Name: tobacco hornworm as an insect model system for cannabinoid pre-clinical studies
Uploaded: 2021-12-29T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Institute of Cannabis Research ved Colorado State University-Pueblo og Vitenskaps- og IKT-departementet (2021-DD-UP-0379) og Chuncheon city (Hemp R&D og industrialisering, 2020-2021).

1. Hornworm forberedelse og cannabidiol behandling
<ol><li>Oppnå 150-200 levedyktig M. sexta egg og hvete bakteriebaserte kunstige dietter (se Tabell over materialer).</li>
	<li>Legg hornormeggene i en polystyren Petri-tallerken med et hvetekimbasert kunstig kosthold (AD) lag og overfør eggene til et insektoppdrettskammer (se Materialbord) opprettholdt ved 25 °C med 40%-60% relativ fuktighet.</li>
	<li>La tobakk hornworm egg i 1-3 dager å klekke i...

<ol>
	<li>Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+attenuates+seizures+and+social+deficits+in+a+mouse+model+of+Dravet+syndrome.">Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).</li><li>Leehey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+of+cannabidiol+in+Parkinson+Disease:+An+open+label,+dose-escalation+study.">Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).</li><li>Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+cannabinoids,+delta+9-+tetrahydrocannabinol+and+cannabidiol,+ameliorates+experimental+multiple+sclerosis+by+suppressing+neuroinflammation+through+regulation+of+miRNA-mediated+signaling+pathways.">Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).</li><li>Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+(CBD)+as+a+promising+anti-cancer+drug.">Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug.</a> Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).</li><li>Garcia-Morales, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBD+reverts+the+mesenchymal+invasive+phenotype+of+breast+cancer+cells+induced+by+the+inflammatory+cytokine+IL-1beta).">CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta).</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).</li><li>Jeong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+promotes+apoptosis+via+regulation+of+XIAP/Smac+in+gastric+cancer.">Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer.</a> Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).</li><li>Devinsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open-label+use+of+highly+purified+CBD+(Epidiolex&#174;)+in+patients+with+CDKL5+deficiency+disorder+and+Aicardi,+Dup15q,+and+Doose+syndromes.">Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex&#174;) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes.</a> Epilepsy &amp; Behavior. 86, 131-137 (2018).</li><li>de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBD+activation+of+TRPV1+induces+oxidative+signaling+and+subsequent+ER+stress+in+breast+cancer+cell+lines.">CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).</li><li>Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+and+sertraline+regulate+behavioral+and+brain+gene+expression+alterations+in+an+animal+model+of+PTSD.">Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).</li><li>Aso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol-enriched+extract+reduced+the+cognitive+impairment+but+not+the+epileptic+seizures+in+a+Lafora+disease+animal+model.">Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).</li><li>Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+recruitment+and+retention+of+clinical+trial+subjects.">Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects.</a> Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+disrupts+apoptosis,+autophagy+and+invasion+processes+of+placental+trophoblasts.">Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts.</a> Archives of Toxicology. , (2021).</li><li>. Trophoblast Available from: <a target="_blank" href="https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast">https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast</a> (2021)</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+inhibited+pancreatic+cancer+via+P-21+activated+kinase+1+mediated+pathway.">Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).</li><li>Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol-induced+apoptosis+is+mediated+by+activation+of+Noxa+in+human+colorectal+cancer+cells.">Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells.</a> Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).</li><li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+as+biological+models:+Practical+steps+for+more+reliable+research.">Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).</li><li>Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+antiseizure+efficacy+of+cannabidiol+and+clonazepam+in+a+conditional+mouse+model+of+Dravet+syndrome.">Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome.</a> Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).</li><li>Orvos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrophysiological+effect+of+cannabidiol+on+hERG+current+and+in+guinea-pig+and+rabbit+cardiac+preparations.">The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).</li><li>Verrico, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study+of+daily+cannabidiol+for+the+treatment+of+canine+osteoarthritis.">A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis.</a> Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).</li><li>Barata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+cannabidiol+and+hypothermia+in+a+piglet+model+of+newborn+hypoxic-ischemic+brain+damage.">Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage.</a> Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).</li><li>Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+agonistic+activity+of+delta+9-11-tetrahydrocannabinol+in+mice,+dogs+and+rhesus+monkeys+and+its+interactions+with+delta+9-tetrahydrocannabinol.">Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).</li><li>Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacokinetics+and+effects+on+arachidonic+acid+metabolism+of+low+doses+of+cannabidiol+following+oral+administration+to+horses.">Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses.</a> Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).</li><li>Bryda, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mighty+Mouse:+The+impact+of+rodents+on+advances+in+biomedical+research.">The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research.</a> Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).</li><li>Qi, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBD+promotes+oral+ulcer+healing+via+inhibiting+CMPK2-mediated+inflammasome.">CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome.</a> Journal of Dental Research. , (2021).</li><li>Mastinu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prosocial+effects+of+nonpsychotropic+Cannabis+sativa+in+mice.">Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).</li><li>Justice, M. J., Dhillon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+mouse+to+model+human+disease:+increasing+validity+and+reproducibility.">Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).</li><li>Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Insect Models for Biomedical Research. , 61-72 (1989).</li><li>He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+modulate+food+preference+and+consumption+in+Drosophila+melanogaster.">Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster.</a> Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).</li><li>Kanost, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifaceted+biological+insights+from+a+draft+genome+sequence+of+the+tobacco+hornworm+moth,+Manduca+sexta.">Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).</li><li>Park, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+roles+of+cannabidiol+as+an+insecticide+and+rescuing+agent+for+ethanol-induced+death+in+the+tobacco+hornworm+Manduca+sexta.">Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).</li><li>Tukey, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Mantel, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+survival+data+and+two+new+rank+order+statistics+arising+in+its+consideration.">Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration.</a> Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).</li><li>Watts, S., Kariyat, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picking+sides:+Feeding+on+the+abaxial+leaf+surface+is+costly+for+caterpillars.">Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars.</a> Planta. 253 (4), 77 (2021).</li><li>McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+receptors+in+invertebrates.">Cannabinoid receptors in invertebrates.</a> Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).</li></ol>

Fôringsstudien viste at høye doser CBD (2 mM) hemmet insektets vekst og økt dødelighet31. Insektmodellen viste også følsomhet for etanol; CBD avgiftet imidlertid effektivt etanoltoksisiteten, og økte overlevelsesraten, diettforbruket og matsøkeatferden til lignende nivåer som kontrollgruppen (figur 3A, B)31. Det beskrevne insektmodellsystemet består av tre kritiske trinn: (1) sikre at M. sextas egg klekkes je...

I løpet av de siste årene har offentlig oppmerksomhet vært sentrert om cannabinoider på grunn av deres terapeutiske potensial, inkludert behandling av epilepsi1, Parkinsons sykdom2, multippel sklerose3 og ulike former for kreft4,5,6 med cannabidiol (CBD). Siden Cannabis er legalisert som en landbruksvare i landbruksforbedringsloven av 2018, har offentlig lov 115-334 (2018 Farm Bill), Cannabis og dens cannabinoidderivater i næringsmiddel-, kosmetikk- og farmasøytisk industri eksponentielt økt. I tillegg har kliniske isolasjoner av enkeltkannabinoider og cannabinoidblandinger blitt testet med hell hos mennesker7, cellelinjer5,8 og forskjellige dyremodellsystemer9,10.
En klinisk studie vil være ideell for validering av effekt og bivirkninger av cannabinoider på en bestemt sykdom. Det er imidlertid mange utfordringer i kliniske studier, inkludert etisk/IRB-godkjenning, rekruttering og oppbevaring av fagene11. For å overvinne disse hindringene ble ulike menneskelige cellelinjer brukt fordi menneskeavledede cellelinjer er kostnadseffektive, enkle å håndtere, kan omgå de etiske problemene og gi konsistente og reproduserbare resultater da cellelinjene er en 'ren populasjon av celler som ikke har krysskontaminering av andre celler og kjemikalier'12.
Alves et al. (2021)13 testet CBD på en doseavhengig måte i placental trophoblasts, som er spesialiserte celler i morkaken som spiller en viktig rolle i embryoimplantasjon og interaksjon med den decidualiserte mors livmor14. Resultatene deres viste at CBD forårsaket tap av celle levedyktighet, forstyrrelser i cellesyklusprogresjon og apoptoseinduksjon. Disse observasjonene viser de potensielle negative virkningene av cannabisbruk av gravide kvinner13. På samme måte ble en rekke cellelinjer også brukt til å undersøke de farmakologiske effektene av CBD i menneskelige sykdommer, spesielt ulike former for kreft. In vitro-studiene viste vellykket antikrefteffekter i bukspyttkjertelen15, bryst8 og kolorektal kreftceller16. Men mens de er allment tilgjengelige og enkle å håndtere, er spesifikke cellelinjer som HeLa, HEK293 utsatt for genetiske og fenotypiske endringer på grunn av endringer i vekstforholdene eller håndteringen17.
I cannabisforskning har ulike dyremodellsystemer, alt fra små dyr som mus18, marsvin19 og kanin19 til store dyr som hunde20, piglet21, monkey22, horse23, blitt brukt til å utforske ukjente terapeutiske effekter. Mus har vært det mest foretrukne dyremodellsystemet for cannabinoidforskning på grunn av deres anatomiske, fysiologiske og genetiske likhet med mennesker24. Mest signifikant har mus CB1/2 reseptorer i nervesystemet, som er tilstede hos mennesker. De har også en kortere livssyklus enn mennesker, med enklere vedlikehold og rikelig genetiske ressurser, og dermed gjør det mye lettere å overvåke effekten av cannabinoider gjennom en hel livssyklus. Pattedyrsystemet er mye brukt og har med hell vist at CBD lindrer anfallsforstyrrelser1, posttraumatisk stresslidelse9, orale sår25 og demenslignende symptomer10. Musemodellen har også gjort det mulig å studere individer i et samfunn som er ekstremt vanskelig hos store dyr og mennesker26.
Til tross for alle fordelene med dyremodellsystemet, er det fortsatt kostbart og krever intensivbehandling under legemiddeladministrasjon og datainnsamling. I tillegg er det granskning av bruk av mus i forskning på grunn av irreproducibility og dårlig recapitulation av menneskelige forhold på grunn av begrensninger i eksperimentell design og rigor27.
Med den økende etterspørselen etter medisinske / prekliniske studier av cannabinoider, er det nødvendig med et ikke-pattedyrmodellsystem. Hvirvelløse modeller ga tradisjonelt særegne fordeler i forhold til virveldyrmodeller. De betydelige fordelene inkluderer enkelhet og lave kostnader ved å oppdra mange prøver og gjøre det mulig for forskere å overvåke flere generasjoner genetisk homogene populasjoner28. En nylig studie viste at fruktfluen, Drosophila melanogaster, var et effektivt insektmodellsystem for å undersøke farmakologiske funksjoner av cannabinoider i modulerende fôringsatferd29. Blant insektmodellsystemene fokuserte forfatterne på tobakkshornorm, Manduca sexta, også kjent som Carolina sfinxmot eller haukmot, som et nytt insektmodellsystem for cannabinoidforskning.
Manduca sexta tilhører familien til Sphingidae. Insektet er det vanligste plante i det sørlige USA, hvor de spiser på solanaceous planter. Insektmodellen har en lang historie i forskning innen insektfysiologi, biokjemi, nevrobiologi og legemiddelinteraksjonsstudier. Manduca sextas forskningsportefølje inkluderer et utkast til genomsekvens, noe som gir en molekylær forståelse av essensielle cellulære prosesser30. En annen avgjørende fordel med dette modellsystemet er dens store størrelse, og når mer enn 100 mm i lengde og 10 g i vekt i 18-25 dager med larvutvikling. Den store størrelsen gjør det mulig for forskere å enkelt overvåke morfologiske og atferdsmessige endringer i sanntid som svar på CBD-behandlingen. Også på grunn av størrelsen ble elektrofysiologiske responser undersøkt med buknervesystemet, inkludert ganglia dissekert fra larver uten høyoppløselige mikroskopinnstillinger. Den unike funksjonen gjør det mulig for forskere å lett undersøke akutte og langsiktige svar på administrerte cannabinoid(er).
Til tross for en slik allsidighet har M. sexta bare nylig blitt utforsket for sin egnethet som en eksperimentell modell for Cannabis- og cannabinoidstudier. I 2019 brukte forfatterne insektmodellsystemet for første gang for å adressere hypotesen om at Cannabis har utviklet seg til å produsere Cannabidiol for å beskytte seg mot insekt plantelevende dyr30,31. Resultatet viste tydelig at plantene utnyttet CBD som en fôring avskrekkende og hemmet veksten av skadedyrsinsektet M. sexta caterpillar, samt forårsaker økt dødelighet31. Studien demonstrerte også de reddende effektene av CBD til berusede etanollarver, og identifiserte den potensielle kjøretøyeffekten av etanol som bærer av CBD. Som vist undersøkte insektmodellsystemet effektivt de terapeutiske effektene av cannabinoider innen 3-4 uker med mindre arbeidskraft og kostnader enn andre dyresystemer. Selv om insektmodellen mangler cannabinoidreseptorer (dvs. ingen CB1/2-reseptorer), gir modellsystemet et verdifullt verktøy for å forstå de farmakologiske rollene til cannabinoider gjennom en cannabinoidreseptoruavhengig måte.
Forfatterne av denne studien har tidligere jobbet med tobakkshornorm som modellsystem for cannabinoidforskning31. Etter nøye vurdering av fordelene og risikoen ved å bruke M. sexta, har vi gitt en metode som involverer riktig omsorg og forberedelse av diett for prekliniske studier som gir muligheter for fremtidig preklinisk laboratoriebruk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analytic balance</td>
			<td>Mettler Instrument Corp.</td>
			<td>AE100S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannabidiol isolate (&#62;99.4%)</td>
			<td>Lilu&#39;s Garden</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL</td>
			<td>470150-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89093-192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, 200 Proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fear conditioning chamber</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect rearing chamber</td>
			<td>Darwin Chambers</td>
			<td>INR034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium chain triglycerides (MCT) oil</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion detection software (Actimetrics)</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco hormworm artificial diet</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>Item # 143908</td>
			<td>Ready-To-Use-Hornworm-Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco hormworm eggs</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>Item # 143880</td>
			<td>Unit of 30-50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tobacco hornworm as an insect model system for cannabinoid pre-clinical studies

Med økt oppmerksomhet på cannabinoider i medisin, har flere pattedyrmodellorganismer blitt brukt til å belyse sine ukjente farmasøytiske funksjoner. Imidlertid forblir mange vanskeligheter i pattedyrforskning, noe som nødvendiggjør utviklingen av ikke-pattedyrmodellorganismer for cannabinoidforskning. Forfatterne foreslår tobakk hornworm Manduca sexta som et nytt insektmodellsystem. Denne protokollen gir informasjon om å forberede det kunstige kostholdet med varierende mengder cannabidiol (CBD), sette opp et dyrkingsmiljø og overvåke deres fysiologiske og atferdsmessige endringer som svar på CBD-behandling. Kort sagt, etter å ha mottatt hornormegg, ble eggene tillatt 1-3 dager ved 25 °C på en 12:12 lys mørk syklus for å klekkes før de ble tilfeldig fordelt i kontroll (hvetekimbasert kunstig diett; AD), kjøretøy (AD + 0,1% mellomkjedet triglyseridolje; MCT-olje) og behandlingsgrupper (AD + 0,1% MCT + 1 mM eller 2 mM CBD). Når media var forberedt, ble første instar larver individuelt plassert i et 50 ml reagensrør med en trespydpinne, og deretter ble reagensrøret dekket med en osteklut. Målinger ble tatt i 2-dagers intervaller for fysiologiske og atferdsmessige responser på CBD-administrasjonen. Denne enkle dyrkingsprosedyren gjør det mulig for forskere å teste store prøver i et gitt eksperiment. I tillegg gjør de relativt korte livssyklusene det mulig for forskere å studere effekten av cannabinoidbehandlinger over flere generasjoner av en homogen befolkning, slik at data kan støtte en eksperimentell design i høyere pattedyrmodellorganismer.

Manduca sexta som modellsystem for å undersøke cannabinoider toksisitet Figur 1 viser nøkkelkomponentene i CBD-eksperimentet ved hjelp av tobakkhornorm Manduca sexta. Et stort antall insekter (>20) ble individuelt oppdrettet ved 25 °C på en 12 t:12 t = lys: mørk syklus. Insektenes størrelse, vekt og dødelighet ble målt med 2-dagers intervaller for å overvåke for kort- og langtidsresponser etter høydose CBD (2 mM) behandling.<...

Watch this Scientific Journal Video about Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies at JoVE.com

Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies

Den nåværende protokollen gir instruksjonsinformasjon for bruk av tobakk hornorm Manduca sexta i cannabinoid forskning. Metoden som er beskrevet her inkluderer alle nødvendige forsyninger og protokoller for å overvåke fysiologiske og atferdsmessige endringer i insektmodellen som svar på cannabidiol (CBD) behandling.

Tobakkshornorm som insektmodellsystem for cannabinoid prekliniske studier

With increased attention on cannabinoids in medicine, several mammalian model organisms have been used to elucidate their unknown pharmaceutical ...

Protokollen foreslår å bruke tobakk hornorm som et insektmodellsystem for cannabinoid prekliniske studier. Dette systemet gjør det mulig for forskere å undersøke akutte og langsiktige svar på cannabinoider lett. Insektmodellsystemet gjør det mulig for forskere å undersøke cannabinoid terapeutiske effekter i en stor befolkning innen tre til fire uker med mindre arbeidskraft og kostnader enn andre dyresystemer.Få 150 til 200 levedyktige M.sexta egg og hvete bakteriebaserte kunstige dietter. Legg hornormeggene i en polystyren Petri-tallerken med et hvetekimbasert kunstig diettlag og overfør eggene til et insektoppdrettskammer opprettholdt ved 25 grader Celsius med 40 til 60% relativ fuktighet. La eggene klekkes i en til tre dager inne i insektoppdrettskammeret.For å forberede en 200 millimolar cannabidiol lagerløsning, tilsett 1,26 gram større enn 98% renhet cannabidiol isolere i 20 milliliter etanol eller 100% middels kjede triglyseridolje. Tilsett fem milliliter og 10 milliliter av 200 millimolar cannabidiol lagerløsning til henholdsvis 1000 gram kunstig diett for en millimolar og to millimolar cannabidiol. Dispenser 20 gram kontrollkjøretøy og cannabidiolholdige medier til bunnen av 50 milliliterrøret.Fordel tilfeldig omtrent to millimeter lange første instar larver individuelt i et 50 milliliter reagensrør og dekk med perforert lokk eller osteklut. Vokse dem inne i et insektoppdrettskammer opprettholdt ved 25 grader Celsius med en 12-timers lys-mørk syklus. For å måle larveveksten registrerer du hver gruppes opprinnelige masse og størrelse med henholdsvis en analytisk balanse og linjal, og introduserer larvene til sine respektive dietter.Trekk larvens masse ved hver måling med to-dagers intervaller fra den første massen for å bestemme massegevinster mellom larver utviklingsstadier. Registrer også antall dager mellom instar utviklingsstadier for å forstå forskjeller i utviklingsrammen til pupering. For å måle diettforbruket, registrer de første gram diett i begynnelsen ved eksperimentet og trekk det fra den gjenværende mengden diett da larvene kom inn i hele puppetrinnet.For larvmobilitetsmålingen, la det utsatte insektet akklimatisere seg til fryktkondisjoneringskammeret i minst fem minutter og spore avstandene de tre gruppene av femte instar insekter reiste i fem minutter. Kjør deretter programvaren for bevegelsesdeteksjon for å analysere mobilitetsresponsen. Insektene oppdrettet på et kunstig kosthold viste den beste vekstytelsen.Kjøretøykontrollen som brukte 0,1% middels kjede triglyseridolje som et oppløsende middel for CBD-isolasjon viste også normal vekst uten skadelige effekter. Imidlertid induserte en høy dose CBD på to millimeter vekttap og førte til høyere dødelighet enn kontroll- og kjøretøygrupper. M.sexta larver oppdrettet på AD med en millimeter CBD konsumert minst 3.1 ganger større diett enn de oppdrettet på en etanol-lagt diett.Imidlertid var diettforbruket av insekter oppdrettet på to millimolar CBD-tilsatte medier ikke vesentlig forskjellig fra larver oppdrettet på etanol-bare dietter. Mobilindeksen til M.sexta larve oppdrettet på forskjellige forhold viser at 1% etanol og en millimolar CBD-behandlede larver ikke påvirket mobiliteten. De 2% etanolbehandlingene viste seg å være dødelige.Legge til en høy dose CBD i AD som inneholder 2% etanol gjenopprettet lav mobilitet. Når CBD er lagt til dietter, homogeniser cbd-blandingen og vokse insekter i insektoppdrettskammeret opprettholdt ved 25 grader Celsius med 40 til 60% fuktighet for å unngå et sopputbrudd. Elektrofysiologiske responser kan også overvåkes med ventralkjeden ganglia dissekert fra Manduca sexta for å avgjøre om CBD påvirker tobakkhornormens sentralnervesystem.Insektmodellsystemet vil gjøre det mulig for forskere å utforske de farmasøytiske rollene til andre store og mindre cannabinoider ved å teste over flere generasjoner, noe som gir mulighet for et eksperimentelt design hos høyere pattedyr.

Research

JoVE Journal

Biology

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Characterizing Herbivore Resistance Mechanisms: Spittlebugs on Brachiaria spp. as an Example

Plants can resist herbivore damage through three broad mechanisms: antixenosis, antibiosis and tolerance1. Antixenosis is the degree to which the plant is ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Effektiv produksjon og rensing av rekombinant mus Kindlin-3 fra insektceller for biofysiske studier

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

En eksperimentell og bioinformatikk protokoll for RNA-seq Analyser av Photoperiodic Diapause i den asiatiske tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Imaging Spatial Reorganization of a MAPK Signaling Pathway Using the Tobacco Transient Expression System

Imaging Spatial Omorganisering av et MAPK signalveien Bruke Tobacco Transient Expression System

Visualization of dynamic signaling events in live cells has been a challenge. We expanded an established transient expression system, the biomolecular ...

Establishment of an Extracellular Acidic pH Culture System

Etablering av en ekstracellulære surt pH kultur-systemet

Conditions of the tumor microenvironment, such as hypoxia or nutrient starvation, play critical roles in cancer progression and malignancy. However, the ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Eksperimentell protokoll for bruke Drosophila som en virvelløse modellsystem for toksisitet Testing i laboratoriet

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

Massespektrometrianalyse for å identifisere Ubiquitylation av EYFP-merket CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Forberede og injisere embryoer av Culex mygg for å generere nullmutasjoner ved hjelp av CRISPR / Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...