Name: tobacco hornworm as an insect model system for cannabinoid pre-clinical studies
Uploaded: 2021-12-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי המכון לחקר הקנאביס באוניברסיטת קולורדו סטייט-פואבלו ומשרד המדע וה- ICT (2021-DD-UP-0379), ועיר צ'ונצ'און (קנבוס מו"פ ותיעוש, 2020-2021).

1. הכנת תולעי קרן וטיפול בקנבידיול
<ol><li>להשיג 150-200 M קיימא. ביצי סקסטה ודיאטות מלאכותיות המבוססות על נבט חיטה (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>מניחים את ביצי תולעי הקרן בצלחת פטרי פוליסטירן עם שכבת תזונה מלאכותית המבוססת על נבט חיטה (AD) ומעבירים את הביצים לתא גידול חר?...

<ol>
	<li>Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+attenuates+seizures+and+social+deficits+in+a+mouse+model+of+Dravet+syndrome.">Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).</li><li>Leehey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+of+cannabidiol+in+Parkinson+Disease:+An+open+label,+dose-escalation+study.">Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).</li><li>Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+cannabinoids,+delta+9-+tetrahydrocannabinol+and+cannabidiol,+ameliorates+experimental+multiple+sclerosis+by+suppressing+neuroinflammation+through+regulation+of+miRNA-mediated+signaling+pathways.">Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).</li><li>Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+(CBD)+as+a+promising+anti-cancer+drug.">Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug.</a> Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).</li><li>Garcia-Morales, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBD+reverts+the+mesenchymal+invasive+phenotype+of+breast+cancer+cells+induced+by+the+inflammatory+cytokine+IL-1beta).">CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta).</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).</li><li>Jeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+promotes+apoptosis+via+regulation+of+XIAP/Smac+in+gastric+cancer.">Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer.</a> Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).</li><li>Devinsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-label+use+of+highly+purified+CBD+(Epidiolex&#174;)+in+patients+with+CDKL5+deficiency+disorder+and+Aicardi,+Dup15q,+and+Doose+syndromes.">Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex&#174;) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes.</a> Epilepsy &amp; Behavior. 86, 131-137 (2018).</li><li>de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBD+activation+of+TRPV1+induces+oxidative+signaling+and+subsequent+ER+stress+in+breast+cancer+cell+lines.">CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).</li><li>Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+and+sertraline+regulate+behavioral+and+brain+gene+expression+alterations+in+an+animal+model+of+PTSD.">Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).</li><li>Aso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol-enriched+extract+reduced+the+cognitive+impairment+but+not+the+epileptic+seizures+in+a+Lafora+disease+animal+model.">Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).</li><li>Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+recruitment+and+retention+of+clinical+trial+subjects.">Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects.</a> Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+disrupts+apoptosis,+autophagy+and+invasion+processes+of+placental+trophoblasts.">Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>. Trophoblast Available from: <a target="_blank" href="https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast">https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast</a> (2021)</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+inhibited+pancreatic+cancer+via+P-21+activated+kinase+1+mediated+pathway.">Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).</li><li>Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol-induced+apoptosis+is+mediated+by+activation+of+Noxa+in+human+colorectal+cancer+cells.">Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells.</a> Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).</li><li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+as+biological+models:+Practical+steps+for+more+reliable+research.">Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).</li><li>Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+antiseizure+efficacy+of+cannabidiol+and+clonazepam+in+a+conditional+mouse+model+of+Dravet+syndrome.">Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome.</a> Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).</li><li>Orvos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrophysiological+effect+of+cannabidiol+on+hERG+current+and+in+guinea-pig+and+rabbit+cardiac+preparations.">The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).</li><li>Verrico, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study+of+daily+cannabidiol+for+the+treatment+of+canine+osteoarthritis.">A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis.</a> Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).</li><li>Barata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+cannabidiol+and+hypothermia+in+a+piglet+model+of+newborn+hypoxic-ischemic+brain+damage.">Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage.</a> Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).</li><li>Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+agonistic+activity+of+delta+9-11-tetrahydrocannabinol+in+mice,+dogs+and+rhesus+monkeys+and+its+interactions+with+delta+9-tetrahydrocannabinol.">Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).</li><li>Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+effects+on+arachidonic+acid+metabolism+of+low+doses+of+cannabidiol+following+oral+administration+to+horses.">Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses.</a> Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).</li><li>Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mighty+Mouse:+The+impact+of+rodents+on+advances+in+biomedical+research.">The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBD+promotes+oral+ulcer+healing+via+inhibiting+CMPK2-mediated+inflammasome.">CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome.</a> Journal of Dental Research. , (2021).</li><li>Mastinu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prosocial+effects+of+nonpsychotropic+Cannabis+sativa+in+mice.">Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).</li><li>Justice, M. J., Dhillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+mouse+to+model+human+disease:+increasing+validity+and+reproducibility.">Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).</li><li>Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Models for Biomedical Research. , 61-72 (1989).</li><li>He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+modulate+food+preference+and+consumption+in+Drosophila+melanogaster.">Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).</li><li>Kanost, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+biological+insights+from+a+draft+genome+sequence+of+the+tobacco+hornworm+moth,+Manduca+sexta.">Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+roles+of+cannabidiol+as+an+insecticide+and+rescuing+agent+for+ethanol-induced+death+in+the+tobacco+hornworm+Manduca+sexta.">Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).</li><li>Tukey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Mantel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+survival+data+and+two+new+rank+order+statistics+arising+in+its+consideration.">Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration.</a> Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).</li><li>Watts, S., Kariyat, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picking+sides:+Feeding+on+the+abaxial+leaf+surface+is+costly+for+caterpillars.">Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars.</a> Planta. 253 (4), 77 (2021).</li><li>McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+receptors+in+invertebrates.">Cannabinoid receptors in invertebrates.</a> Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).</li></ol>

מחקר ההאכלה הראה כי מינונים גבוהים של CBD (2 מ"מ) עיכבו את צמיחת החרק והגדילו את התמותה31. מודל החרקים הראה גם רגישות לאתנול; עם זאת, CBD למעשה detoxicated רעילות האתנול, הגדלת שיעור ההישרדות שלהם, צריכת דיאטה, והתנהגויות חיפוש מזון לרמות דומות לקבוצת הביקורת (איור 3A,B</...

במהלך השנים האחרונות, תשומת הלב הציבורית התמקדה קנבינואידים בשל הפוטנציאל הטיפולי שלהם, כולל טיפול באפילפסיה1, מחלת פרקינסון2, טרשת נפוצה3, וצורות שונות של סרטן4,5,6 עם קנבידיול (CBD). מכיוון שקנאביס הופך לחוקי כסחורה חקלאית בחוק השיפור החקלאי של 2018, החוק הציבורי 115-334 (חוק החוות לשנת 2018), הקנאביס ונגזרותיו הקנבינואידיות בתעשיות המזון, הקוסמטיקה והתרופות גדלו באופן אקספוננציאלי. בנוסף, מבודדים קליניים של קנבינואידים בודדים ותערובות קנבינואידים נבדקו בהצלחה בנבדקים אנושיים7, קווי תאים5,8, ומערכות מודל בעלי חיים מגוונות9,10.
ניסוי קליני יהיה אידיאלי לאימות היעילות וההשפעות השליליות של קנבינואידים על מחלה ספציפית. עם זאת, ישנם אתגרים רבים בניסויים קליניים, כולל אישור אתי/ IRB, גיוס ושימור הנבדקים11. כדי להתגבר על משוכות אלה, נעשה שימוש בקווי תאים אנושיים שונים מכיוון שקווי תאים שמקורם בבני אדם הם חסכוניים, קלים לטיפול, יכולים לעקוף את הבעיות האתיות, ולספק תוצאות עקביות וניתנות לשחזור מכיוון שקווי התאים הם 'אוכלוסייה טהורה של תאים שאין להם זיהום צולב של תאים וכימיקלים אחרים'12.
Alves et al. (2021)13 נבדק CBD באופן תלוי במינון ב trophoblasts השליה, שהם תאים מיוחדים של השליה הממלאים תפקיד חיוני השתלת עובר ואינטראקציה עם הרחם האימהי החליט14. התוצאות שלהם הראו כי CBD גרם לאובדן הכדאיות התא, הפרעה בהתקדמות מחזור התא, אינדוקציה אפופטוזיס. תצפיות אלה ממחישות את ההשפעות השליליות הפוטנציאליות של שימוש בקנביס על ידי נשים בהריון13. כמו כן, סדרה של קווי תאים שימשו גם כדי לבחון את ההשפעות הפרמקולוגיות של CBD במחלות אנושיות, בפרט, צורות שונות של סרטן. מחקרי הפריה חוץ גופית הדגימו בהצלחה השפעות אנטי סרטניות בתאי סרטן הלבלב15, השד8 וסרטן המעי הגס16. עם זאת, בעוד להיות זמין נרחב וקל לטפל, קווי תאים ספציפיים כגון HeLa, HEK293 נוטים לשינויים גנטיים פנוטיפיים עקב שינויים בתנאי הצמיחה שלהם או טיפול17.
במחקר קנאביס, מערכות מודל בעלי חיים שונות, החל בעלי חיים קטנים כגון עכבר18, שפן ניסיונות19, ארנב19 כדי בעלי חיים גדולים כגון כלב20, חזירון21, monkey22, horse23, שימשו כדי לחקור השפעות טיפוליות לא ידועות. עכברים היו מערכת מודל בעלי החיים המועדפת ביותר לחקר קנבינואידים בשל הדמיון האנטומי, הפיזיולוגי והגנטי שלהם לבני אדם24. והכי חשוב, לעכברים יש קולטני CB1/2 במערכת העצבים שלהם, שנמצאים בבני אדם. יש להם גם מחזור חיים קצר יותר מאשר נבדקים אנושיים, עם תחזוקה קלה יותר ומשאבים גנטיים בשפע, ובכך להקל בהרבה על ניטור ההשפעות של קנבינואידים לאורך מחזור חיים שלם. מערכת היונקים נמצאת בשימוש נרחב והוכיחה בהצלחה כי CBD מקל על הפרעות פרכוסים1, הפרעת דחק פוסט טראומטית9, כיבים אוראליים25, ותסמינים דמויי דמנציה10. מודל העכבר אפשר גם מחקר אינטראקציה חברתית של אנשים בתוך קהילה אשר קשה מאוד בבעלי חיים גדולים ובני אדם26.
למרות כל היתרונות של מערכת מודל בעלי חיים, זה עדיין יקר ודורש טיפול נמרץ במהלך מתן תרופות ואיסוף נתונים. בנוסף, יש בדיקה של שימוש בעכברים במחקר בגלל חוסר הדדיות ו recapitulation לקוי של התנאים האנושיים בשל מגבלות בתכנון ניסיוני והקפדה27.
עם הביקוש הגובר למחקרים רפואיים/פרה-קליניים של קנבינואידים, יש צורך במערכת מודלים שאינם יונקים. מודלים חסרי חוליות העניקו באופן מסורתי יתרונות ייחודיים על פני מודלים בעלי חוליות. היתרונות המשמעותיים כוללים את הקלות והעלות הנמוכה של גידול דגימות רבות ומאפשר לחוקרים לעקוב אחר דורות רבים של אוכלוסיות הומוגניות גנטית28. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח את זבוב הפירות, Drosophila melanogaster, להיות מערכת מודל חרקים יעיל לחקור פונקציות פרמקולוגיות של קנבינואידים מווסת התנהגויות האכלה29. בין מערכות מודל החרקים, המחברים התמקדו בתולעת הטבק, Manduca sexta, הידועה גם בשם עש ספינקס קרולינה או עש נץ, כמערכת מודל חרקים חדשנית למחקר קנבינואידים.
סקסטה מנדוקה שייכת למשפחתו של ספינגידיי. החרק הוא מזיק הצמח הנפוץ ביותר בדרום ארצות הברית, שם הם ניזונים מצמחים סולניים. למודל החרקים היסטוריה ארוכה במחקרים בפיזיולוגיה של חרקים, ביוכימיה, נוירוביולוגיה ומחקרי אינטראקציה עם סמים. תיק המחקר של מנדוקה סקסטה כולל טיוטת רצף גנום, המאפשר הבנה ברמה המולקולרית של תהליכים תאיים חיוניים30. יתרון מכריע נוסף של מערכת מודל זו הוא גודלו הגדול, להגיע יותר מ 100 מ"מ אורך ו 10 גרם במשקל ב 18-25 ימים של התפתחות זחל. הגודל הגדול מאפשר לחוקרים לעקוב בקלות אחר שינויים מורפולוגיים והתנהגותיים בזמן אמת בתגובה לטיפול CBD. כמו כן, בשל הגודל, נבדקו תגובות אלקטרופיזיולוגיות עם מערכת העצבים בבטן, כולל גרעינים שנותחו מהזחלים ללא הגדרות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה. התכונה הייחודית מאפשרת לחוקרים לחקור בקלות תגובות חריפות וארוכות טווח לקנבינואידים המנוהלים.
למרות רב-תכליתיות כזו, M. sexta רק לאחרונה נחקרה על התאמתה כמודל ניסיוני למחקרי קנאביס וקנבינואידים. בשנת 2019, המחברים השתמשו לראשונה במערכת מודל החרקים כדי להתייחס להשערה כי קנאביס התפתח לייצר קנבידיול כדי להגן על עצמו מפני אוכלי עשב חרקים30,31. התוצאה הראתה בבירור כי הצמחים ניצלו CBD כגורם מרתיע האכלה ועיכבו את הצמיחה של חרק המזיקים M. sexta זחל, כמו גם גרימת תמותה מוגברת31. המחקר הדגים גם את ההשפעות המצילות של CBD לזחלי אתנול שיכורים, וזיהה את ההשפעה הפוטנציאלית של הרכב של אתנול כנשא של CBD. כפי שמוצג, מערכת מודל החרקים חקרה ביעילות את ההשפעות הטיפוליות של קנבינואידים בתוך 3-4 שבועות עם פחות עבודה ועלויות מאשר מערכות בעלי חיים אחרות. למרות מודל החרקים חסר קולטני קנבינואידים (כלומר, אין קולטני CB1/2), מערכת המודל מספקת כלי בעל ערך להבנת התפקידים הפרמקולוגיים של קנבינואידים באמצעות קולטן קנבינואידים באופן עצמאי.
מחברי המחקר הזה עבדו בעבר עם תולעת קרן הטבק כמערכת מודל למחקר קנבינואידים31. לאחר בחינה מדוקדקת של היתרונות והסיכונים של שימוש ב- M. sexta, סיפקנו שיטה המערבת טיפול נכון והכנה של דיאטה לניסויים פרה-קליניים המאפשרים הזדמנויות לשימוש עתידי במעבדה פרה-קלינית.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analytic balance</td>
			<td>Mettler Instrument Corp.</td>
			<td>AE100S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannabidiol isolate (&#62;99.4%)</td>
			<td>Lilu&#39;s Garden</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL</td>
			<td>470150-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89093-192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, 200 Proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fear conditioning chamber</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect rearing chamber</td>
			<td>Darwin Chambers</td>
			<td>INR034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium chain triglycerides (MCT) oil</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion detection software (Actimetrics)</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco hormworm artificial diet</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>Item # 143908</td>
			<td>Ready-To-Use-Hornworm-Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco hormworm eggs</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>Item # 143880</td>
			<td>Unit of 30-50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tobacco hornworm as an insect model system for cannabinoid pre-clinical studies

עם תשומת לב מוגברת על קנבינואידים ברפואה, מספר אורגניזמים מודל יונקים שימשו כדי להבהיר את תפקודי התרופות הלא ידועים שלהם. עם זאת, קשיים רבים נותרו במחקר היונקים, המחייב פיתוח של אורגניזמים מודל שאינם יונקים למחקר קנבינואידים. המחברים מציעים את תולעת הטבק מנדוקה סקסטה כמערכת מודל חרקים חדשנית. פרוטוקול זה מספק מידע על הכנת הדיאטה המלאכותית עם כמויות משתנות של קנבידיול (CBD), הקמת סביבת גידול, וניטור השינויים הפיזיולוגיים וההתנהגותיים שלהם בתגובה לטיפול CBD. בקצרה, עם קבלת ביצי תולעי קרן, הביצים הורשו 1-3 ימים ב 25 °C (65 °F) על מחזור 12:12 כהה בהיר לבקוע לפני שהופץ באופן אקראי לשליטה (תזונה מלאכותית המבוססת על נבט חיטה; AD), רכב (AD + 0.1% שמן טריגליצרידים בשרשרת בינונית; שמן MCT) וקבוצות טיפול (AD + 0.1% MCT + 1 מ"מM או 2 מ"מ של CBD). ברגע שהתקשורת הוכנה, זחלי הכוכב הראשון הונחו בנפרד במבחנה של 50 מ"ל עם מקל שיפוד מעץ, ואז המבחנה כוסתה במטלית גבינה. המדידות נלקחו במרווחי זמן של יומיים לתגובות פיזיולוגיות והתנהגותיות לממשל CBD. הליך טיפוח פשוט זה מאפשר לחוקרים לבחון דגימות גדולות בניסוי נתון. בנוסף, מחזורי החיים הקצרים יחסית מאפשרים לחוקרים לחקור את ההשפעה של טיפולי קנבינואידים על פני דורות רבים של אוכלוסייה הומוגנית, ומאפשרים לנתונים לתמוך בעיצוב ניסיוני באורגניזמים מודל יונקים גבוהים יותר.

מנדוקה סקסטה כמערכת מודל לבחינת רעילות קנבינואידים איור 1 מתאר את המרכיבים העיקריים בניסוי CBD באמצעות תולעת הטבק מנדוקה סקסטה. מספר גדול של חרקים (>20) גודלו בנפרד ב 25 °C (50 °F) על 12 שעות: 12 שעות = אור: מחזור כהה. גודל החרקים, משקלם ותמותתם נמדדו במרוו...

Watch this Scientific Journal Video about Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies at JoVE.com

Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies

הפרוטוקול הנוכחי מספק מידע הדרכה לשימוש בתולעת טבק מנדוקה סקסטה במחקר קנבינואידים. השיטה המתוארת כאן כוללת את כל האספקה והפרוטוקולים הדרושים לניטור שינויים פיזיולוגיים והתנהגותיים של מודל החרקים בתגובה לטיפול בקנבידיול (CBD).

קרן טבק כמערכת מודל חרקים למחקרים פרה-קליניים קנבינואידים

With increased attention on cannabinoids in medicine, several mammalian model organisms have been used to elucidate their unknown pharmaceutical ...

הפרוטוקול מציע להשתמש בתולעי קרן טבק כמערכת מודל חרקים למחקרים פרה-קליניים קנבינואידים. מערכת זו מאפשרת לחוקרים לחקור תגובות חריפות וארוכות טווח לקנבינואידים בקלות. מערכת מודל החרקים מאפשרת לחוקרים לחקור השפעות טיפוליות קנבינואידיות באוכלוסייה גדולה בתוך שלושה עד ארבעה שבועות עם פחות עבודה ועלויות מאשר מערכות אחרות של בעלי חיים.להשיג 150 עד 200 ביצי M.sexta קיימא ודיאטות מלאכותיות מבוססות נבט חיטה. מניחים את ביצי תולעי הקרן בצלחת פטרי פוליסטירן עם שכבת תזונה מלאכותית המבוססת על נבט חיטה ומעבירים את הביצים לתא גידול חרקים המתוחזק ב 25 מעלות צלזיוס עם לחות יחסית של 40 עד 60%. אפשר לביצים לבקוע במשך יום עד שלושה ימים בתוך תא גידול החרקים.כדי להכין פתרון מלאי קנבידיול 200 מילימולרי, להוסיף 1.26 גרם של יותר מ 98% טוהר קנבידיול לבודד ב 20 מיליליטר של אתנול או 100% שמן טריגליצרידים שרשרת בינונית. הוסף חמישה מיליליטר ו 10 מיליליטר של פתרון מלאי קנבידיול 200 מילימולר ל 1, 000 גרם של דיאטה מלאכותית עבור מילימולר אחד ושני מילימולרי של קנבידיול, בהתאמה. חלוקת 20 גרם של רכב בקרה ומדיה המכילה קנבידיול לתחתית צינור 50 מיליליטר.באופן אקראי להפיץ כשני מילימטר זחלי instar הראשון בנפרד במבחנה 50 מיליליטר לכסות עם מכסה מחורר או מטלית גבינה. לגדל אותם בתוך תא גידול חרקים מתוחזק ב 25 מעלות צלזיוס עם מחזור 12 שעות אור כהה. כדי למדוד את צמיחת הזחלים, רשום את המסה והגודל ההתחלתיים של כל קבוצה עם איזון אנליטי וסרגל, בהתאמה, והצג את הזחלים לתזונה שלהם.הפחת את המסה של הזחלים בכל מדידה במרווחי זמן של יומיים מהמסה הראשונית כדי לקבוע רווחי מסה בין שלבי התפתחות הזחלים. כמו כן, רשום את מספר הימים בין השלבים ההתפתחותיים של instar כדי להבין את ההבדלים במסגרת הזמן ההתפתחותית עד גור. כדי למדוד את צריכת הדיאטה, להקליט את הגרמים הראשוניים של דיאטה בתחילת הניסוי ולהפחית אותו מן הכמות הנותרת של דיאטה כאשר הזחלים נכנסו לשלב הגור המלא.למדידת ניידות הזחלים, אפשרו לחרק הנבדק להתאקלם בתא ההתניה של הפחד למשך חמש דקות לפחות ולעקוב אחר המרחקים ששלוש קבוצות החרקים החמישיים נסעו במשך חמש דקות. לאחר מכן, הפעל את התוכנה לזיהוי תנועה כדי לנתח את תגובת הניידות. החרקים שגדלו בתזונה מלאכותית הראו את ביצועי הצמיחה הטובים ביותר.בקרת הרכב שהשתמשה 0.1% שמן טריגליצרידים שרשרת בינונית כסוכן המסה עבור בידוד CBD גם הראה צמיחה נורמלית ללא כל השפעות מזיקות. עם זאת, מינון גבוה של CBD של ירידה במשקל מושרה שני מילימטרים והוביל לשיעור תמותה גבוה יותר מאשר קבוצות שליטה וכלי רכב. M.sexta זחלים גדלו על AD עם CBD מילימטר אחד נצרך לפחות 3.1 פעמים דיאטה גדולה יותר מאשר אלה גדלו על דיאטה הוסיף אתנול.עם זאת, צריכת הדיאטה של החרקים גדל על שני מילימולר CBD הוסיף מדיה לא היה שונה באופן משמעותי מן הזחלים גדל על דיאטות אתנול בלבד. המדד הנייד של M.sexta זחל גדל בתנאים שונים מראה כי 1% אתנול וזחל אחד מילימולרי CBD מטופלים לא השפיעו על הניידות. 2% טיפולי האתנול התבררו כקטלניים.הוספת מינון גבוה של CBD לתוך AD המכיל 2% אתנול משוחזר ניידות נמוכה. לאחר CBD מתווסף דיאטות, הומוגני לחלוטין את תערובת CBD דיאטה ולגדל חרקים בתא גידול חרקים נשמר ב 25 מעלות צלזיוס עם 40 עד 60% לחות כדי למנוע התפרצות פטרייתית. תגובות אלקטרופיזיולוגיות ניתן לפקח גם עם הגרעינים שרשרת הגחון ניתח ממנדוקה סקסטה כדי לקבוע אם CBD משפיע על מערכת העצבים המרכזית של תולעת הטבק.מערכת מודל החרקים תאפשר לחוקרים לחקור את התפקידים התרופתיים של קנבינואידים מרכזיים וקלים אחרים על ידי בדיקה לאורך דורות רבים, המאפשרת תכנון ניסיוני ביונקים גבוהים יותר.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

מחקרים גנטיים של חלבונים תיקון דנ&quot;א אנושי באמצעות שמרים כמודל למערכת

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

אפיון מנגנוני ההתנגדות אוכלי עשב: Spittlebugs על Brachiaria Spp. כדוגמה

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

הפקה וטיהור יעילה של רקומביננטי Murine Kindlin-3 מתאי חרקים לBiophysical לימודים

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים,<em&gt; אדס המפוספס</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

הדמית ארגון מחדש מרחבית של מסלול איתות MAPK שימוש במערכת הביטוי החולפת הטבק

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

הקמת מערכת התרבות pH חומצי חוץ-תאית

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

נסיוני באמצעות דרוזופילה כמערכת מודל הגעה לבדיקת רעילות במעבדה

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

הכנה והזרקה של עוברים של יתושי קולקס כדי ליצור מוטציות Null באמצעות CRISPR /Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...