Name: optimized bone sampling protocols for the retrieval of ancient dna from archaeological remains
Uploaded: 2021-11-30T14:00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Bone Sampling Protocols for the Retrieval of Ancient DNA from Archaeological Remains at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke laboratoriepersonalet ved Max Planck Institute for Science of Human History for deres hjelp i utviklingen og implementeringen av disse protokollene. Dette arbeidet ville ikke vært mulig uten innspill og hardt arbeid fra Dr. Guido Brandt, Dr. Elizabeth Nelson, Antje Wissegot og Franziska Aron. Denne studien ble finansiert av Max Planck Society, Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs Horizon 2020 forsknings- og innovasjonsprogram under tilskuddsavtaler No 771234 - PALEoRIDER (WH, ABR) og Starting Grant No. 805268 CoDisEASe (til KIB).

<ol>
	<li>Adler, C. J., Haak, W., Donlon, D., Cooper, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+recovery+of+DNA+from+ancient+teeth+and+bones.">Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones.</a> Journal of Archaeological Science. 38 (5), 956-964 (2011).</li><li>Dabney, J., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+highly+degraded+DNA+from+ancient+bones+and+teeth.">Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth.</a> Ancient DNA: Methods and Protocols. , 25-29 (2019).</li><li>Palsdottir, A. H., Bl&#228;uer, A., Rannam&#228;e, E., Boessenkool, S., Hallsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+a+limitless+resource:+ethics+and+guidelines+for+destructive+sampling+of+archaeofaunal+remains.">Not a limitless resource: ethics and guidelines for destructive sampling of archaeofaunal remains.</a> Royal Society Open Science. 6 (10), 191059 (2019).</li><li>Pinhasi, R., Fernandes, D. M., Sirak, K., Cheronet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+human+cochlea+to+generate+bone+powder+for+ancient+DNA+analysis.">Isolating the human cochlea to generate bone powder for ancient DNA analysis.</a> Nature Protocols. 14 (4), 1194-1205 (2019).</li><li>Latham, K. E., Miller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+recovery+and+analysis+from+skeletal+material+in+modern+forensic+contexts.">DNA recovery and analysis from skeletal material in modern forensic contexts.</a> Forensic Sciences Research. 4 (1), 51-59 (2019).</li><li>Mundorff, A. Z., Bartelink, E. J., Mar-Cash, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+preservation+in+skeletal+elements+from+the+World+Trade+Center+disaster:+Recommendations+for+mass+fatality+management.">DNA preservation in skeletal elements from the World Trade Center disaster: Recommendations for mass fatality management.</a> Journal of Forensic Sciences. 54 (4), 739-745 (2009).</li><li>Gamba, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+flux+and+stasis+in+a+five+millennium+transect+of+European+prehistory.">Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory.</a> Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).</li><li>Alberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+DNA+sampling+of+ancient+bones+using+Computed+Tomography+scans.">Optimized DNA sampling of ancient bones using Computed Tomography scans.</a> Molecular Ecology Resources. 18 (6), 1196-1208 (2018).</li><li>Hansen, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ancient+DNA+preservation+in+petrous+bone+and+tooth+cementum.">Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170940 (2017).</li><li>Sirak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+auditory+ossicles+as+an+alternative+optimal+source+of+ancient+DNA.">Human auditory ossicles as an alternative optimal source of ancient DNA.</a> Genome Research. 30 (3), 427-436 (2020).</li><li>Parker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+investigation+of+human+DNA+preservation+in+medieval+skeletons.">A systematic investigation of human DNA preservation in medieval skeletons.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18225 (2020).</li><li>Pinhasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+ancient+DNA+yields+from+the+inner+ear+part+of+the+human+petrous+bone.">Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone.</a> PLoS ONE. 10 (6), 0129102 (2015).</li><li>Sirak, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimally-invasive+method+for+sampling+human+petrous+bones+from+the+cranial+base+for+ancient+DNA+analysis.">A minimally-invasive method for sampling human petrous bones from the cranial base for ancient DNA analysis.</a> BioTechniques. 62 (6), 283-289 (2017).</li><li>. Minimally-invasive sampling of pars petrosa (os temporale) for ancient DNA extraction. protocols.io Available from: <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w">https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w</a> (2020)</li><li>Damgaard, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+access+to+endogenous+DNA+in+ancient+bones+and+teeth.">Improving access to endogenous DNA in ancient bones and teeth.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-12 (2015).</li><li>Harney, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimally+destructive+protocol+for+DNA+extraction+from+ancient+teeth.">A minimally destructive protocol for DNA extraction from ancient teeth.</a> Genome Research. 31 (3), 472-483 (2021).</li><li>Cooper, A., Poinar, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+DNA:+Do+it+right+or+not+at+all.">Ancient DNA: Do it right or not at all.</a> Science. 289 (5482), 1139 (2000).</li><li>Llamas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+field+to+the+laboratory:+Controlling+DNA+contamination+in+human+ancient+DNA+research+in+the+high-throughput+sequencing+era.">From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era.</a> STAR: Science &amp; Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).</li><li>Llamas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+field+to+the+laboratory:+Controlling+DNA+contamination+in+human+ancient+DNA+research+in+the+high-throughput+sequencing+era.">From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era.</a> STAR: Science &amp; Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).</li><li>Boessenkool, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+bleach+and+mild+predigestion+improves+ancient+DNA+recovery+from+bones.">Combining bleach and mild predigestion improves ancient DNA recovery from bones.</a> Molecular Ecology Resources. 17 (4), 742-751 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Garcer&#224;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragmentation+of+contaminant+and+endogenous+DNA+in+ancient+samples+determined+by+shotgun+sequencing;+Prospects+for+human+palaeogenomics.">Fragmentation of contaminant and endogenous DNA in ancient samples determined by shotgun sequencing; Prospects for human palaeogenomics.</a> PLoS ONE. 6 (8), 24161 (2011).</li><li>Malmstr&#246;m, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+on+contamination:+The+use+of+asymmetric+molecular+behavior+to+identify+authentic+ancient+human+DNA.">More on contamination: The use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA.</a> Molecular Biology and Evolution. 24 (4), 998-1004 (2007).</li><li>Basler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+the+contaminant+fraction+of+DNA+obtained+from+an+ancient+giant+panda+bone.">Reduction of the contaminant fraction of DNA obtained from an ancient giant panda bone.</a> BMC Research Notes. 10, 754 (2017).</li><li>Kemp, B. M., Smith, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bleach+to+eliminate+contaminating+DNA+from+the+surface+of+bones+and+teeth.">Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth.</a> Forensic Science International. 154 (1), 53-61 (2005).</li><li>Korlevi&#263;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+microbial+and+human+contamination+in+DNA+extractions+from+ancient+bones+and+teeth.">Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth.</a> BioTechniques. 59 (2), 87-93 (2015).</li><li>Dabney, J., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+highly+degraded+DNA+from+ancient+bones+and+teeth.">Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth.</a> Methods in Molecular Biology. 1963, 25-29 (2019).</li><li>Hansen, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ancient+DNA+preservation+in+petrous+bone+and+tooth+cementum.">Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170940 (2017).</li><li>Gansauge, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+library+preparation+from+highly+degraded+DNA+using+T4+DNA+ligase.">Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 79 (2017).</li><li>Peltzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EAGER:+efficient+ancient+genome+reconstruction.">EAGER: efficient ancient genome reconstruction.</a> Genome Biology. 17 (1), 60 (2016).</li><li>Korneliussen, T. S., Albrechtsen, A., Nielsen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANGSD:+analysis+of+next+generation+sequencing+data.">ANGSD: analysis of next generation sequencing data.</a> BMC Bioinformatics. 15, 356 (2014).</li><li>Renaud, G., Hangh&#248;j, K., Willerslev, E., Orlando, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gargammel:+A+sequence+simulator+for+ancient+DNA.">Gargammel: A sequence simulator for ancient DNA.</a> Bioinformatics. 33 (4), 577-579 (2017).</li><li>Ponce de Le&#243;n, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bony+labyrinth+is+an+indicator+of+population+history+and+dispersal+from+Africa.">Human bony labyrinth is an indicator of population history and dispersal from Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), 4128-4133 (2018).</li><li>Nagaoka, T., Kawakubo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+petrous+part+of+the+temporal+bone+to+estimate+fetal+age+at+death.">Using the petrous part of the temporal bone to estimate fetal age at death.</a> Forensic Science International. 248, 188 (2015).</li><li>Nor&#233;n, A., Lynnerup, N., Czarnetzki, A., Graw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+angle:+A+method+for+sexing+using+the+petrous+bone.">Lateral angle: A method for sexing using the petrous bone.</a> American Journal of Physical Anthropology. 128 (2), 318-323 (2005).</li></ol>

Forfatterne har ingen interessekonflikter å rapportere.

Nåværende praksis i gammel menneskelig populasjonsgenetikk er å fortrinnsvis prøve fra pars petrosa (trinn 2.1) når det er mulig. Pars petrosa kan imidlertid være et vanskelig utvalg å oppnå, da det er høyt verdsatt for et mylder av skjelettvurderinger (f.eks. Befolkningshistorie 32, estimering av fosteralder ved død33 og kjønnsbestemmelse34), og historisk sett kan prøvetaking av pars petrosa for DNA-analyse være svært ødeleggende3,4 (inkludert protokollen som presenteres her, selv om nye, minimalt invasive protokoller13,14 nå er allment vedtatt for å lindre denne bekymringen). Dette forsterkes av det faktum at inntil ganske nylig, en storstilt, systematisk studie av menneskelig DNA-utvinning over skjelettet ikke hadde blitt forsøkt11, noe som gjør det utfordrende å finne en passende prøvetakingsstrategi når petrouspyramiden ikke er tilgjengelig.
Protokollene som presenteres her bidrar til å lindre denne utfordringen ved å gi et sett med optimaliserte prosedyrer for DNA-prøvetaking fra arkeologiske / rettsmedisinske skjelettrester, inkludert pars petrosa, samt syv alternative anatomiske prøvetakingssteder over fire ekstra skjelettelementer. De kritiske trinnene som er inkludert, er alle ment å minimere muligheten for DNA-tap / skade på grunn av enten ineffektiv prøvetaking (trinn 2.1.6 og 3.2.1.3) eller overoppheting av prøver under boring / kutting (trinn 3.1.6). I tillegg har det blitt bemerket gjennom hele protokollen at det kan være nødvendig å endre / utelate forbehandlingstrinnene for å sikre best mulig ytelse i svært forringede prøver. Det skal også bemerkes at selv blant de utvalgte elementene som presenteres her, er det fortsatt flere mulige alternative prøvetakingsteknikker (spesielt for pars petrosa13,14), samt god plass til ytterligere optimalisering av de underutnyttede anatomiske prøvetakingsstedene som presenteres her (dvs. talus: trinn 2.5 og ryggvirvlene: trinn 2.3).
Det er også viktig å huske på at disse protokollene er designet og testet ved hjelp av gamle juvenile-voksne rester av høy kvalitet (god morfologisk bevaring) med henblikk på endogene humane DNA-analyser. Resultatene som presenteres kan ikke strekke seg til mer høyt forringede materialer, andre bevaringskontekster, spedbarnsrester, ikke-menneskelige rester eller studier av patogener eller mikrobiomet, da det fortsatt er behov for en større undersøkelse av bruken av disse protokollene i flere sammenhenger. I tillegg kan de alternative skjelettelementene som presenteres her (tennene, ryggvirvlene, distal falanks og tali) være utfordrende å tildele et enkelt individ blant blandede rester, noe som nødvendiggjør prøvetaking fra flere elementer for å sikre en enkelt opprinnelse. Til tross for disse begrensningene kan det å gjøre disse protokollene allment tilgjengelige bidra til å lindre noe av heterogeniteten rundt prøvevalg og behandling ved å gi et generalisert og kvantitativt optimalisert rammeverk for bruk i et bredt spekter av fremtidige aDNA / rettsmedisinske studier på menneskelige rester.

Prøvetaking av gamle menneskelige rester med henblikk på DNA-utvinning og analyse er iboende ødeleggende 1,2,3,4. Prøvene i seg selv er verdifulle eksemplarer, og morfologisk bevaring bør bevares der det er mulig. Som sådan er det viktig at prøvetakingspraksis optimaliseres for både å unngå unødvendig ødeleggelse av uerstattelig materiale og for å maksimere sannsynligheten for suksess. Nåværende beste praksis-teknikker er basert på en liten kohorte av studier begrenset til enten rettsmedisinske undersøkelser5,6, studier av gamle prøver der utviklingen av optimal prøvetaking ikke er det direkte målet med studien7, eller dedikerte studier som benytter enten ikke-menneskelige rester8 eller rettet mot et svært lite utvalg av anatomiske prøvetakingssteder (brukt her for å betegne et bestemt område av et skjelettelement hvorfra beinpulver, til bruk i nedstrøms DNA-analyser, ble generert)9,10. Prøvetakingsprotokollene som presenteres her ble optimalisert i den første storskala systematiske studien av DNA-bevaring på tvers av flere skjelettelementer fra flere individer11. Alle prøvene stammet fra skjelettelementer gjenfunnet fra 11 personer utgravd fra kirkekirkegården til den forlatte middelalderbosetningen Krakauer Berg nær Peißen, Sachsen-Anhalt, Tyskland (se tabell 1 for detaljert prøvedemografi) og kan derfor trenge modifisering for bruk med prøver utenfor dette geografiske / tidsmessige området.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Individ</td>
			<td>Sex</td>
			<td>Estimert alder ved død</td>
			<td>14 C datoer (CE, Cal 2-sigma)</td>
		</tr><tr><td>KRA001</td>
			<td>Mannlig</td>
			<td>25-35</td>
			<td>1058-1219</td>
		</tr><tr><td>KRA002</td>
			<td>Kvinnelig</td>
			<td>20-22</td>
			<td>1227-1283</td>
		</tr><tr><td>KRA003</td>
			<td>Mannlig</td>
			<td>25</td>
			<td>1059-1223</td>
		</tr><tr><td>KRA004</td>
			<td>Mannlig</td>
			<td>15</td>
			<td>1284-1392</td>
		</tr><tr><td>KRA005</td>
			<td>Mannlig</td>
			<td>10-12</td>
			<td>1170-1258</td>
		</tr><tr><td>KRA006</td>
			<td>Kvinnelig</td>
			<td>30-40</td>
			<td>1218-1266</td>
		</tr><tr><td>KRA007</td>
			<td>Kvinnelig</td>
			<td>25-30</td>
			<td>1167-1251</td>
		</tr><tr><td>KRA008</td>
			<td>Mannlig</td>
			<td>20</td>
			<td>1301-1402</td>
		</tr><tr><td>KRA009</td>
			<td>Mannlig</td>
			<td>Ukjent</td>
			<td>1158-1254</td>
		</tr><tr><td>KRA010</td>
			<td>Mannlig</td>
			<td>25</td>
			<td>1276-1383</td>
		</tr><tr><td>KRA011</td>
			<td>Kvinnelig</td>
			<td>30-45</td>
			<td>1040-1159</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Genetisk bestemt kjønn, arkeologisk bestemt estimert alder ved død og radiokarbondatering (14C Cal 2-sigma) for alle de 11 individene som ble samplet. Denne tabellen er tilpasset fra Parker, C. et al. 202011.
Disse protokollene tillater en relativt enkel og effektiv generering av beinpulver fra åtte anatomiske prøvetakingssteder over fem skjelettelementer (inkludert pars petrosa) med begrenset laboratorieindusert DNA-forurensning. Av disse fem skjelettelementene har syv anatomiske prøvetakingssteder funnet på fire skjelettelementer blitt bestemt til å være levedyktige alternativer til den destruktive prøvetakingen av petrouspyramiden11,12. Disse inkluderer sementum, dentin og massekammer av permanente molarer; kortikale bein samlet fra det overlegne vertebrale hakket så vel som fra kroppen av thoraxvirvler; kortikal bein som stammer fra den dårligere overflaten av den apikale tuft og aksel av de distale phalanges; og det tette kortikale beinet langs den ytre delen av tali. Mens det er flere mye anvendte metoder for prøvetaking av pars petrosa 4,12,13,14, dentin og tannmassekammeret 1,2,15, publiserte metoder som beskriver den vellykkede generasjonen av beinpulver fra sementum 16 , vertebral kropp, dårligere vertebral hakk og talus kan være vanskelig å oppnå. Som sådan demonstrerer vi her optimaliserte prøvetakingsprotokoller for petrouspyramiden (trinn 3.1); cementum (trinn 3.2.1), dentin (trinn 3.2.2) og tannmasse (trinn 3.2.3) av voksne molarer; kortikale bein i vertebral kroppen (trinn 3.3.1) og overlegen vertebral bue (trinn 3.3.2); den distale falanksen (trinn 3.4); og talus (trinn 3.5) for å gjøre effektiv bruk av disse skjelettelementene for både aDNA og rettsmedisinsk forskning mer tilgjengelig.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#16 Dental Drill Bit</td>
			<td>NTI</td>
			<td>H1-016-HP</td>
			<td>example drilling bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mm scroll saw blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-097</td>
			<td>blade for Jewellers Saw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22mm diamond cutting wheel</td>
			<td>Kahla</td>
			<td>SKU 806 104 358 514 220</td>
			<td>Dremel cutting attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Bleach</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1818018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-078-29X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes (2 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>225-01</td>
			<td>Dremel flexible extension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel 4300 Rotary Tool</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>4300</td>
			<td>Example drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel collet and nut kit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>4485</td>
			<td>Adapters for various Dremel tool attachments/bits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-988-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1.08543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA approved level 2 Surgical Mask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-206-0397</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-041-171X</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Safety Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-208X</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granger Stationary Vise</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1336173</td>
			<td>benchtop vise</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jewellers Saw</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldritch</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30-368-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LookOut DNA Erase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L9042-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weighing boat</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS120223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC 10pc plier/clamp set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-129-5352</td>
			<td>Miscellaneous&#160;clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sartorius Quintix Semi-Micro Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-560-019</td>
			<td>enclosed balance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyvek coveralls with hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-361-7X</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh paper</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS120116</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized bone sampling protocols for the retrieval of ancient dna from archaeological remains

Metodene som presenteres her søker å maksimere sjansene for utvinning av menneskelig DNA fra gamle arkeologiske rester samtidig som det begrenser inngangsprøvemateriale. Dette ble gjort ved å målrette anatomiske prøvetakingssteder som tidligere ble bestemt for å gi de høyeste mengdene gammelt DNA (aDNA) i en komparativ analyse av DNA-utvinning over skjelettet. Tidligere forskning har antydet at disse protokollene maksimerer sjansene for vellykket gjenoppretting av gammelt menneskelig og patogen DNA fra arkeologiske rester. DNA-utbytter ble tidligere vurdert av Parker et al. 2020 i en bred undersøkelse av aDNA-bevaring på tvers av flere skjelettelementer fra 11 individer gjenvunnet fra middelalderen (radiokarbon datert til en periode på ca. 1040-1400 e.Kr., kalibrert 2-sigma rekkevidde) kirkegård på Krakauer Berg, en forlatt middelaldersk bosetning nær Peißen Tyskland. Disse åtte prøvetakingspunktene, som spenner over fem skjelettelementer (pars petrosa, permanente molarer, thorax vertebra, distal phalanx og talus) ga vellykket høy kvalitet gammelt menneskelig DNA, hvor utbyttet var betydelig større enn det totale gjennomsnittet på tvers av alle elementer og individer. Avlingene var adekvate til bruk i de fleste vanlige nedstrøms populasjonsgenetiske analyser. Våre resultater støtter fortrinnsrett bruk av disse anatomiske prøvetakingsstedene for de fleste studier som involverer analyser av gammelt menneskelig DNA fra arkeologiske rester. Implementering av disse metodene vil bidra til å minimere ødeleggelsen av dyrebare arkeologiske prøver.

I en separat studie 11 ble DNA ekstrahert fra beinpulver generert fra hvert anatomisk prøvetakingssted hos11 individer, ved hjelp av en standard DNA-ekstraksjonsprotokoll optimalisert for korte fragmenter fra forkalket vev2. Enkeltstrengede biblioteker ble deretter produsert28 og sekvensert på en HiSeq 4000 (75 bp paired-end) til en dybde på ~ 20.000.000 leser per prøve. De resulterende sekvensdataene ble deretter evaluert for endogent humant DNA-innhold ved bruk av EAGER pipeline29 (BWA-innstillinger: Frølengde på 32, 0,1 mismatch-straff, kartleggingskvalitetsfilter på 37). Alle representative resultater rapporteres ved å bruke de samme beregningene som Parker et al. 202011 for konsistens. Biblioteker fra de pulveriserte delene av pars petrosa ga i gjennomsnitt høyere endogent DNA enn noen av de andre 23 anatomiske prøvetakingsstedene som ble undersøkt (figur 6A-B). De syv ekstra anatomiske prøvetakingsstedene som presenteres i denne protokollen (sementum, første pass av tannmassekammeret og dentin av permanente molarer, kortikale bein fra vertebrallegemet og overlegen vertebral bue av thorax vertebra; kortikal bein fra apikal tuft av distal phalanx; og kortikal bein fra talushalsen) produserte de nest høyeste utbyttene (uten statistisk signifikans mellom disse anatomiske prøvetakingsstedene; Figur 6A-B; Tilleggsfil 1: EndogendDNAPreCap). Disse alternative stedene produserte alle konsekvent DNA-utbytter som er tilstrekkelige for standard populasjonsgenetiske analyser som mitokondrielle analyser og enkeltnukleotidpolymorfisme (SNP) analyser. Dupliseringsratene i biblioteker som stammet fra alle anatomiske prøvetakingssteder var lave (klyngefaktorer < 1,2 i gjennomsnitt, beregnet som forholdet mellom alle kartavlesninger og unike kartavlesninger, tabell 2; Tilleggsfil 1: ClusterFactor), noe som indikerer at alle bibliotekene som ble vist var av svært høy kompleksitet. Tilsvarende var gjennomsnittlige eksogene estimater for human DNA-forurensning lave, i gjennomsnitt < 2 % (X-kromosomkontaminering hos menn, n = 7, som rapportert av ANGSD30-rørledningen) på alle anatomiske prøvetakingssteder bortsett fra den overlegne vertebrale buen (gjennomsnittlig estimert forurensning: 2,11 %, med en prøve fjernet som en uteligger; KRA005: 19,52%, se tabell 2; Tilleggsfil 1: Xkontaminering). Gjennomsnittlig fragmentlengde (etter filtrering for å fjerne alle avlesninger < 30 bp) var lavest i materialet samlet inn fra tannmassekammeret og dentin, uten signifikant variasjon blant andre anatomiske prøvetakingssteder (henholdsvis 55,14 bp og 60,22 bp, sammenlignet med en gjennomsnittlig median på 62,87, parvise p-verdier < 0,019, tabell 2; Tilleggsfil 1: AvgFragLength). I tillegg inneholder tennene og brystvirvlene hver flere anatomiske prøvetakingssteder der høy endogen DNA-utvinning ble observert, noe som gjør dem spesielt egnet som alternativer til pars petrosa.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63250/63250fig06.jpg"> Figur 6: Menneskelig DNA-innhold for alle screenede prøver. Svarte linjer representerer det totale gjennomsnittet, mens røde linjer representerer medianen (solid: human DNA proportion, stiplet: kartlagt menneskelig lesing per million leser generert). Individuelle anatomiske prøvetakingssteder med en gjennomsnittlig human DNA-andel høyere enn det totale gjennomsnittet (8,16%) er fargelagt i alle analyser. (A) Andelen leser kartlegging til hg19 referansegenomet. Den blå stiplede linjen representerer det teoretiske maksimumet gitt rørledningens kartleggingsparametere (generert ved hjelp av Gargammel31 for å simulere en tilfeldig fordeling på 5 000 000 avlesninger fra referansegenomet hg19 med simulert skade). Individuelle midler (svart X) og median (rød sirkel) rapporteres for de prøvene med en høyere gjennomsnittlig menneskelig DNA-andel enn det totale gjennomsnittet. Konfidensintervaller angir øvre og nedre grense ekskludert statistiske avvik. (B) Antall unike leser kartlegging til hg19 referanse genom per million leser av sekvensering innsats (75 bp paret slutten). Konfidensintervaller angir øvre og nedre grense ekskludert statistiske avvik. Dette tallet er tilpasset fra Parker, C. et al. 202011. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63250/63250fig06large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 2: Gjennomsnittlige dupliseringsnivåer (kartleggingsavlesninger/unike avlesninger), gjennomsnittlige og median fragmentlengder og X-kromosomkontamineringsestimater for alle anatomiske prøvetakingssteder. Feil rapportert som standardfeil for gjennomsnittet. Denne tabellen er tilpasset fra Parker, C. et al. 202011.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Prøvetakingssted</td>
			<td>Gjennomsnittlig dupliseringsfaktor (# kartlagt leser /# unike kartlagte leser)</td>
			<td>Gjennomsnittlig fragmentlengde i bp</td>
			<td>Gjennomsnittlig estimert andel av X-kromosomforurensning</td>
		</tr><tr><td>Petrous pyramide</td>
			<td>1.188 ± 0.006</td>
			<td>65,40 ± 1,36</td>
			<td>0.000 ± 0.003</td>
		</tr><tr><td>Sementum</td>
			<td>1.197 ± 0.028</td>
			<td>67,28 ± 1,76</td>
			<td>0,011 ± 0,003</td>
		</tr><tr><td>Dentin</td>
			<td>1.188 ± 0.061</td>
			<td>60,22 ± 2,37</td>
			<td>0,002 ± 0,007</td>
		</tr><tr><td>Kjøtt</td>
			<td>1.179 ± 0.024</td>
			<td>55,14 ± 2,90</td>
			<td>0,013 ± 0,006</td>
		</tr><tr><td>Distal falanks</td>
			<td>1.191 ± 0.049</td>
			<td>65,95 ± 1,08</td>
			<td>0,013 ± 0,005</td>
		</tr><tr><td>Vertebral kropp</td>
			<td>1.194 ± 0.037</td>
			<td>66.14 ± 1.03</td>
			<td>0,008 ± 0,003</td>
		</tr><tr><td>Overlegen vertebral bue</td>
			<td>1.19 ± 0.017</td>
			<td>63.02 ± 1.23</td>
			<td>0,021 ± 0,009*</td>
		</tr><tr><td>Talus</td>
			<td>1.198 ± 0.010</td>
			<td>68.20 ± 1.24</td>
			<td>0,011 ± 0,003</td>
		</tr><tr><td>*Prøve KRA005 fjernet som uteligger kl. 0,1952</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tilgjengelighet av kode Alle analyseprogrammer og R-moduler som brukes i analysene av dette manuskriptet er fritt tilgjengelig fra sine respektive forfattere. All tilpasset R-kode er tilgjengelig på forespørsel.
Datatilgjengelighet Alle rådata som brukes i beregningen av representative resultater er fritt tilgjengelig i European Nucleotide Archive ENA data repository (tiltredelsesnummer PRJ-EB36983) eller supplerende materialer av Parker, C. et al.11.
Tilleggsfil 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63250/SupplementalFile1.xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Bone Sampling Protocols for the Retrieval of Ancient DNA from Archaeological Remains at JoVE.com

Optimized Bone Sampling Protocols for the Retrieval of Ancient DNA from Archaeological Remains

Protokollen presenterer en rekke beste praksis-protokoller for innsamling av beinpulver fra åtte anbefalte anatomiske prøvetakingssteder (spesifikke steder på et gitt skjelettelement) over fem forskjellige skjelettelementer fra middelalderske individer (radiokarbon datert til en periode på ca. 1040-1400 CE, kalibrert 2-sigma rekkevidde).

Optimaliserte benprøvetakingsprotokoller for gjenfinning av gammelt DNA fra arkeologiske rester

The methods presented here seek to maximize the chances for the recovery of human DNA from ancient archaeological remains while limiting input sample ...

Disse protokollene fungerer som retningslinjer for beste praksis for beinpulvergenerering for bruk i nedstrøms DNA-ekstraksjon over en rekke skjelettelementer. Det er noen få publiserte gamle DNA-prøvetakingsprotokoller for andre steder enn dentin og petrouspyramiden. I dag skal vi vise de detaljerte prøvetakingsmetodene for tre alternativer.Disse metodene viser også stort potensial for bruk med forringede rettsmedisinske levninger, men også som utgangspunkt for å utvikle lignende teknikker med ikke-menneskelige prøver. Utfør all prøvetaking i et dedikert rent rom, under en UV-lysutstyrt PCR-hette eller biosikkerhetsskap. Slå av luftstrømmen og spre steril aluminiumsfolie over benkeplaten for å fange opp bortkommen beinpulver eller fragmenter.Legg et ark med veiepapir i et sterilt veiebrett. Hold den dekontaminerte molaren ved emaljen med roten vendt ned over et veiebrett, ved hjelp av en håndholdt klemme. Utstyr en tannbor med et diamantkantet sirkulært skjærehjul.Når boret er satt til en middels hastighetsinnstilling, berører du lett kanten av boret til roten i en vinkel på omtrent 20 grader. Skrap prøven nedover i skuffen for å samle det gule, ytterste materialet fra roten. Stopp oppsamlingen når det lettere materialet i dentinet blir synlig.Overfør pulveret til et to milliliter LoBind Safe-Lock-rør, og registrer denne oppsamlede massen av pulver ved hjelp av en lukket balanse med en nøyaktighet på minst 0,01 milligram. Overfør pulveret fra veiepapiret til et to milliliter LoBind Safe-Lock-rør for ekstraksjon. Oppbevar dette røret ved 20 grader Celsius.Sørg for å gjenopprette alle beinfragmentene og så mye pulver som mulig. Bytt folien mellom hver prøvetaking, og kast den brukte folien i en autoklaverbar biohazardpose. Dekontaminerer arbeidsområdet og spre steril aluminiumsfolie over benken hver gang før du går videre til neste bein.Legg et lite ark veiepapir i et standard veiebrett. Fjern og kast det ytterste laget av det kortikale beinet i den overlegne vertebrale buen ved hjelp av en tannbor. Fest deretter ryggvirvlene i en håndklemme, med den spinøse prosessen utover og det overlegne aspektet ned.Mens du holder vertebraen, bor du oppover i midten av det V-formede hakket, dannet ved fusjon av den spinøse prosessen med lamellene med lav hastighet og høyt dreiemoment. Avslutt boring når det er et merkbart fall i motstanden. Endre boreposisjonen litt, og gjenta til 50 til 100 milligram beinpulver er samlet.Overfør beinpulveret fra veiepapiret til et to milliliter LoBind-rør for ekstraksjon, og oppbevar det ved 20 grader Celsius. Sørg for at alle beinfragmenter og så mye pulver som mulig gjenvinnes før du kaster en folie. Dekontaminerer arbeidsområdet og forbered deg på prøveinnsamling, som tidligere beskrevet.Legg et lite ark med veiepapir i et standard veiebrett. Hold taluskuppelen oppover, og medial overflate mot samleren, over veiebrettet. Skrap kortikale bein til en dybde på omtrent en millimeter fra talushalsen ved hjelp av en tannbor med en lavmålsbit satt til lav hastighet og høyt dreiemoment.Endre boreposisjonen og gjenta dette til ca. 50 til 100 milligram benpulver er samlet opp. Overfør dette beinpulveret fra veiepapiret til et to milliliter LoBind-rør for ekstraksjon. Oppbevar pulveret ved 20 grader Celsius på ubestemt tid.Oppbevar gjenværende bein og overflødig pulver i et tørt, temperaturkontrollert sterilt miljø ved 25 grader Celsius. Kast alt avfall i autoklav biohazard poser eller beholdere. Steriliser eller dekontaminerer alt gjenbrukbart utstyr og utsett det for UV mellom hver prøvetaking.Pars petrosa ga høyere endogent DNA enn de andre 23 anatomiske prøvetakingsstedene som ble undersøkt. De syv ekstra anatomiske prøvetakingsstedene som presenteres i denne protokollen, ga de nest høyeste utbyttene. De alternative stedene produserte konsekvent DNA-utbytter som er tilstrekkelige for standard populasjonsgenetiske analyser.Dupliseringsratene i bibliotekene som stammet fra alle anatomiske prøvetakingssteder var lave, noe som indikerer høy kompleksitet. Tennene, samt thorax vertebrae viste tilstrekkelig molekylær utvinning. En av de mest utfordrende aspektene ved beinprøvetaking er boreprosessen, for eksempel hvordan man holder en drill, hvor man skal bore, og når man skal stoppe boringen.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metyl-binding DNA-fangst Sekvense for Pasientservietter

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Verktøy for å studere rollen til Architectural Protein HMGB1 i behandlingen av Helix forvrenge, Site-spesifikke DNA Interstrand tverrbindinger

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genome-wide Fastsettelse av pattedyr Replication Timing av DNA innhold Measurement

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Rensing av High Molecular Weight Genomisk DNA fra meldugg for Long-Les Sekvense

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studier av celle-regulert genuttrykk av to komplementære cellesynkroniseringsprotokoller

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

Protokoller for C-Brick DNA Standard Assembly Bruke Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestemmelse av den optimale Chromosomal plassering(er) gir et DNA i Escherichia coli bruker en ny Transposon-mediert tilnærming

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

En universell protokoll for store gRNA biblioteket produksjon fra en DNA-kilde

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunostaining for DNA modifikasjoner: beregningsorientert analyse av AC Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolasjon og høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket konstruksjon for Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...