Name: optimized bone sampling protocols for the retrieval of ancient dna from archaeological remains
Uploaded: 2021-11-30T14:00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimized Bone Sampling Protocols for the Retrieval of Ancient DNA from Archaeological Remains at JoVE.com

Författarna vill tacka laboratoriepersonalen vid Max Planck-institutet för vetenskapen om mänsklig historia för deras hjälp vid utvecklingen och genomförandet av dessa protokoll. Detta arbete hade inte varit möjligt utan input och hårt arbete från Dr. Guido Brandt, Dr. Elizabeth Nelson, Antje Wissegot och Franziska Aron. Denna studie finansierades av Max Planck Society, Europeiska forskningsrådet (ERC) under Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horizon 2020 enligt bidragsavtal nr 771234 - PALEoRIDER (WH, ABR) och Starting Grant No. 805268 CoDisEASe (till KIB).

<ol>
	<li>Adler, C. J., Haak, W., Donlon, D., Cooper, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+and+recovery+of+DNA+from+ancient+teeth+and+bones.">Survival and recovery of DNA from ancient teeth and bones.</a> Journal of Archaeological Science. 38 (5), 956-964 (2011).</li><li>Dabney, J., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+highly+degraded+DNA+from+ancient+bones+and+teeth.">Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth.</a> Ancient DNA: Methods and Protocols. , 25-29 (2019).</li><li>Palsdottir, A. H., Bl&#228;uer, A., Rannam&#228;e, E., Boessenkool, S., Hallsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Not+a+limitless+resource:+ethics+and+guidelines+for+destructive+sampling+of+archaeofaunal+remains.">Not a limitless resource: ethics and guidelines for destructive sampling of archaeofaunal remains.</a> Royal Society Open Science. 6 (10), 191059 (2019).</li><li>Pinhasi, R., Fernandes, D. M., Sirak, K., Cheronet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+the+human+cochlea+to+generate+bone+powder+for+ancient+DNA+analysis.">Isolating the human cochlea to generate bone powder for ancient DNA analysis.</a> Nature Protocols. 14 (4), 1194-1205 (2019).</li><li>Latham, K. E., Miller, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+recovery+and+analysis+from+skeletal+material+in+modern+forensic+contexts.">DNA recovery and analysis from skeletal material in modern forensic contexts.</a> Forensic Sciences Research. 4 (1), 51-59 (2019).</li><li>Mundorff, A. Z., Bartelink, E. J., Mar-Cash, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+preservation+in+skeletal+elements+from+the+World+Trade+Center+disaster:+Recommendations+for+mass+fatality+management.">DNA preservation in skeletal elements from the World Trade Center disaster: Recommendations for mass fatality management.</a> Journal of Forensic Sciences. 54 (4), 739-745 (2009).</li><li>Gamba, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+flux+and+stasis+in+a+five+millennium+transect+of+European+prehistory.">Genome flux and stasis in a five millennium transect of European prehistory.</a> Nature Communications. 5 (1), 1-9 (2014).</li><li>Alberti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+DNA+sampling+of+ancient+bones+using+Computed+Tomography+scans.">Optimized DNA sampling of ancient bones using Computed Tomography scans.</a> Molecular Ecology Resources. 18 (6), 1196-1208 (2018).</li><li>Hansen, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ancient+DNA+preservation+in+petrous+bone+and+tooth+cementum.">Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170940 (2017).</li><li>Sirak, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+auditory+ossicles+as+an+alternative+optimal+source+of+ancient+DNA.">Human auditory ossicles as an alternative optimal source of ancient DNA.</a> Genome Research. 30 (3), 427-436 (2020).</li><li>Parker, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+systematic+investigation+of+human+DNA+preservation+in+medieval+skeletons.">A systematic investigation of human DNA preservation in medieval skeletons.</a> Scientific Reports. 10 (1), 18225 (2020).</li><li>Pinhasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+ancient+DNA+yields+from+the+inner+ear+part+of+the+human+petrous+bone.">Optimal ancient DNA yields from the inner ear part of the human petrous bone.</a> PLoS ONE. 10 (6), 0129102 (2015).</li><li>Sirak, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimally-invasive+method+for+sampling+human+petrous+bones+from+the+cranial+base+for+ancient+DNA+analysis.">A minimally-invasive method for sampling human petrous bones from the cranial base for ancient DNA analysis.</a> BioTechniques. 62 (6), 283-289 (2017).</li><li>. Minimally-invasive sampling of pars petrosa (os temporale) for ancient DNA extraction. protocols.io Available from: <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w">https://www.protocols.io/view/minimally-invasive-sampling-of-pars-petrosa-os-tem-bqd8ms9w</a> (2020)</li><li>Damgaard, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+access+to+endogenous+DNA+in+ancient+bones+and+teeth.">Improving access to endogenous DNA in ancient bones and teeth.</a> Scientific Reports. 5 (1), 1-12 (2015).</li><li>Harney, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimally+destructive+protocol+for+DNA+extraction+from+ancient+teeth.">A minimally destructive protocol for DNA extraction from ancient teeth.</a> Genome Research. 31 (3), 472-483 (2021).</li><li>Cooper, A., Poinar, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ancient+DNA:+Do+it+right+or+not+at+all.">Ancient DNA: Do it right or not at all.</a> Science. 289 (5482), 1139 (2000).</li><li>Llamas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+field+to+the+laboratory:+Controlling+DNA+contamination+in+human+ancient+DNA+research+in+the+high-throughput+sequencing+era.">From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era.</a> STAR: Science &amp; Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).</li><li>Llamas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+the+field+to+the+laboratory:+Controlling+DNA+contamination+in+human+ancient+DNA+research+in+the+high-throughput+sequencing+era.">From the field to the laboratory: Controlling DNA contamination in human ancient DNA research in the high-throughput sequencing era.</a> STAR: Science &amp; Technology of Archaeological Research. 3 (1), 1-14 (2017).</li><li>Boessenkool, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+bleach+and+mild+predigestion+improves+ancient+DNA+recovery+from+bones.">Combining bleach and mild predigestion improves ancient DNA recovery from bones.</a> Molecular Ecology Resources. 17 (4), 742-751 (2017).</li><li>Garc&#237;a-Garcer&#224;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragmentation+of+contaminant+and+endogenous+DNA+in+ancient+samples+determined+by+shotgun+sequencing;+Prospects+for+human+palaeogenomics.">Fragmentation of contaminant and endogenous DNA in ancient samples determined by shotgun sequencing; Prospects for human palaeogenomics.</a> PLoS ONE. 6 (8), 24161 (2011).</li><li>Malmstr&#246;m, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=More+on+contamination:+The+use+of+asymmetric+molecular+behavior+to+identify+authentic+ancient+human+DNA.">More on contamination: The use of asymmetric molecular behavior to identify authentic ancient human DNA.</a> Molecular Biology and Evolution. 24 (4), 998-1004 (2007).</li><li>Basler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduction+of+the+contaminant+fraction+of+DNA+obtained+from+an+ancient+giant+panda+bone.">Reduction of the contaminant fraction of DNA obtained from an ancient giant panda bone.</a> BMC Research Notes. 10, 754 (2017).</li><li>Kemp, B. M., Smith, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bleach+to+eliminate+contaminating+DNA+from+the+surface+of+bones+and+teeth.">Use of bleach to eliminate contaminating DNA from the surface of bones and teeth.</a> Forensic Science International. 154 (1), 53-61 (2005).</li><li>Korlevi&#263;, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reducing+microbial+and+human+contamination+in+DNA+extractions+from+ancient+bones+and+teeth.">Reducing microbial and human contamination in DNA extractions from ancient bones and teeth.</a> BioTechniques. 59 (2), 87-93 (2015).</li><li>Dabney, J., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+of+highly+degraded+DNA+from+ancient+bones+and+teeth.">Extraction of highly degraded DNA from ancient bones and teeth.</a> Methods in Molecular Biology. 1963, 25-29 (2019).</li><li>Hansen, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+ancient+DNA+preservation+in+petrous+bone+and+tooth+cementum.">Comparing ancient DNA preservation in petrous bone and tooth cementum.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0170940 (2017).</li><li>Gansauge, M. -. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-stranded+DNA+library+preparation+from+highly+degraded+DNA+using+T4+DNA+ligase.">Single-stranded DNA library preparation from highly degraded DNA using T4 DNA ligase.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 79 (2017).</li><li>Peltzer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EAGER:+efficient+ancient+genome+reconstruction.">EAGER: efficient ancient genome reconstruction.</a> Genome Biology. 17 (1), 60 (2016).</li><li>Korneliussen, T. S., Albrechtsen, A., Nielsen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ANGSD:+analysis+of+next+generation+sequencing+data.">ANGSD: analysis of next generation sequencing data.</a> BMC Bioinformatics. 15, 356 (2014).</li><li>Renaud, G., Hangh&#248;j, K., Willerslev, E., Orlando, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gargammel:+A+sequence+simulator+for+ancient+DNA.">Gargammel: A sequence simulator for ancient DNA.</a> Bioinformatics. 33 (4), 577-579 (2017).</li><li>Ponce de Le&#243;n, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+bony+labyrinth+is+an+indicator+of+population+history+and+dispersal+from+Africa.">Human bony labyrinth is an indicator of population history and dispersal from Africa.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (16), 4128-4133 (2018).</li><li>Nagaoka, T., Kawakubo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+petrous+part+of+the+temporal+bone+to+estimate+fetal+age+at+death.">Using the petrous part of the temporal bone to estimate fetal age at death.</a> Forensic Science International. 248, 188 (2015).</li><li>Nor&#233;n, A., Lynnerup, N., Czarnetzki, A., Graw, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+angle:+A+method+for+sexing+using+the+petrous+bone.">Lateral angle: A method for sexing using the petrous bone.</a> American Journal of Physical Anthropology. 128 (2), 318-323 (2005).</li></ol>

Författarna har inga intressekonflikter att rapportera.

Nuvarande praxis inom forntida mänsklig populationsgenetik är att företrädesvis ta prov från pars petrosa (steg 2.1) när det är möjligt. Pars petrosa kan dock vara ett svårt prov att få, eftersom det är högt värderat för en myriad av skelettbedömningar (t.ex. befolkningshistoria32, uppskattning av fostrets ålder vid död 33 och könsbestämning34), och historiskt sett kan provtagning av pars petrosa för DNA-analys vara mycket destruktiv 3,4 (inklusive protokollet som presenteras här, även om nya, minimalt invasiva protokoll 13,14 nu har antagits i stor utsträckning för att lindra denna oro). Detta förvärras av det faktum att man fram till helt nyligen inte hade försökt göra en storskalig, systematisk studie av mänsklig DNA-återhämtning över skelettet11, vilket gör det svårt att hitta en lämplig provtagningsstrategi när petrouspyramiden inte är tillgänglig.
Protokollen som presenteras här hjälper till att lindra den utmaningen genom att tillhandahålla en uppsättning optimerade procedurer för DNA-provtagning från arkeologiska/kriminaltekniska skelettrester inklusive pars petrosa samt sju alternativa anatomiska provtagningsplatser över ytterligare fyra skelettelement. De kritiska steg som ingår är alla avsedda att minimera risken för DNA-förlust/-skador på grund av antingen ineffektiv provtagning (steg 2.1.6 och 3.2.1.3) eller överhettning av prover under borrning/skärning (steg 3.1.6). Dessutom har det noterats i hela protokollet att det kan vara nödvändigt att ändra / utelämna förbehandlingsstegen för att säkerställa bästa prestanda i mycket nedbrutna prover. Det bör också noteras att även bland de utvalda elementen som presenteras här finns det fortfarande flera möjliga alternativa provtagningstekniker (särskilt för pars petrosa13,14), liksom gott om utrymme för ytterligare optimering av de underutnyttjade anatomiska provtagningsplatserna som presenteras här (dvs. talus: steg 2.5 och ryggkotorna: steg 2.3).
Det är också viktigt att komma ihåg att dessa protokoll har utformats och testats med gamla juvenila vuxna rester av hög kvalitet (bra morfologiskt bevarande) för endogena mänskliga DNA-analyser. De resultat som presenteras kanske inte sträcker sig till mer högupplösta material, andra bevarandesammanhang, spädbarnsrester, icke-mänskliga kvarlevor eller studier av patogener eller mikrobiomet, eftersom en större utforskning av användningen av dessa protokoll i ytterligare sammanhang fortfarande behövs. Dessutom kan de alternativa skelettelementen som presenteras här (tänderna, ryggkotorna, distala falanxen och tali) vara utmanande att tilldela en enda individ bland blandade rester, vilket kräver provtagning från flera element för att säkerställa ett enda ursprung. Trots dessa begränsningar kan att göra dessa protokoll allmänt tillgängliga hjälpa till att lindra en del av heterogeniteten kring provval och bearbetning genom att tillhandahålla ett generaliserat och kvantitativt optimerat ramverk för användning i ett brett spektrum av framtida aDNA / kriminaltekniska studier på mänskliga rester.

Provtagning av forntida mänskliga kvarlevor för DNA-återvinning och analys är i sig destruktiv 1,2,3,4. Proverna i sig är värdefulla exemplar och morfologiskt bevarande bör bevaras där så är möjligt. Som sådan är det absolut nödvändigt att provtagningsmetoderna optimeras för att både undvika onödig förstörelse av oersättligt material och för att maximera sannolikheten för framgång. Nuvarande tekniker för bästa praxis baseras på en liten kohort av studier som är begränsade till antingen rättsmedicinska undersökningar5,6, studier av forntida exemplar där utvecklingen av optimal provtagning inte är det direkta syftet med studien7, eller dedikerade studier som använder antingen icke-mänskliga kvarlevor8 eller riktar sig mot ett mycket litet urval av anatomiska provtagningsplatser (används här för att beteckna ett specifikt område av ett skelettelement från vilket benpulver, för användning i nedströms DNA-analyser, genererades)9,10. Provtagningsprotokollen som presenteras här optimerades i den första storskaliga systematiska studien av DNA-bevarande över flera skelettelement från flera individer11. Alla prover härrörde från skelettelement som återhämtats från 11 individer som grävts ut från kyrkkyrkogården i den övergivna medeltida bosättningen Krakauer Berg nära Peißen, Sachsen-Anhalt, Tyskland (se tabell 1 för detaljerad provdemografi) och kan som sådan behöva modifieras för användning med prover utanför detta geografiska/tidsmässiga intervall.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Individ</td>
			<td>Sex</td>
			<td>Beräknad ålder vid dödsfall</td>
			<td>14 C-datum (CE, Cal 2-sigma)</td>
		</tr><tr><td>KRA001</td>
			<td>Manlig</td>
			<td>25-35</td>
			<td>1058-1219</td>
		</tr><tr><td>KRA002</td>
			<td>Kvinnlig</td>
			<td>20-22</td>
			<td>1227-1283</td>
		</tr><tr><td>KRA003</td>
			<td>Manlig</td>
			<td>25</td>
			<td>1059-1223</td>
		</tr><tr><td>KRA004</td>
			<td>Manlig</td>
			<td>15</td>
			<td>1284-1392</td>
		</tr><tr><td>KRA005</td>
			<td>Manlig</td>
			<td>10-12</td>
			<td>1170-1258</td>
		</tr><tr><td>KRA006</td>
			<td>Kvinnlig</td>
			<td>30-40</td>
			<td>1218-1266</td>
		</tr><tr><td>KRA007</td>
			<td>Kvinnlig</td>
			<td>25-30</td>
			<td>1167-1251</td>
		</tr><tr><td>KRA008</td>
			<td>Manlig</td>
			<td>20</td>
			<td>1301-1402</td>
		</tr><tr><td>KRA009</td>
			<td>Manlig</td>
			<td>Okänd</td>
			<td>1158-1254</td>
		</tr><tr><td>KRA010</td>
			<td>Manlig</td>
			<td>25</td>
			<td>1276-1383</td>
		</tr><tr><td>KRA011</td>
			<td>Kvinnlig</td>
			<td>30-45</td>
			<td>1040-1159</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Genetiskt bestämt kön, arkeologiskt bestämd uppskattad ålder vid dödsfall och radiokoldatering (14C Cal 2-sigma) för alla de 11 individer som provtagits. Denna tabell har anpassats från Parker, C. et al. 202011.
Dessa protokoll möjliggör en relativt enkel och effektiv generering av benpulver från åtta anatomiska provtagningsplatser över fem skelettelement (inklusive pars petrosa) med begränsad laboratorieinducerad DNA-kontaminering. Av dessa fem skelettelement har sju anatomiska provtagningsplatser som finns på fyra skelettelement fastställts vara livskraftiga alternativ till den destruktiva provtagningen av petrouspyramiden11,12. Dessa inkluderar cementum-, dentin- och massakammaren i permanenta molarer; kortikala ben som samlats från det överlägsna ryggradsskåran såväl som från kroppen av bröstkotor; kortikalt ben som härrör från den underlägsna ytan av den apikala tuften och axeln hos de distala falangerna; och det täta kortikala benet längs den yttre delen av tali. Även om det finns flera allmänt tillämpade metoder för provtagning av pars petrosa 4,12,13,14, dentin och tandmassakammaren 1,2,15, publicerade metoder som beskriver den framgångsrika genereringen av benpulver från cementum 16 , ryggradskropp, sämre ryggradsskåra och talus kan vara svåra att få. Som sådan demonstrerar vi här optimerade provtagningsprotokoll för petrouspyramiden (steg 3.1); cementum (steg 3.2.1), dentin (steg 3.2.2) och tandmassa (steg 3.2.3) hos vuxna kindtänder, Kortikala ben i ryggkroppen (steg 3.3.1) och överlägsen kotbåge (steg 3.3.2). den distala falangen (steg 3.4); och talus (steg 3.5) för att göra effektiv användning av dessa skelettelement för både aDNA och rättsmedicinsk forskning mer tillgänglig.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#16 Dental Drill Bit</td>
			<td>NTI</td>
			<td>H1-016-HP</td>
			<td>example drilling bit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.6 mm scroll saw blade</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-097</td>
			<td>blade for Jewellers Saw</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>22mm diamond cutting wheel</td>
			<td>Kahla</td>
			<td>SKU 806 104 358 514 220</td>
			<td>Dremel cutting attachment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Commercial Bleach</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1818018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Control Company Ultra-Clean Supreme Aluminum Foil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-078-29X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA LoBind Tubes (2 mL)</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel 225-01 Flex Shaft Attachment</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>225-01</td>
			<td>Dremel flexible extension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel 4300 Rotary Tool</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>4300</td>
			<td>Example drill</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dremel collet and nut kit</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>4485</td>
			<td>Adapters for various Dremel tool attachments/bits</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eagle 33 Gallon Red Biohazard Waste Bag</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>17-988-501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf DNA LoBind 2 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-698-792</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol (Molecular Biology Grade)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1.08543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FDA approved level 2 Surgical Mask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-206-0397</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Comfort Nitrile Gloves</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-041-171X</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Safety Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>19-130-208X</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Granger Stationary Vise</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC1336173</td>
			<td>benchtop vise</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen UltraPure DNase/Rnase free distilled water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-977-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jewellers Saw</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-949-231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Sigma-Aldritch</td>
			<td>Z188956</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labconco Purifier Logic Biosafety cabinet</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>30-368-1101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LookOut DNA Erase</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>L9042-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium weighing boat</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS120223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSC 10pc plier/clamp set</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-129-5352</td>
			<td>Miscellaneous&#160;clamps/vise grips for securely holding samples while drilling/cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sartorius Quintix Semi-Micro Balance</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-560-019</td>
			<td>enclosed balance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyvek coveralls with hood</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-361-7X</td>
			<td>PPE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh paper</td>
			<td>Heathrow Scientific</td>
			<td>HS120116</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimized bone sampling protocols for the retrieval of ancient dna from archaeological remains

De metoder som presenteras här syftar till att maximera chanserna för återvinning av mänskligt DNA från forntida arkeologiska lämningar samtidigt som man begränsar ingående provmaterial. Detta gjordes genom att rikta in sig på anatomiska provtagningsplatser som tidigare bestämts för att ge de högsta mängderna av gammalt DNA (aDNA) i en jämförande analys av DNA-återhämtning över skelettet. Tidigare forskning har föreslagit att dessa protokoll maximerar chanserna för framgångsrik återhämtning av forntida mänskligt och patogen-DNA från arkeologiska rester. DNA-utbyten bedömdes tidigare av Parker et al. 2020 i en bred undersökning av aDNA-bevarande över flera skelettelement från 11 individer som återhämtats från den medeltida (radiokol daterad till en period av cirka (ca.) 1040-1400 CE, kalibrerad 2-sigma-intervall) kyrkogård vid Krakauer Berg, en övergiven medeltida bosättning nära Peißen Tyskland. Dessa åtta provtagningsfläckar, som spänner över fem skelettelement (pars petrosa, permanenta molarer, bröstkota, distal falanx och talus) gav framgångsrikt högkvalitativt gammalt mänskligt DNA, där avkastningen var betydligt större än det totala genomsnittet för alla element och individer. Avkastningen var tillräcklig för användning i de vanligaste populationsgenetiska analyserna nedströms. Våra resultat stöder den föredragna användningen av dessa anatomiska provtagningsplatser för de flesta studier som involverar analyser av forntida mänskligt DNA från arkeologiska lämningar. Genomförandet av dessa metoder kommer att bidra till att minimera förstörelsen av värdefulla arkeologiska exemplar.

I en separat studie 11 extraherades DNA från benpulver genererat från varje anatomisk provtagningsplats hos11 individer, med hjälp av ett standard-DNA-extraktionsprotokoll optimerat för korta fragment från förkalkad vävnad2. Enkelsträngade bibliotek producerades sedan 28 och sekvenserades på en HiSeq 4000 (75 bp parkopplad ände) till ett djup av ~20 000 000 läsningar per prov. De resulterande sekvensdata utvärderades sedan för endogent humant DNA-innehåll med hjälp av EAGER pipeline29 (BWA-inställningar: Frölängd på 32, 0,1 felaktig matchningsstraff, kartläggningskvalitetsfilter på 37). Alla representativa resultat rapporteras med samma mätvärden som Parker et al. 202011 för konsekvens. Bibliotek från de pulveriserade delarna av pars petrosa gav i genomsnitt högre endogent DNA än någon av de andra 23 undersökta anatomiska provtagningsplatserna (figur 6A-B). De sju ytterligare anatomiska provtagningsplatserna som presenteras i detta protokoll (cementum, första passet av tandmassakammaren och dentin av permanenta molarer; kortikalt ben från ryggradskroppen och överlägsen ryggradsbåge i bröstkotan; kortikalt ben från den distala falanxens apikala tuft; och kortikalt ben från talushalsen) gav de näst högsta utbytena (utan statistisk signifikans mellan dessa anatomiska provtagningsplatser; Figur 6A-B; Kompletterande fil 1: EndogenousDNAPreCap). Dessa alternativa platser producerade alla konsekvent DNA-utbyten som är tillräckliga för standardpopulationsgenetiska analyser såsom mitokondriella analyser och SNP-analyser (single nucleotide polymorphism). Dupliceringsfrekvensen i bibliotek som härrör från alla anatomiska provtagningsplatser var låg (klusterfaktorer tabell 2; Kompletterande fil 1: ClusterFactor), vilket indikerar att alla bibliotek som screenades var mycket komplexa. På samma sätt var genomsnittliga exogena uppskattningar av mänsklig DNA-kontaminering låga, i genomsnitt < 2% (X-kromosomkontaminering hos män, n = 7, som rapporterats av ANGSD30-rörledningen) på alla anatomiska provtagningsplatser utom den överlägsna ryggradsbågen (genomsnittlig uppskattad kontaminering: 2,11%, med ett prov avlägsnat som en outlier; KRA005: 19,52 %, se tabell 2; Kompletterande fil 1: Xcontamination). Den genomsnittliga fragmentlängden (efter filtrering för att avlägsna alla läsningar < 30 bp) var lägst i materialet som samlats in från tandmassakammaren och dentinet, utan någon signifikant variation mellan andra anatomiska provtagningsplatser (55,14 bp respektive 60,22 bp jämfört med en genomsnittlig median på 62,87, parvisa p-värden < 0,019, tabell 2; Kompletterande fil 1: AvgFragLength). Dessutom innehåller tänderna och bröstkotorna var och en flera anatomiska provtagningsplatser där hög endogen DNA-återhämtning observerades, vilket gör dem särskilt lämpliga som alternativ till pars petrosa.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63250/63250fig06.jpg"> Figur 6: Mänskligt DNA-innehåll för alla screenade prover. Svarta linjer representerar det totala medelvärdet, medan röda linjer representerar medianen (heldragen: mänsklig DNA-andel, streckad: mappade mänskliga läsningar per miljon genererade läsningar). Enskilda anatomiska provtagningsplatser med en genomsnittlig mänsklig DNA-andel högre än det totala medelvärdet (8,16%) färgas i alla analyser. (A) Andelen läsningar som mappar till hg19-referensgenomet. Den blå streckade linjen representerar det teoretiska maximumet givet rörledningens kartläggningsparametrar (genereras med Gargammel31 för att simulera en slumpmässig fördelning på 5 000 000 läsningar från hg19-referensgenomet med simulerad skada). Individuella medelvärden (svart X) och medianer (röd cirkel) rapporteras för de prover med en högre genomsnittlig mänsklig DNA-andel än det totala medelvärdet. Konfidensintervall anger övre och nedre gränser exklusive statistiska extremvärden. (B) Antalet unika läsningar som mappas till hg19-referensgenomet per miljon läsningar av sekvenseringsansträngning (75 bp parad ände). Konfidensintervall anger övre och nedre gränser exklusive statistiska extremvärden. Denna siffra har anpassats från Parker, C. et al. 202011. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63250/63250fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tabell 2: Genomsnittliga dupliceringsnivåer (kartläggning av läsningar/unika läsningar), genomsnittliga fragmentlängder och medianfragmentlängder och X-kromosomkontamineringsuppskattningar för alla anatomiska provtagningsplatser. Fel som rapporterats som medelvärdets standardfel. Denna tabell har anpassats från Parker, C. et al. 202011.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Provtagningsplats</td>
			<td>Genomsnittlig dupliceringsfaktor (# mappade läsningar /# unika mappade läsningar)</td>
			<td>Genomsnittlig fragmentlängd i bp</td>
			<td>Genomsnittlig uppskattad andel X-kromosomkontaminering</td>
		</tr><tr><td>Petrous pyramid</td>
			<td>1.188 ± 0.006</td>
			<td>65.40 ± 1.36</td>
			<td>0,000 ± 0,003</td>
		</tr><tr><td>Cementum</td>
			<td>1.197 ± 0.028</td>
			<td>67,28 ± 1,76</td>
			<td>0,011 ± 0,003</td>
		</tr><tr><td>Dentin</td>
			<td>1.188 ± 0.061</td>
			<td>60.22 ± 2.37</td>
			<td>0,002 ± 0,007</td>
		</tr><tr><td>Fruktkött</td>
			<td>1.179 ± 0.024</td>
			<td>55.14 ± 2.90</td>
			<td>0,013 ± 0,006</td>
		</tr><tr><td>Distal falang</td>
			<td>1.191 ± 0,049</td>
			<td>65,95 ± 1,08</td>
			<td>0,013 ± 0,005</td>
		</tr><tr><td>Ryggradskropp</td>
			<td>1.194 ± 0.037</td>
			<td>66.14 ± 1.03</td>
			<td>0,008 ± 0,003</td>
		</tr><tr><td>Överlägsen ryggradsbåge</td>
			<td>1.19 ± 0,017</td>
			<td>63.02 ± 1.23</td>
			<td>0,021 ± 0,009*</td>
		</tr><tr><td>Talus</td>
			<td>1.198 ± 0.010</td>
			<td>68.20 ± 1.24</td>
			<td>0,011 ± 0,003</td>
		</tr><tr><td>*Prov KRA005 borttaget som avvikande värde vid 0,1952</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Kod tillgänglighet Alla analysprogram och R-moduler som används i analyserna av detta manuskript är fritt tillgängliga från sina respektive författare. All anpassad R-kod är tillgänglig på begäran.
Tillgänglighet för data Alla rådata som används vid beräkningen av representativa resultat är fritt tillgängliga i ENA:s dataarkiv European Nucleotide Archive (anslutningsnummer PRJ-EB36983) eller kompletterande material från Parker, C. et al.11.
Kompletterande fil 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63250/SupplementalFile1.xlsx" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här filen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimized Bone Sampling Protocols for the Retrieval of Ancient DNA from Archaeological Remains at JoVE.com

Optimized Bone Sampling Protocols for the Retrieval of Ancient DNA from Archaeological Remains

Protokollet presenterar en serie protokoll för bästa praxis för insamling av benpulver från åtta rekommenderade anatomiska provtagningsplatser (specifika platser på ett givet skelettelement) över fem olika skelettelement från medeltida individer (radiokol daterat till en period av ca 1040-1400 CE, kalibrerat 2-sigma-intervall).

Optimerade benprovtagningsprotokoll för hämtning av forntida DNA från arkeologiska lämningar

The methods presented here seek to maximize the chances for the recovery of human DNA from ancient archaeological remains while limiting input sample ...

Dessa protokoll fungerar som riktlinjer för bästa praxis för benpulvergenerering för användning i nedströms DNA-extraktion över en rad skelettelement. Det finns några publicerade gamla DNA-provtagningsprotokoll för andra platser än dentinet och petrouspyramiden. Idag visar vi de detaljerade provtagningsmetoderna för tre alternativ.Dessa metoder visar också stor potential för användning med försämrade forensiska lämningar, men också som en baslinje för att utveckla liknande tekniker med icke-mänskliga exemplar. Utför all provtagning i ett dedikerat renrum, under en UV-ljusutrustad PCR-huva eller biosäkerhetsskåp. Stäng av luftflödet och sprid steril aluminiumfolie över bänkskivan för att fånga upp eventuellt benpulver eller fragment.Lägg ett ark vägpapper i en steril vägningsbricka. Håll den dekontaminerade molaren vid emaljen med roten nedåt över en vägningsbricka med en handhållen klämma. Utrusta en tandborr med ett diamantkantat cirkulärt skärhjul.Med borren inställd på en medelhastighetsinställning, rör lätt borrens kant mot roten i en vinkel på cirka 20 grader. Skrapa provet nedåt i brickan för att samla det gula, yttersta materialet från roten. Stoppa insamlingen när dentinets lättare material blir synligt.Överför pulvret till ett två milliliter LoBind Safe-Lock-rör och registrera denna uppsamlade massa pulver med en sluten balans med en noggrannhet på minst 0,01 milligram. Överför pulvret från vägpapperet till ett två milliliter LoBind Safe-Lock-rör för extraktion. Förvara detta rör vid 20 grader Celsius.Se till att återställa alla benfragment och så mycket pulver som möjligt. Byt folie mellan varje provtagning och kassera den använda folien i en autoklaverbar biohazardpåse. Dekontaminera arbetsområdet och sprid steril aluminiumfolie över bänkskivan varje gång innan du flyttar till nästa ben.Lägg ett litet ark vägpapper i en vanlig vägningsbricka. Ta bort och kassera det yttersta lagret av det kortikala benet i den överlägsna ryggradsbågen med hjälp av en tandborr. Säkra sedan kotorna i en handklämma, med den spinösa processen utåt och överlägsen aspekt nedåt.Medan du håller ryggkotan, borra uppåt i mitten av det V-formade skåran, bildat genom fusion av den spinösa processen med lamellerna med låg hastighet och högt vridmoment. Sluta borra när det finns en märkbar minskning av motståndet. Ändra borrpositionen något och upprepa tills 50 till 100 milligram benpulver samlas in.Överför benpulvret från vägpapperet till ett LoBind-rör på två milliliter för extraktion och förvara det vid 20 grader Celsius. Se till att alla benfragment och så mycket pulver som möjligt återvinns innan du kasserar en folie. Dekontaminera arbetsområdet och förbered för provtagning, som tidigare beskrivits.Lägg ett litet ark vägpapper i en vanlig vägningsbricka. Håll taluskupolen uppåt och den mediala ytan mot kollektorn över vägningsbrickan. Skrapa kortikala ben till ett djup av ungefär en millimeter från talushalsen med hjälp av en tandborr med en lågmätare inställd på låg hastighet och högt vridmoment.Ändra borrpositionen och upprepa detta tills cirka 50 till 100 milligram benpulver har samlats in. Överför detta benpulver från vägpapperet till ett två milliliter LoBind-rör för extraktion. Förvara pulvret vid 20 grader Celsius på obestämd tid.Förvara återstående ben och överflödigt pulver i en torr, temperaturkontrollerad steril miljö vid 25 grader Celsius. Kassera allt avfall i autoklav biohazard påsar eller behållare. Sterilisera eller sanera all återanvändbar utrustning och utsätt den för UV mellan varje provtagning.Pars petrosa gav högre endogent DNA än de andra 23 undersökta anatomiska provtagningsplatserna. De sju ytterligare anatomiska provtagningsplatserna som presenteras i detta protokoll gav de näst högsta utbytena. De alternativa platserna producerade konsekvent DNA-utbyten som är tillräckliga för standardpopulationsgenetiska analyser.Dupliceringsfrekvensen i bibliotek som härrör från alla anatomiska provtagningsplatser var låg, vilket indikerar hög komplexitet. Tänderna, liksom bröstkotorna visade tillräcklig molekylär återhämtning. En av de mest utmanande aspekterna av benprovtagning är borrningsprocessen, till exempel hur man håller en borr, var man ska borra och när man ska sluta borra.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Metyl-bindande DNA fånga sekvensering för patientvävnader

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Tools to Study the Role of Architectural Protein HMGB1 in the Processing of Helix Distorting, Site-specific DNA Interstrand Crosslinks

Verktyg för att studera betydelsen av Architectural Protein HMGB1 i behandlingen av Helix snedvrida, Platsspecifik DNA Interstrand tvärbindningar

High mobility group box 1 (HMGB1) protein is a non-histone architectural protein that is involved in regulating many important functions in the genome, ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Genomvid Fastställande av däggdjur Replication Timing av DNA-innehåll Mätning

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Purification of High Molecular Weight Genomic DNA from Powdery Mildew for Long-Read Sequencing

Rening av hög molekylvikt Genomiskt DNA från mjöldagg för lång Läs Sequencing

The powdery mildew fungi are a group of economically important fungal plant pathogens. Relatively little is known about the molecular biology and genetics ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studierande cellcykelreglerade genuttryck av två komplementära cellsynkroniseringsprotokoll

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

Protokoll för C-Brick-DNA-standardmontering med användning av Cpfl

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestämning av optimala kromosomala belägenheten för ett DNA-Element i Escherichia coli använder en ny metod för Transposon-medierad

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

Ett universellt protokoll för storskaliga gärna biblioteket produktion från någon DNA-källa

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

Immunfärgning för DNA ändringar: tillämpad analys av Confocal bilder

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolering och hög genomströmning sekvensering bibliotek konstruktion för herbarieexemplar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...