Protokollet visar en pålitlig och reproducerbar metod för att isolera och odla endotelceller med hög renhet från möss som kan ha flera applikationer. Denna teknik är en enklare metod som bevarar utbytet och renheten hos endotelceller. Demonstrerar proceduren kommer att vara Nina Nguyen, en personalforskningsassistent från mitt laboratorium.
För att börja, virvla de magnetiska pärlorna i några sekunder. Pipettera 50 mikroliter av pärlorna i två 1,5 milliliters mikrocentrifugrör för CD31 och CD102. Tillsätt en milliliter pärltvättbuffert och blanda väl.
Placera rören på en magnetisk separator och ta bort supernatanten med en Pasteur-pipett av glas. Återsuspendera pärlorna i 50 mikroliter pärltvättbuffert. Tillsätt sedan fem mikroliter eller 2,5 mikrogram CD31- eller CD102-antikropp till varje 50 mikroliter pärlor.
Inkubera strängupphängning med försiktig rotation på en ändrotator över natten vid fyra grader Celsius eller i tre timmar vid rumstemperatur. Tvätta immunpärlor fyra gånger och resuspendera sedan immunkulorna i 50 mikroliter pärltvättbuffert. På isoleringsdagen tillsätt 25 ml HBSS till 25 milligram kollagenas av typ ett och inkubera det med försiktig rotation.
Filtrera sedan med ett 22 mikrometerfilter. Efter att ha avlivat en fem till sju dagar gammal musvalp, spraya slaktkroppen med 70% etanol. Skär sedan membranet överlägset uppåt längs hela bröstets sidoväggar för att exponera brösthålan.
Injicera fem milliliter kall DMEM i hjärtats högra kammare tills lungorna blir vita. Skär sedan loberna distala till motsvarande bronkier en efter en för att ta bort lungorna. Dra lungloberna i ett 50 ml koniskt rör förfyllt med 20 ml iskallt basalmedium.
Skaka försiktigt röret för hand i 10 till 15 sekunder för att tvätta eventuella överskott av röda blodkroppar. Ta bort lungorna från mediet med en cellsil och haka med steriliserad sax. Överför den malet vävnaden till 50 ml koniska röret med 25 ml förvärmd kollagenaslösning.
Skaka försiktigt på en roterande mixer. Fäst en 20 ml spruta på en 15 gauge trubbig kanyl och triturera suspensionen kraftigt utan att skumma 10 till 15 gånger i en cellulär suspension. Filtrera suspensionen genom en 70 mikrometer cellsil i ett 50 ml koniskt rör.
Skölj sedan det koniska röret som används för matsmältningen och cellsilen med 15 ml basalmedium. Centrifugera cellsuspensionen vid 400 gånger G i åtta minuter vid fyra grader Celsius. Återsuspendera pelleten i två milliliter komplett medium.
Tillsätt åtta milliliter komplett medium och inkubera det. Följande dag, tvätta kolvarna två gånger med 10 ml HBSS utan kalcium och magnesium och tillsätt 10 ml komplett medium. När cellerna är 90 till 95% sammanflytande är de redo för primär immunopärlisolering.
Tvätta vidhäftande endotelceller två gånger med 10 ml HBSS utan kalcium och magnesium. Tillsätt två milliliter trypsinfri cellavskiljningslösning och inkubera den för att säkerställa att alla celler lyfts från kolven. Tillsätt åtta milliliter basalmedium.
Snurra sedan ner cellerna vid 400 gånger G i fyra minuter vid rumstemperatur och resuspendera dem i två milliliter av basalmediet. Vortex anti-CD31-belagda pärlor i några sekunder för att återsuspendera pärlorna. Tillsätt 30 mikroliter pärlor för varje två milliliter cellsuspension och säkra locket.
Inkubera röret i 10 minuter vid rumstemperatur på en ändrotator. Placera sedan rören på en magnetisk separator i två minuter. Aspirera supernatanten och ta bort röret från magneten.
Resuspendera pärlcellpelleten genom att tillsätta tre milliliter basalmedium till röret och pipettera upp och ner flera gånger. Byt ut röret på magnetseparatorn i två minuter. Aspirera sedan försiktigt supernatanten med en glaspasteurpipett.
Efter den slutliga tvätten, när supernatanten blir klar, suspendera pärlcellpelleten i tre milliliter komplett tillväxtmedium och överför den till en T75-kolv. Tillsätt sju ml av hela tillväxtmediet och inkubera det. Nästa dag, tvätta cellerna igen med HBSS utan kalcium och magnesium.
Tillsätt sedan 10 ml komplett medium. När cellerna är 90 till 95% sammanflytande är de redo för sekundär immunobeadisolering. Det första immunobeadvalet identifierar de CD31-positiva cellerna, som växer i en kullerstensformation.
Ett andra immunpärlval med anti-CD102-belagda pärlor ökar endotelcellrenheten och fluorescensaktiverad cellsortering används för att bekräfta att cellpopulationen är CD31-positiv och CD102-positiv. För att studera endotelinflammatoriska vägar och endotelbarriärfunktion användes behandling med murin Cytomix för att inducera signifikant IL-6-produktion av endotelceller med ett P-värde på mindre än 0,01. Dessutom minskade transendotelresistensen och visade ökad endotelpermeabilitet.
Isolerade endotelceller kan användas i endotelcellsstimulering eller barriärfunktionsanalyser för att upptäcka endotelbaserade terapeutiska mål för endoteldysfunktionsstörningar.
