C auf einem 12 h:12 h = Hell:Dunkel-Zyklus aufgezogen. Die Größe, das Gewicht und die Mortalität der Insekten wurden in 2-Tage-Intervallen gemessen, um kurz- und langfristige Reaktionen nach eine...

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Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies

Das vorliegende Protokoll enthält Anleitungsinformationen für die Verwendung des Tabakhornwurms Manduca sexta in der Cannabinoidforschung. Die hier beschriebene Methode umfasst alle notwendigen Vorräte und Protokolle zur Überwachung physiologischer und Verhaltensänderungen des Insektenmodells als Reaktion auf die Behandlung mit Cannabidiol (CBD).

Tabakhornwurm als Insektenmodellsystem für präklinische Cannabinoid-Studien

With increased attention on cannabinoids in medicine, several mammalian model organisms have been used to elucidate their unknown pharmaceutical ...

Das Protokoll schlägt vor, Tabakhornwurm als Insektenmodellsystem für präklinische Cannabinoidstudien zu verwenden. Dieses System ermöglicht es Forschern, akute und langfristige Reaktionen auf Cannabinoide leicht zu untersuchen. Das Insektenmodellsystem ermöglicht es Forschern, die therapeutischen Wirkungen von Cannabinoiden in einer großen Population innerhalb von drei bis vier Wochen mit weniger Arbeit und Kosten als andere Tiersysteme zu untersuchen.Erhalten Sie 150 bis 200 lebensfähige M.sexta-Eier und weizenkeimbasierte künstliche Diäten. Legen Sie die Hornwurmeier in eine Polystyrol-Petrischale mit einer künstlichen Futterschicht auf Weizenkeimbasis und übertragen Sie die Eier in eine Insektenaufzuchtkammer, die bei 25 Grad Celsius mit 40 bis 60% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten wird. Lassen Sie die Eier ein bis drei Tage in der Insektenzuchtkammer schlüpfen.Um eine 200 Millimolar Cannabidiol-Stammlösung herzustellen, fügen Sie 1,26 Gramm Cannabidiolisolat mit mehr als 98% Reinheit in 20 Milliliter Ethanol oder 100% mittelkettigem Triglyceridöl hinzu. Fügen Sie fünf Milliliter und 10 Milliliter der 200 Millimolar Cannabidiol-Stammlösung zu den 1.000 Gramm einer künstlichen Diät für einen Millimolar bzw. zwei Millimolar Cannabidiol hinzu. Geben Sie 20 Gramm Kontrollfahrzeug und cannabidiolhaltige Medien auf den Boden des 50-Milliliter-Röhrchens.Nach dem Zufallsprinzip etwa zwei Millimeter lange Larven im ersten Stadium einzeln in einem 50-Milliliter-Reagenzglas verteilen und mit einem perforierten Deckel oder Käsetuch abdecken. Züchten Sie sie in einer Insektenaufzuchtkammer, die bei 25 Grad Celsius mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus gehalten wird. Um das Larvenwachstum zu messen, zeichnen Sie die Anfangsmasse und -größe jeder Gruppe mit einer Analysenwaage bzw. einem Lineal auf und führen Sie die Larven in ihre jeweilige Ernährung ein.Subtrahieren Sie die Masse der Larven bei jeder Messung in zweitägigen Intervallen von der Anfangsmasse, um die Massenzuwächse zwischen den Entwicklungsstadien der Larven zu bestimmen. Notieren Sie auch die Anzahl der Tage zwischen den Entwicklungsstadien des Stadiums, um Unterschiede im Entwicklungszeitraum bis zur Verpuppung zu verstehen. Um den Nahrungsverbrauch zu messen, notieren Sie die ersten Gramm Diät zu Beginn des Experiments und ziehen Sie sie von der verbleibenden Futtermenge ab, wenn die Larven in das vollständige Verpuppungsstadium eingetreten sind.Lassen Sie das betroffene Insekt für die Larvenmobilität mindestens fünf Minuten lang an die Angstkonditionierungskammer gewöhnen und verfolgen Sie die Entfernungen, die die drei Gruppen der Insekten des fünften Stadiums fünf Minuten lang zurückgelegt haben. Führen Sie dann die Bewegungserkennungssoftware aus, um die Mobilitätsreaktion zu analysieren. Die künstlich gezüchteten Insekten zeigten die beste Wachstumsleistung.Die Vehikelkontrolle, die 0,1% mittelkettiges Triglyceridöl als Lösemittel für CBD-Isolat verwendete, zeigte ebenfalls ein normales Wachstum ohne schädliche Auswirkungen. Eine hohe CBD-Dosis von zwei Millimetern induzierte jedoch einen Gewichtsverlust und führte zu einer höheren Sterblichkeitsrate als Kontroll- und Fahrzeuggruppen. M.sexta-Larven, die auf AD mit einem Millimeter CBD aufgezogen wurden, verzehrten mindestens 3,1-mal mehr Nahrung als diejenigen, die mit ethanolzugesetzter Diät aufgezogen wurden.Der Nahrungskonsum der Insekten, die auf zwei millimolaren CBD-zugesetzten Medien aufgezogen wurden, unterschied sich jedoch nicht signifikant von den Larven, die auf reinen Ethanol-Diäten aufgezogen wurden. Der mobile Index der M.sexta-Larve, die unter verschiedenen Bedingungen aufgezogen wurde, zeigt, dass 1% Ethanol und eine millimolare CBD-behandelte Larve die Mobilität nicht beeinträchtigten. Die 2% Ethanol-Behandlungen erwiesen sich als tödlich.Die Zugabe einer hohen Dosis CBD in AD mit 2% Ethanol stellte die geringe Mobilität wieder her. Sobald CBD zu Diäten hinzugefügt wurde, homogenisieren Sie die Diät-CBD-Mischung vollständig und züchten Insekten in der Insektenaufzuchtkammer, die bei 25 Grad Celsius mit 40 bis 60% Luftfeuchtigkeit gehalten wird, um einen Pilzausbruch zu vermeiden. Elektrophysiologische Reaktionen können auch mit den ventralen Kettenganglien überwacht werden, die von Manduca sexta seziert werden, um festzustellen, ob CBD das zentrale Nervensystem des Tabakhornwurms beeinflusst.Das Insektenmodellsystem wird es den Forschern ermöglichen, die pharmazeutische Rolle anderer wichtiger und kleinerer Cannabinoide zu erforschen, indem sie über mehrere Generationen getestet werden, was ein experimentelles Design bei höheren Säugetieren ermöglicht.

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