Name: act1-cup1 assays determine the substrate-specific sensitivities of spliceosomal mutants in budding yeast
Uploaded: 2022-06-30T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast at JoVE.com

Tack till Aaron Hoskins och Hoskins labbmedlemmar vid University of Wisconsin-Madison för användning av jäststammar och utrustning i genereringen av figurerna 3-5. Tack till Harpreet Kaur och Xingyang Fu för deras insiktsfulla kommentarer om manuskriptet. Tack till de stödjande studenterna, personalen och fakulteten vid Northwest University under skrivandet, redigeringen och inspelningen av detta papper. Tack till Isabelle Marasigan för hjälp med att filma denna metod.

1. Jäststamkonstruktion
<ol><li>Generera eller erhålla en S. cerevisiae-stam vars bakgrund inkluderar leu2 och cup1Δ. För att generera denna bakgrund, använd den väletablerade jästmetoden som använder litiumacetat och enkelsträngat DNA39. OBS: Haploida jäststammar kan innehålla en, två eller flera kopior av CUP1 6,38. Se genomisk information för den valda jäststammen n...

ACT1-CUP1 är en tillväxtanalys, och man måste se till att observerade tillväxtskillnader endast kan hänföras till skarvningsfel. Alla stammar bör hanteras på ett liknande sätt före plätering, inklusive att ha en liknande längd och typ av tillväxt- och lagringsförhållanden. Vid användning av temperaturkänsliga stammar bör ACT1-CUP1-analyser endast utföras under förhållanden där dessa stammar växer jämförbart med vild typ. För QSP-komponenten rekommenderas det att ha identiska jästbakgrunder och ...

Spliceosomen är en stor, biologisk maskin som katalyserar avlägsnandet av introner, icke-kodande regioner i prekursorbudbärar-RNA (pre-mRNA)1,2. Att karakterisera effekten av en enpunktsmutant i 1 av de nästan 100 proteinerna och 5 icke-kodande RNA är ofta tvetydigt när man studerar proteinet eller RNA isolerat. Förändringen i den muterade komponentens funktion kan bäst utvärderas in vivo i samband med den fullständiga, fungerande skarvosomen.
Koppartillväxtanalysen som beskrivs här är en snabb mätare av skarvningseffektivitet i Saccharomyces cerevisiae eller spirande jäst. Utvecklad av C.F. Lesser och C. Guthrie och publicerad 1993, kombinerar denna analys lättheten att arbeta med en enkel modellorganism och den enkla avläsningen av cellviabilitet3. Livskraften korrelerar med hur väl skarvskaperna i dessa celler kan känna igen och skarva reporterutskriften.
Denna koppartillväxtanalys kallas oftare ACT1-CUP1-analysen. Namnet ACT1-CUP1 härstammar från de två gener som smälts samman för att skapa en reporter av skarvningseffektivitet. ACT1 är jästens aktingen, som är starkt uttryckt och har en effektivt skarvad intron 4,5. Cup1p är en kopparkelatator som binder koppar i cellen för att förhindra störningar i vanliga cellulära funktioner 6,7,8. ACT1-CUP1-reportern innehåller dessa gener i följd så att CUP1 endast är i rätt läsram om pre-mRNA-skarvning av ACT1: s intron inträffar (figur 1). Det resulterande fusionsproteinet innehåller de första 21 aminosyrorna av aktin och Cup1p-proteinet i full längd, vilket ökar jästens livskraft i en kopparrik miljö3. Således resulterar en ökning av mängden skarvning av reportern i en högre koncentration av Cup1p och ett högre kopparmotstånd (Figur 1). I jämförelse med andra reportergener påverkar CUP1 cellviabiliteten även vid låga nivåer, har ett brett känslighetsområde och kan användas för att direkt välja för skarvningsmutationer 3,6,7. Dessutom är CUP1 inte nödvändigt för standardjästtillväxt, och därmed påverkas inte cellulär homeostas under installationen för denna analys. Som komplement till deletions- eller temperaturtillväxtanalyser ger ACT1-CUP1 information om effekterna på skarvning under annars optimala jästtillväxtförhållanden.
Spliceosomen känner igen sitt substrat genom tre introniska sekvenser, nämligen 5'-skarvplatsen (5' SS), grenplatsen (BS) och 3'-skarvplatsen (3' SS). Många ACT1-CUP1-reportrar har genererats som innehåller icke-konsensussekvenser på dessa webbplatser. Ett urval av de vanligaste ACT1-CUP1-reportrarna visas i figur 1 och tabell 1. Eftersom skarven interagerar med varje skarvplats unikt vid olika punkter i skarvningscykeln, kan skarvasomens robusthet testas i olika steg baserat på vilken icke-konsensusreporter som används. Icke-konsensusreportrar är uppkallade efter den muterade positionen inom intronen och basen den muterades till. Till exempel är A3c en reporter med en mutation vid 5 'SS, specifikt position 3 från konsensus adenosin till en cytosin. Denna reporter kommer att interagera starkt med skarvmutationer som påverkar 5 'SS urval och användning. I sin första studie bestämde Lesser och Guthrie vilka 5 'SS -mutationer som hämmade skarvning3. Senare samma år publicerades icke-konsensusreportrar på alla tre skarvplatser av Burgess och Guthrie i en suppressorskärm av mutationer i ATPase Prp16p9. Genom att jämföra konsensus med icke-konsensusreportrar har ACT1-CUP1-analysen varit en viktig nyckel för att förstå robustheten och selektiviteten hos jästsklyven och för att dra slutsatsen om funktionen hos andra eukaryoters spliceosomer.
Eftersom icke-konsensus ACT1-CUP1-reportrar sensibiliserar skarven för ytterligare störning, kan effekten av en enda skarvfaktormutation karakteriseras genom de reportrar som den positivt eller negativt påverkar. Detta har tillämpats på skarvning av forskningsfrågor på olika sätt. För det första kan och har ACT1-CUP1-analysen använts som en genetisk skärm för mutationer i skarvningsfaktorer. Till exempel fungerar Prp8p, det största skarvningsproteinet, som en plattform på vilken RNA-kärnan i skarvningsgraden katalyserar skarvningsreaktionen. Detta härleddes delvis genom hur Prp8p-mutanter förbättrade eller minskade skarvningen av olika ACT1-CUP1-reportrar 10,11,12,13,14,15,16,17. Andra proteinkomponenter i skarven har också undersökts med ACT1-CUP1, inklusive Hsh155p, Cwc2p, Cef1p och Ecm2p 18,19,20,21,22,23,24,25. De energiska trösklarna för Prp16p och fyra andra ATPaser som är involverade i skarvsosomal övergång har också studerats med denna analys 9,26,27,28,29,30. De små nukleära RNA (snRNA) har också studerats omfattande med hjälp av ACT1-CUP1 för att identifiera de pre-mRNA-sekvenser de samordnar och förändringarna i sekundär struktur som snRNA genomgår under skarvning 3,31,32,33,34,35,36,37.
ACT1-CUP1-analysen kräver en jäststam där alla kopior av CUP1-genen har slagits ut. Eftersom CUP1 kan ha ett högt kopieringsnummer 6,38, kan förberedelse av en fullständig knock-out-stam kräva flera omgångar eller omfattande screening. Som ett resultat har koppar1Δ-jäststammar ofta delats mellan laboratorier, liksom reportrarna.
Om mutation(er) i en skarvningsfaktor bedöms från en plasmidkopia, bör genen av vildtyp för denna faktor slås ut. Dessutom bör jästbakgrunden möjliggöra val av minst två plasmider, en innehållande en ACT1-CUP1-reporter, historiskt på en leukeminutrient-selektionsplasmid och en som innehåller en mutation eller störning i skarvningsmaskineriet som kommer att studeras (figur 2). Vanligtvis, i en enda analys, kommer flera jäststammar, var och en med frågeskarvningsstörning (QSP) och en annan reporter, att testa frågans inverkan på skarvning.
De oberoende variablerna i ACT1-CUP1-analysen gör det möjligt för en forskare att bedöma svårighetsgraden av en QSP. Dessa oberoende variabler är koncentrationen av koppar och valet av flera icke-konsensusskarvningsreportrar. För det första, eftersom jäststammarna odlas på plattor som innehåller ett intervall av kopparkoncentrationer (figur 2), innefattar upprättandet av analysen att välja gradienten av de koncentrationer som används. Studier kan använda en kurskopparkoncentrationsgradient för att få en första avläsning av livskraften och sedan upprepa analysen med en finare gradient för att identifiera subtila viabilitetsskillnader. Den andra variabeln är det breda utbudet av ACT1-CUP1-reportrar som är möjliga att testa (figur 1 och tabell 1). Om QSP påverkar jästens livskraft annorlunda i närvaro av en icke-konsensusreporter jämfört med vildtyp, kan en slutsats dras att QSP påverkar ett steg i skarvning eller en region av skarven som är viktig under igenkänningen eller bearbetningen av den regionen av intronen.
Jästverktygslådan är omfattande och ACT1-CUP1-analysen är en integrerad del av skarvningsforskningen. ACT1-CUP1-analysen utförs ofta tillsammans med en mer djupgående genetisk, strukturell och/eller biokemisk analys av effekten av en QSP. Eftersom dessa mer detaljerade studier i allmänhet har ett längre förfarande och/eller högre prislapp, är ett vanligt tillvägagångssätt screening för intressanta mutanter med ACT1-CUP1 först.
Här tillhandahålls ett ACT1-CUP1-analysprotokoll, inklusive kopparplåtberedning. Denna analys ger forskare ett första svar på en QSP: s effekt på skarvning och vilka introniska regioner som påverkas mest av störningen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL sterile microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL sterile microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-408-138</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL sterile centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-201-332</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well round bottom microplate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-200-760</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>190 proof ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-032-600</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL Filter System (0.22 &#181;m)</td>
			<td>CellTreat Scientific Products</td>
			<td>229707</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>Any molecular grade agar will work.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Tuttnauer</td>
			<td>3870EA</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen burner</td>
			<td>Humboldt</td>
			<td>PN6200.1</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Density Meter</td>
			<td>VWR</td>
			<td>490005-906</td>
			<td>Or other spectral device that can measure absorbance at 595 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper sulfate Pentahydrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>LC134051</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital imaging system</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29399481</td>
			<td>ImageQuant 4000 (used for Figure 3),&#160; Amersham ImageQuant 800, or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dropout mix (-Leu)</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>D9525</td>
			<td>Use the appropriate drop out mix for your experiment. It is possible you will be using a yeast nutrient marker for your query perturbation also. In that case, the drop out mix should be for that marker and Leu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AAA1682836</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel band quantifying software</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29-0006-05</td>
			<td>ImageQuant TL v8.1 (used for figure 5A) or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand held camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>D3500</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Near infra-red gel imaging device</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>29238583</td>
			<td>Amersham Typhoon NIR (used for Figure 5a) or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory grade clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>05-769-7Q</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory grade stand and clamp</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-000-101</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stir bars</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-513-51</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pin replicator</td>
			<td>VP Scientific</td>
			<td>VP 407AH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semi-micro disposable cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97000-590</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>JEIO Tech</td>
			<td>IST-3075</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Biowave</td>
			<td>80-3000-45</td>
			<td>Or any spectophotometer that can measure the absorbance at 600 nm.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>102091-156</td>
			<td>Circular plates may also be used though are more challenging if using a pin replicator.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-520-16S</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base</td>
			<td>USBiological Life Sciences</td>
			<td>Y2025</td>
			<td>Or comparable item from a different manufacturer.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

act1-cup1 assays determine the substrate-specific sensitivities of spliceosomal mutants in budding yeast

Mutationer som införts i skarven eller dess substrat har väsentligt bidragit till vår förståelse av komplikationerna med spliceosomal funktion. Oavsett om det är sjukdomsrelaterat eller funktionellt utvalt har många av dessa mutationer studerats med hjälp av tillväxtanalyser i modellorganismen Saccharomyces cerevisiae (jäst). Den skarvningsspecifika koppartillväxtanalysen, eller ACT1-CUP1-analysen, ger en omfattande analys av mutation på fenotypisk nivå. ACT1-CUP1-analysen använder reportrar som ger koppartolerans när de är korrekt skarvade. Således, i närvaro av koppar, korrelerar förändringar i jästens livskraft med förändringar i mRNA-produktion genom skarvning. I ett typiskt experiment utmanas jästskarvningssomen med olika icke-konsensusskarvningsreportrar och skarvningsfaktormutationen av intresse för att upptäcka någon synergistisk eller antitetisk inverkan på skarvning. Här ges en fullständig beskrivning av kopparplattberedning, plätering av jästceller och datautvärdering. Ett urval av kompletterande experiment beskrivs, vilket belyser mångsidigheten hos ACT1-CUP1-reportrarna. ACT1-CUP1-analysen är ett praktiskt verktyg i skarvningsverktygslådan tack vare den direkta avläsningen av mutationseffekter och de jämförande möjligheterna från den fortsatta användningen i fält.

Tillväxtanalyser, som ACT1-CUP1, kräver visuell, jämförande bedömning av flera kolonier. Här odlades varje stam till mättnad över natten, späddes till en OD600 på 0,5 och pläterades på 20 plattor innehållande ett intervall av kopparkoncentrationer från 0 mM till 1,1 mM CuSO4 (Figur 3). Detta intervall är mindre än det som anges i protokollet eftersom det möjliggjorde en fullständig bedömning av effekterna av QSP: erna och ACT1-CUP1-reportrarna som anv...

Watch this Scientific Journal Video about ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast at JoVE.com

ACT1-CUP1 Assays Determine the Substrate-Specific Sensitivities of Spliceosomal Mutants in Budding Yeast

ACT1-CUP1-analysen, en koppartillväxtanalys, ger en snabb avläsning av prekursorbudbärar-RNA (pre-mRNA) skarvning och den inverkan mutanta skarvningsfaktorer har på skarvningsfunktionen. Denna studie ger ett protokoll och belyser den anpassning som är möjlig för att ta itu med skarvfrågan av intresse.

ACT1-CUP1-analyser bestämmer de substratspecifika känsligheterna hos skarvosomala mutanter i spirande jäst

Mutations introduced in the spliceosome or its substrate have significantly contributed to our understanding of the intricacies of spliceosomal function. ...

ACT1-CUP1-analysen kan identifiera om en mutation påverkar RNA-skarvning före budbärare och ge en indikation på vilket skarvningssteg som påverkas mest. ACT1-CUP1-analysen kopplar skarvningsfaktormutation till dess inverkan på den komplexa skarvningsprocessen. Den använder den enkla avläsningen av tillväxtfenotyp och har ett brett känslighetsområde.Effektiv tidsanvändning är viktigt när du utför en ACT1-CUP1-analys. Börja med en analys av fem till 10 stammar för att minimera stressinducerade tillväxtavvikelser. Demonstrerande processen kommer att vara jag och Isabelle Marasigan, en grundforskare från mitt laboratorium.För att börja, tillsätt 790 milligram agar och en omrörningsstång till varje flaska. I en stor bägare, förbered leucinavhoppets tillväxtmedium för alla kopparplattor som ska hällas. Detta inkluderar 265 milligram jästkvävebas, 64 milligram dropout-blandning, minus leucin och 34 ml avjoniserat vatten för varje platta som ska hällas.Rör om för att lösa upp Tillsätt sedan 34 ml av leucinavhoppningslösningen till varje beredd 100-millilitersflaska och täck med aluminiumfolie. Därefter autoklav för att sterilisera och lösa upp agar, med hjälp av den rekommenderade vätskecykeln för autoklaven. Så snabbt som möjligt efter autoklavering, tillsätt fyra milliliter 20% glukos till varje flaska.Matcha sedan röretiketten till flasketiketten för att tillsätta de två milliliter utspädningarna av kopparsulfat vardera till den avsedda flaskan. Blanda i cirka 30 sekunder med en omrörningsplatta och häll eller pipettera 35 ml i den märkta plattan och undvik bubblor. Per jäststam, tillsätt nio milliliter leucindroppstillväxtmedium och en milliliter 20% glukos till ett sterilt, 50-milliliter koniskt rör.Använd en steril pinne eller pipettspets, samla en liten prov av jäst och inokulera media. Skaka sedan alla nattkulturer vid 180 varv / min och 30 grader Celsius. Tillsätt sedan 100 mikroliter kultur till en kyvett, innehållande 900 mikroliter vatten per stam.Mät därefter den optiska densiteten med en spektrofotometer och beräkna den utspädning som krävs för att ha en optisk densitet på 0,5 i en slutlig volym på två milliliter. Späd sedan varje stam till optisk densitet 0,5 i 10% glycerol och mät om den optiska densiteten för att bekräfta att celldensiteten ligger inom önskat område. Efter att ha satt upp en steril arbetsplats, tänd en Bunsen-brännare.För en 48-stifts replikator, pipettera 200 mikroliter av varje utspädd stam i en separat brunn av en 96-brunnsplatta och fyll de tomma utrymmena i sex-till-åtta-gallret med 200 mikroliter 10% glycerol. Doppa sedan replikatorn i en grund skål med 95% etanol och flamma för att sterilisera. Låt det svalna i minst två minuter efter att lågan släckts för att undvika att värmen chockar cellerna.Placera fyra plattor nära brännaren och ta bort locken. Doppa replikatorn i 96-brunnsplattan och lyft upp den i en snabb rörelse. Lägg sedan försiktigt på plattan och gunga lätt fram och tillbaka för att underlätta en bra överföring.Lyft upp i en snabb rörelse och placera i exakt samma riktning i 96-brunnsplattan. När en platta har pläterats, flytta med en jämn rörelse åt sidan, men fortfarande inom flammans steriliseringsparaply. Låt plattorna torka helt innan du lägger på locken, vanligtvis tre till fem minuter.Inkubera sedan plattorna i tre dagar vid 30 grader Celsius. Efter att ha tagit bort plattorna från inkubatorn, inspektera dem visuellt. Tillväxtanalysen visade att när kopparkoncentrationen ökar visar stammar med lägre skarvning minskad sammanflöde, till den punkt där kopparkoncentrationen blir dödlig.Jästbakgrunden innehåller en störd ADE2-gen, vilket resulterar i att kolonierna är olika nyanser av rött. Och de mogna kolonierna var djupröda i färg. Under plätering, om replikatorn lyfts upp medan den rör sig åt vänster eller höger, förs i en vinkel eller om den skakas ovanför plattan, är det möjligt att skapa kolonier som är ovala formade eller mikrokolonier från små droppar celllösning.Jäst med A3c-reportern överlevde till 0,15 millimolar koppar medan reportercellerna av vildtyp upprätthöll livskraften till slutet av det testade kopparkoncentrationsintervallet. Analysresultaten visade att de olika baserna vid U6 snRNA position 57 har unika effekter på skarven i kombination med en 5 prime- eller grenplatsmutation. Medan U57c är en additiv mutation, minskar koppartoleransen, i kombination med A3c och grenplats G-reportrar.Däremot ökar U57a koppartoleransen eftersom det främjar progression till det andra steget. Efter att skarvningsstörning har identifierats genom ACT1-CUP1 kan forskning gå över till mer kvantitativa metoder, som primerförlängning och identifiering av störd molekylär interaktion genom EMSA och enzymatisk sondering. ACT1-CUP1 har varit en grundläggande analys som byggt vår förståelse för jästskassosomens robusthet och selektivitet.Och det fortsätter att utöka vår förståelse för skarvsoma.

Research

JoVE Journal

Genetics

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

In Vitro Transcription Assays and Their Application in Drug Discovery

Transkription in vitro analyser och deras tillämpning i Drug Discovery

In vitro transcription assays have been developed and widely used for many years to study the molecular mechanisms involved in transcription. This process ...

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

High-Throughput Robotically Assisted Isolation of Temperature-sensitive Lethal Mutants in Chlamydomonas reinhardtii

Hög genomströmning Robotsvetsad Assisted Isolering av temperaturkänslig dödliga mutanter i<em&gt; Chlamydomonas reinhardtii</em

Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the ...

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Konjugativ Parning Analyser för sekvensspecifik analys av Transfer proteiner involverade i konjugation

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Targeted in Situ Mutagenesis of Histone Genes in Budding Yeast

Målinriktad<em&gt; In situ</em&gt; mutagenes av Histon Gener i knoppande jäst

We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting ...

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Mäta mRNA nivåer över tid under den jäst S. cerevisiae hypoxisk svar

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

Gen-riktade slumpmässig mutagenes att välja Heterokromatin-destabiliserande proteasom mutanter i Fission jäst

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

A Rapid and Facile Pipeline for Generating Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

En snabb och lättköpt Pipeline för generera genomisk punkt mutanter i C. elegans med CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

The clustered regularly interspersed palindromic repeats (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (Cas9) prokaryotic adaptive immune defense system has been ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

CRISPR/Cas9 gen redigering till göra villkorlig mutanter av humana malariaparasiten P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Enda molekyl fluorescens In Situ hybridisering (smFISH) analys i spirande jäst vegetativ tillväxt och meios

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Mating-based Overexpression Library Screening in Yeast

Parning-baserade överuttryck bibliotek Screening i jäst

Budding yeast has been widely used as a model in studying proteins associated with human diseases. Genome-wide genetic screening is a powerful tool ...