Name: tobacco hornworm as an insect model system for cannabinoid pre-clinical studies
Uploaded: 2021-12-29T15:00:00
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Esta investigación fue apoyada por el Instituto de Investigación de Cannabis de la Universidad Estatal de Colorado-Pueblo y el Ministerio de Ciencia y TIC (2021-DD-UP-0379), y la ciudad de Chuncheon (I + D e industrialización del cáñamo, 2020-2021).

1. Preparación del gusano del cuerno y tratamiento con cannabidiol
<ol><li>Obtener 150-200 M viables. sexta huevos y dietas artificiales basadas en germen de trigo (ver Tabla de Materiales).</li>
	<li>Coloque los huevos del gusano del cuerno en una placa de Petri de poliestireno con una capa de dieta artificial (AD) a base de germen de trigo y transfiera los huevos a una cámara de cría de insectos (consulte la Tabla de materiales) mantenida a 25 °...

<ol>
	<li>Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+attenuates+seizures+and+social+deficits+in+a+mouse+model+of+Dravet+syndrome.">Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).</li><li>Leehey, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+tolerability+of+cannabidiol+in+Parkinson+Disease:+An+open+label,+dose-escalation+study.">Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).</li><li>Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+cannabinoids,+delta+9-+tetrahydrocannabinol+and+cannabidiol,+ameliorates+experimental+multiple+sclerosis+by+suppressing+neuroinflammation+through+regulation+of+miRNA-mediated+signaling+pathways.">Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways.</a> Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).</li><li>Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CBD+activation+of+TRPV1+induces+oxidative+signaling+and+subsequent+ER+stress+in+breast+cancer+cell+lines.">CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).</li><li>Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol+and+sertraline+regulate+behavioral+and+brain+gene+expression+alterations+in+an+animal+model+of+PTSD.">Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD.</a> Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).</li><li>Aso, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol-enriched+extract+reduced+the+cognitive+impairment+but+not+the+epileptic+seizures+in+a+Lafora+disease+animal+model.">Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model.</a> Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).</li><li>Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+recruitment+and+retention+of+clinical+trial+subjects.">Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects.</a> Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. 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Trophoblast Available from: <a target="_blank" href="https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast">https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast</a> (2021)</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoids+inhibited+pancreatic+cancer+via+P-21+activated+kinase+1+mediated+pathway.">Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).</li><li>Jeong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabidiol-induced+apoptosis+is+mediated+by+activation+of+Noxa+in+human+colorectal+cancer+cells.">Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells.</a> Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).</li><li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines+as+biological+models:+Practical+steps+for+more+reliable+research.">Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).</li><li>Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+antiseizure+efficacy+of+cannabidiol+and+clonazepam+in+a+conditional+mouse+model+of+Dravet+syndrome.">Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome.</a> Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).</li><li>Orvos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrophysiological+effect+of+cannabidiol+on+hERG+current+and+in+guinea-pig+and+rabbit+cardiac+preparations.">The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations.</a> Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).</li><li>Verrico, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+placebo-controlled+study+of+daily+cannabidiol+for+the+treatment+of+canine+osteoarthritis.">A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis.</a> Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).</li><li>Barata, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotection+by+cannabidiol+and+hypothermia+in+a+piglet+model+of+newborn+hypoxic-ischemic+brain+damage.">Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage.</a> Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).</li><li>Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+the+agonistic+activity+of+delta+9-11-tetrahydrocannabinol+in+mice,+dogs+and+rhesus+monkeys+and+its+interactions+with+delta+9-tetrahydrocannabinol.">Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).</li><li>Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+roles+of+cannabidiol+as+an+insecticide+and+rescuing+agent+for+ethanol-induced+death+in+the+tobacco+hornworm+Manduca+sexta.">Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta.</a> Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).</li><li>Tukey, J. 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M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannabinoid+receptors+in+invertebrates.">Cannabinoid receptors in invertebrates.</a> Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).</li></ol>

El estudio de alimentación demostró que altas dosis de CBD (2 mM) inhibieron el crecimiento del insecto y aumentaron la mortalidad31. El modelo de insecto también mostró sensibilidad al etanol; sin embargo, el CBD destoxicó efectivamente la toxicidad del etanol, aumentando su tasa de supervivencia, consumo de dieta y comportamientos de búsqueda de alimentos a niveles similares al grupo de control (Figura 3A, B)31. El sist...

En los últimos años, la atención pública se ha centrado en los cannabinoides debido a su potencial terapéutico, incluyendo el tratamiento de la epilepsia1, la enfermedad de Parkinson2, la esclerosis múltiple3 y diversas formas de cáncer4,5,6 con cannabidiol (CBD). Desde que el cannabis se legalizó como un producto agrícola en la Ley de Mejora Agrícola de 2018, la Ley Pública 115-334 (la Ley Agrícola de 2018), el cannabis y sus derivados cannabinoides en las industrias alimentaria, cosmética y farmacéutica han aumentado exponencialmente. Además, se han probado con éxito aislados de grado clínico de cannabinoides individuales y mezclas de cannabinoides en sujetos humanos7, líneas celulares5,8 y diversos sistemas de modelos animales9,10.
Un ensayo clínico sería ideal para validar la eficacia y los efectos adversos de los cannabinoides en una enfermedad específica. Sin embargo, existen numerosos desafíos en los ensayos clínicos, incluida la aprobación ética / IRB, el reclutamiento y la retención de los sujetos11. Para superar estos obstáculos, se utilizaron varias líneas celulares humanas porque las líneas celulares derivadas de humanos son rentables, fáciles de manejar, pueden eludir los problemas éticos y proporcionar resultados consistentes y reproducibles, ya que las líneas celulares son una "población pura de células que no tienen contaminación cruzada de otras células y productos químicos"12.
Alves et al. (2021)13 probaron el CBD de manera dosis-dependiente en los trofoblastos placentarios, que son células especializadas de la placenta que desempeñan un papel esencial en la implantación embrionaria y la interacción con el útero materno decidualizado14. Sus resultados mostraron que el CBD causó pérdida de viabilidad celular, interrupción de la progresión del ciclo celular e inducción de la apoptosis. Estas observaciones demuestran los posibles impactos negativos del consumo de Cannabis por parte de las mujeres embarazadas13. Del mismo modo, también se utilizaron una serie de líneas celulares para examinar los efectos farmacológicos del CBD en enfermedades humanas, en particular, diversas formas de cáncer. Los estudios in vitro demostraron con éxito efectos anticancerígenos en células de cáncer de páncreas15, mama8 y colorrectal16. Sin embargo, aunque están ampliamente disponibles y son fáciles de manejar, las líneas celulares específicas como HeLa, HEK293 son propensas a cambios genéticos y fenotípicos debido a alteraciones en sus condiciones de crecimiento o manejo17.
En la investigación del cannabis, se han utilizado varios sistemas de modelos animales, que van desde animales pequeños como el ratón18, el conejillo de indias19 y el conejo19 hasta animales grandes como canino20, lechón21, mono22, caballo23, para explorar efectos terapéuticos desconocidos. Los ratones han sido el sistema modelo animal preferido para la investigación de cannabinoides debido a su similitud anatómica, fisiológica y genética con los humanos24. Lo más significativo es que los ratones tienen receptores CB1/2 en su sistema nervioso, que están presentes en los humanos. También tienen un ciclo de vida más corto que los sujetos humanos, con un mantenimiento más fácil y abundantes recursos genéticos, lo que hace que sea mucho más fácil monitorear los efectos de los cannabinoides a lo largo de todo un ciclo de vida. El sistema de mamíferos es ampliamente utilizado y ha demostrado con éxito que el CBD alivia los trastornos convulsivos1, el trastorno de estrés postraumático9, las úlceras orales25 y los síntomas similares a la demencia10. El modelo de ratón también ha permitido un estudio de interacción social de individuos dentro de una comunidad que es extremadamente difícil en animales grandes y humanos26.
A pesar de todas las ventajas del sistema de modelo animal, sigue siendo costoso y requiere cuidados intensivos durante la administración de medicamentos y la recopilación de datos. Además, existe un escrutinio del uso de ratones en la investigación debido a la irreproducibilidad y la mala recapitulación de las condiciones humanas debido a las limitaciones en el diseño experimental y el rigor27.
Con la creciente demanda de estudios médicos / preclínicos de cannabinoides, se necesita un sistema modelo no mamífero. Los modelos de invertebrados tradicionalmente conferían beneficios distintivos sobre los modelos de vertebrados. Los beneficios significativos incluyen la facilidad y el bajo costo de criar muchos especímenes y permitir a los investigadores monitorear múltiples generaciones de poblaciones genéticamente homogéneas28. Un estudio reciente demostró que la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un sistema modelo de insecto eficaz para investigar las funciones farmacológicas de los cannabinoides en la modulación de los comportamientos de alimentación29. Entre los sistemas modelo de insectos, los autores se centraron en el gusano del tabaco, Manduca sexta, también conocido como polilla de la esfinge de Carolina o polilla halcón, como un nuevo sistema modelo de insecto para la investigación de cannabinoides.
Manduca sexta pertenece a la familia de los Sphingidae. El insecto es la plaga de plantas más común en el sur de los Estados Unidos, donde se alimentan de plantas solanáceas. El modelo de insecto tiene una larga historia en la investigación en fisiología de insectos, bioquímica, neurobiología y estudios de interacción farmacológica. La cartera de investigación de Manduca sexta incluye un borrador de secuencia genómica, lo que permite una comprensión a nivel molecular de los procesos celulares esenciales30. Otro beneficio crucial de este sistema modelo es su gran tamaño, alcanzando más de 100 mm de longitud y 10 g de peso en los 18-25 días de desarrollo larvario. El gran tamaño permite a los investigadores monitorear fácilmente los cambios morfológicos y de comportamiento en tiempo real en respuesta al tratamiento con CBD. Además, debido al tamaño, se examinaron las respuestas electrofisiológicas con el sistema nervioso abdominal, incluidos los ganglios diseccionados de las larvas sin ajustes de microscopio de alta resolución. La característica única permite a los investigadores investigar fácilmente las respuestas agudas y a largo plazo a los cannabinoides administrados.
A pesar de tal versatilidad, M. sexta ha sido explorada recientemente por su idoneidad como modelo experimental para estudios de cannabis y cannabinoides. En 2019, los autores utilizaron el sistema modelo de insectos por primera vez para abordar la hipótesis de que el cannabis ha evolucionado para producir cannabidiol para protegerse de los insectos herbívoros30,31. El resultado mostró claramente que las plantas explotaron el CBD como elemento disuasorio de alimentación e inhibieron el crecimiento del insecto plaga M. sexta oruga, además de causar un aumento de la mortalidad31. El estudio también demostró los efectos de rescate del CBD a las larvas de etanol intoxicadas, identificando el posible efecto vehicular del etanol como portador del CBD. Como se muestra, el sistema modelo de insectos investigó efectivamente los efectos terapéuticos de los cannabinoides en 3-4 semanas con menos mano de obra y costos que otros sistemas animales. Aunque el modelo de insecto carece de receptores cannabinoides (es decir, no hay receptores CB1/2), el sistema modelo proporciona una herramienta valiosa para comprender las funciones farmacológicas de los cannabinoides a través de una manera independiente del receptor cannabinoide.
Los autores de este estudio han trabajado previamente con el gusano del tabaco como sistema modelo para la investigación de cannabinoides31. Después de una cuidadosa consideración de los beneficios y riesgos del uso de M. sexta, hemos proporcionado un método que implica el cuidado adecuado y la preparación de la dieta para ensayos preclínicos que permiten oportunidades para el uso futuro en laboratorio preclínico.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Analytic balance</td>
			<td>Mettler Instrument Corp.</td>
			<td>AE100S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cannabidiol isolate (&#62;99.4%)</td>
			<td>Lilu&#39;s Garden</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cheesecloth</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL</td>
			<td>470150-438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89093-192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Alcohol, 200 Proof</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EX0276-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fear conditioning chamber</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect rearing chamber</td>
			<td>Darwin Chambers</td>
			<td>INR034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium chain triglycerides (MCT) oil</td>
			<td>Walmart</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motion detection software (Actimetrics)</td>
			<td>Coulbourn Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)</td>
			<td>VWR INTERNATIONAL</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco hormworm artificial diet</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>Item # 143908</td>
			<td>Ready-To-Use-Hornworm-Diet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tobacco hormworm eggs</td>
			<td>Carolina Biological Supply Company</td>
			<td>Item # 143880</td>
			<td>Unit of 30-50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tobacco hornworm as an insect model system for cannabinoid pre-clinical studies

Con una mayor atención a los cannabinoides en la medicina, se han utilizado varios organismos modelo de mamíferos para dilucidar sus funciones farmacéuticas desconocidas. Sin embargo, siguen existiendo muchas dificultades en la investigación con mamíferos, lo que requiere el desarrollo de organismos modelo no mamíferos para la investigación de cannabinoides. Los autores sugieren el gusano del tabaco Manduca sexta como un nuevo sistema modelo de insectos. Este protocolo proporciona información sobre la preparación de la dieta artificial con cantidades variables de cannabidiol (CBD), la creación de un entorno de cultivo y el monitoreo de sus cambios fisiológicos y de comportamiento en respuesta al tratamiento con CBD. Brevemente, al recibir los huevos de gusano del cuerno, a los huevos se les permitió 1-3 días a 25 ° C en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 para eclosionar antes de ser distribuidos al azar en el control (dieta artificial basada en germen de trigo; AD), vehículo (AD + 0.1% aceite de triglicéridos de cadena media; Aceite MCT) y grupos de tratamiento (AD + 0,1% MCT + 1 mM o 2 mM de CBD). Una vez que se preparó el medio, las larvas de 1st instar se colocaron individualmente en un tubo de ensayo de 50 ml con un palo de pincho de madera, y luego el tubo de ensayo se cubrió con una gasa. Las mediciones se tomaron en intervalos de 2 días para las respuestas fisiológicas y conductuales a la administración de CBD. Este sencillo procedimiento de cultivo permite a los investigadores probar muestras grandes en un experimento determinado. Además, los ciclos de vida relativamente cortos permiten a los investigadores estudiar el impacto de los tratamientos con cannabinoides en múltiples generaciones de una población homogénea, lo que permite que los datos respalden un diseño experimental en organismos modelo de mamíferos superiores.

Manduca sexta como sistema modelo para examinar la toxicidad de los cannabinoides La Figura 1 muestra los componentes clave del experimento de CBD utilizando el gusano del tabaco Manduca sexta. Un gran número de insectos (>20) se criaron individualmente a 25 ° C en un ciclo de 12 h: 12 h = luz: oscuridad. El tamaño, el peso y la mortalidad de los insectos se midieron a intervalos de 2 días para monitorear las respuestas a corto y lar...

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Tobacco Hornworm as an Insect Model System for Cannabinoid Pre-clinical Studies

El presente protocolo proporciona información instructiva para el uso del gusano del tabaco Manduca sexta en la investigación de cannabinoides. El método descrito aquí incluye todos los suministros y protocolos necesarios para monitorear los cambios fisiológicos y de comportamiento del modelo de insecto en respuesta al tratamiento con cannabidiol (CBD).

El gusano del cuerno del tabaco como sistema modelo de insectos para estudios preclínicos de cannabinoides

With increased attention on cannabinoids in medicine, several mammalian model organisms have been used to elucidate their unknown pharmaceutical ...

El protocolo propone el uso del gusano del tabaco como un sistema modelo de insectos para estudios preclínicos de cannabinoides. Este sistema permite a los investigadores investigar fácilmente las respuestas agudas y a largo plazo a los cannabinoides. El sistema modelo de insectos permite a los investigadores investigar los efectos terapéuticos de los cannabinoides en una gran población dentro de tres a cuatro semanas con menos mano de obra y costos que otros sistemas animales.Obtener de 150 a 200 huevos M.sexta viables y dietas artificiales a base de germen de trigo. Coloque los huevos del gusano del cuerno en una placa de Petri de poliestireno con una capa de dieta artificial a base de germen de trigo y transfiera los huevos a una cámara de cría de insectos mantenida a 25 grados centígrados con una humedad relativa del 40 al 60%. Deje que los huevos eclosionen durante uno a tres días dentro de la cámara de cría de insectos.Para preparar una solución madre de cannabidiol de 200 milimolares, agregue 1,26 gramos de aislado de cannabidiol de mayor al 98% de pureza en 20 mililitros de etanol o aceite de triglicéridos de cadena media al 100%. Agregue cinco mililitros y 10 mililitros de la solución madre de cannabidiol de 200 milimolares a los 1,000 gramos de una dieta artificial para un milimolar y dos milimolares de cannabidiol, respectivamente. Dispense 20 gramos de vehículo de control y medios que contengan cannabidiol en la parte inferior del tubo de 50 mililitros.Distribuya aleatoriamente aproximadamente dos larvas de instar de aproximadamente dos milímetros de largo individualmente en un tubo de ensayo de 50 mililitros y cúbralas con una tapa perforada o una gasa. Cultivarlos dentro de una cámara de cría de insectos mantenida a 25 grados centígrados con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas. Para medir el crecimiento larvario, registre la masa y el tamaño iniciales de cada grupo con una balanza analítica y una regla, respectivamente, e introduzca las larvas en sus respectivas dietas.Reste la masa de las larvas en cada medición a intervalos de dos días de la masa inicial para determinar las ganancias de masa entre las etapas de desarrollo de las larvas. Además, registre el número de días entre las etapas de desarrollo de instar para comprender las diferencias en el marco de tiempo de desarrollo hasta la pupación. Para medir el consumo de dieta, registre los gramos iniciales de dieta al comienzo del experimento y éstelos de la cantidad restante de dieta cuando las larvas entraron en la etapa de pupación completa.Para la medición de la movilidad larvaria, permita que el insecto sometido se aclimate a la cámara de acondicionamiento del miedo durante al menos cinco minutos y rastree las distancias que los tres grupos de insectos del quinto instar viajaron durante cinco minutos. Luego, ejecute el software de detección de movimiento para analizar la respuesta de movilidad. Los insectos criados con una dieta artificial mostraron el mejor rendimiento de crecimiento.El control del vehículo que utilizó aceite de triglicéridos de cadena media al 0,1% como agente disolvente para el aislado de CBD también mostró un crecimiento normal sin ningún efecto perjudicial. Sin embargo, una dosis alta de CBD de dos milímetros indujo la pérdida de peso y condujo a una tasa de mortalidad más alta que los grupos de control y vehículos. Las larvas de M.sexta criadas con AD con un milímetro de CBD consumieron al menos 3,1 veces más dieta que las criadas con una dieta de etanol añadido.Sin embargo, el consumo de dieta de los insectos criados en dos medios milimolares añadidos con CBD no fue significativamente diferente de las larvas criadas en dietas de solo etanol. El índice móvil de la larva de M.sexta criada en diferentes condiciones muestra que el 1% de etanol y una larva milimolar tratadas con CBD no afectaron la movilidad. Los tratamientos con etanol al 2% resultaron ser letales.La adición de una alta dosis de CBD en AD que contiene 2% de etanol restauró la baja movilidad. Una vez que se agrega CBD a las dietas, homogeneice completamente la mezcla de CBD de la dieta y cultive insectos en la cámara de cría de insectos mantenida a 25 grados centígrados con 40 a 60% de humedad para evitar un brote de hongos. Las respuestas electrofisiológicas también se pueden monitorear con los ganglios de la cadena ventral diseccionados de Manduca sexta para determinar si el CBD afecta el sistema nervioso central del gusano del tabaco.El sistema modelo de insectos permitirá a los investigadores explorar las funciones farmacéuticas de otros cannabinoides mayores y menores mediante pruebas a lo largo de múltiples generaciones, lo que permitirá un diseño experimental en mamíferos superiores.

Research

JoVE Journal

Biology

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