Name: quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microrna expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment
Uploaded: 2022-04-29T13:00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment at JoVE.com

<ol>
	<li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+regulatory+role+of+lncRNA-miRNA-mRNA+axis+in+cardiovascular+diseases.">The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).</li><li>Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA-106b-5p+in+human+cancers:+diverse+functions+and+promising+biomarker.">MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211 (2020).</li><li>Lu, T. X., Rothenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA.">MicroRNA.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).</li><li>McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+breast+cancer:+the+potential+of+miRNA+for+diagnosis+and+treatment+monitoring.">Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).</li><li>Bjorkman, S., Taylor, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+endometriosis:+biological+function+and+emerging+biomarker+candidates.">MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates.</a> Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).</li><li>Zhou, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+and+circRNA+expression+patterns+in+mouse+brain+during+toxoplasmosis+development.">miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development.</a> BMC Genomics. 21 (1), 46 (2020).</li><li>Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulated+miRNA-26a-5p+induces+the+apoptosis+of+endothelial+cells+in+coronary+heart+disease+by+inhibiting+PI3K/AKT+pathway.">Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Bala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+exosomes+indicate+hepatocyte+injury+and+inflammation+in+alcoholic,+drug-induced,+and+inflammatory+liver+diseases.">Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases.</a> Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).</li><li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease.">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research. 237, 31-52 (2021).</li><li>Mastropasqua, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNA+levels+in+diabetes+mellitus.">Serum microRNA levels in diabetes mellitus.</a> Diagnostics (Basel). 11 (2), 284 (2021).</li><li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+detection+in+prostate+tumors+by+quantitative+real-time+PCR+(qPCR).">MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874 (2012).</li><li>Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+accurate+analysis+of+microRNA+using+a+specific+extension+sequence.">Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence.</a> Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).</li><li>Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+changes+With+the+aging+kidney.">Structural and functional changes With the aging kidney.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).</li><li>Weinstein, J. R., Anderson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+kidney:+physiological+changes.">The aging kidney: physiological changes.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+array-based+gene+expression+profiles+by+real-time+(kinetic)+RT-PCR.">Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).</li><li>Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+quantitative+RT-PCR+array+in+miRNA+expression+profiling+and+comparison+with+microarray+analysis.">Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis.</a> BMC Genomics. 10, 407 (2009).</li><li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate.">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate.</a> BMC Genomics. 6, 59 (2005).</li><li>Petriella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+profiling+in+serum+and+tissue+samples+to+assess+noninvasive+biomarkers+for+NSCLC+clinical+outcome.">miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome.</a> Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).</li><li>Skrzypa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-146a-5p+is+upregulated+in+serum+and+cartilage+samples+of+patients+with+osteoarthritis.">miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis.</a> Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).</li><li>Farzanehpour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+tissue+miRNAs:+potential+biomarkers+for+the+diagnosis+of+cervical+cancer.">Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer.</a> Journal of Virology Journal. 16 (1), 116 (2019).</li></ol>

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لديهما تضارب في المصالح.

تم تحديد مستويات التعبير عن miRNAs المستهدفة بنجاح بواسطة البروتوكول الموصوف أعلاه باستخدام qRT-PCR. يعد تقييم الحمض النووي الريبوزي المرسال المستخرج خطوة مهمة في الحصول على بيانات qRT-PCR ذات مغزى. لتأكيد الجودة الكافية للحمض النووي الريبوزي المرسال قبل إجراء qRT-PCR ، يجب استخدام قياس الطيف الضوئي لتحديد نسبة الامتصاص عند 260 نانومتر إلى تلك الموجودة عند 280 نانومتر. قد يحدث تلوث الحمض النووي ، و / أو قد تكون dimers التمهيدي في كل بئر من لوحة التفاعل موجودة إذا لم يوفر qRT-PCR تضخيما واحدا ل PCR للطول المتوقع ودرجة حرارة الانصهار ، أو إذا كان يوفر منحنى ذوبان أحادي الوسائط.
يمكن تقييم مستويات تعبير MiRNA بعدة طرق أخرى غير qRT-PCR ، بما في ذلك النشاف الشمالي ، والمصفوفة الدقيقة ، وفحوصات حماية الريبونوكلياز. ومع ذلك ، فإن طريقة qRT-PCR هي إجراء حساس ودقيق وبسيط وقابل للتكرار يتطلب حجم عينة أصغر من تلك المطلوبة لفحوصات حماية النشاف الشمالي والريبونوكلياز19. نظرا لأن المصفوفات الدقيقة يمكنها قياس تعبير عشرات الآلاف من miRNAs في وقت واحد ، فيمكن استخدامها لتحديد علامات miRNA المرشحة. تظهر بيانات Microarray أيضا ارتباطا عاما عاليا بالبيانات التي تم الحصول عليها بواسطة qRT-PCR20. ومع ذلك، لم يتم التوصل إلى توافق في الآراء بشأن المنهجية المثلى لمقارنة بيانات المصفوفات الدقيقة التي تم الحصول عليها في دراسات مختلفة21.
يحتوي تقييم miRNAs في المصل على الميزات التالية. أولا ، من السهل جمع المصل ، وبما أن miRNAs في المصل مستقرة ضد التجميد والذوبان ودرجة الحرارة والحمض ، يمكن أن تكون miRNAs مؤشرات حيوية جيدة. ثانيا ، هناك تماثل كبير لل miRNAs بين الأنواع ، ويتم استقراء نتائج التجارب على الحيوانات بسهولة للبشر. ثالثا ، أظهرت miRNAs في المصل إمكانية استخدامها كأدوية علاجية3. وقد أظهرت العديد من الدراسات أيضا أن مستوى التعبير عن miRNA في الأعضاء يرتبط مع miRNA في المصل 22،23،24. في هذه الدراسة ، لم تظهر miRNA-223-3p ، التي لم تظهر مستويات الكلى فيها فرقا كبيرا بين الفئران SAMR1 و SAMP1 ، أي فرق كبير بين السلالة في المصل. في المقابل ، أظهر miRNA-7218-5p و miRNA-7219-5p ، اللذان أظهرت مستويات الكلى بينهما فرقا كبيرا بين الفئران SAMR1 و SAMP1 ، اختلافات كبيرة بين السلالة في المصل.
يحتوي هذا البروتوكول على القيود التالية. أولا ، لم يتم التحقق من فائدته في أعضاء أخرى مثل الكبد والرئة ، وثانيا ، لم يتم اختباره على المختبر الأخرى مثل الفئران والكلاب والخنازير. استخدمت العديد من مجموعات البحث هذا البروتوكول لتنقية واكتشاف الحمض النووي الريبوزي المرسال بواسطة qRT-PCR وأفادت بأن هذا البروتوكول مكن من تنقية الحمض النووي الريبي عالي الجودة من الأنسجة والمصل 13،14،22،23،24. وقد ثبت أن هذه الطريقة لديها دقة وحساسية عالية للكشف عن التعبير عن miRNAs13،14،22،23،24. تظهر نتائج هذه الدراسة أن هذا البروتوكول يمكن أن يكتشف بنجاح تعبير miRNA في مصل وكلية الفئران. لذلك ، يمكن استخدام البروتوكول لتحديد ملامح تعبير miRNA في المصل والكلى في الفئران مع مجموعة متنوعة من الأمراض. نظرا لبساطة البروتوكول ، يمكن معالجة عدد كبير من العينات في وقت واحد. يمكن لتحليلات التعبير عن العديد من miRNAs في مختلف الحالات المرضية للكلية ، وبالتالي ، استخدام البروتوكول الموضح هنا.
هناك جوانب معينة من البروتوكول يجب وضعها في الاعتبار. لتجنب تدهور الحمض النووي الريبوزي المرسال المنقى الذي قد يحدث في درجة حرارة الغرفة، يجب أن تبقى الحمض النووي الريبوزي المرسال على الجليد. يجب تجانس عينات الكلى حتى يتم إذابتها بالكامل في كاشف التحلل. تحتوي كلية الفأر على كمية كبيرة من النسيج الضام غير القابل للذوبان في كاشف التحلل ، وبالتالي يلزم وجود جهاز تمزيق عمود لمزيد من التجانس. بالإضافة إلى ذلك ، يجب التحقق من صحة miRNA التحكم الداخلي المناسب (مع تعبير مستقر بين العينات) طوال إعداد تجربة qRT-PCR. وذلك لأن تداخل المواد المختلفة أثناء أداء هذا البروتوكول يمكن أن يغير مستويات التعبير عن الحمض النووي الريبوزي المرسال (miRNAs) للتحكم الداخلي ، مما قد يعرض النتائج للخطر. في الختام ، تصف هذه الورقة بروتوكول qRT-PCR للكشف عن وتنقية وتقييم تعبير miRNA في مصل وكلية الفئران المصابة باختلال كلوي يعتمد على العمر.

من المعروف أن التعبير عن مختلف الحمض النووي الريبوزي المرسال الذي يلعب أدوارا مهمة في كل من علم وظائف الأعضاء والمرض (على سبيل المثال ، الالتهاب والتليف والاضطرابات الأيضية والسرطان) يتم تنظيمه بواسطة miRNAs ، وهي RNAs قصيرة وغير مشفرة تسبب التدهور وتمنع نسخ mRNA1. لذلك ، من الممكن أن تكون بعض miRNAs بمثابة مؤشرات حيوية مرشحة جديدة و / أو أهداف علاجية لمختلف الأمراض2،3،4،5. تم إجراء الأبحاث على ملامح تعبير miRNA في مجموعة متنوعة من أعضاء وأنسجة الفئران (بما في ذلك الدماغ6 والقلب7 والرئة8 والكبد9 والكلى10). ومع ذلك ، لا توجد طرق قياسية أو ثابتة لاستخراج وتقييم miRNAs في الكلى أو مصل الفئران المصابة باختلال كلوي يعتمد على العمر.
لذلك ، أنشأنا بروتوكولا يمكن استخدامه لتنقية واكتشاف تعبير miRNA بشكل موثوق في مصل وكلية الفئران المصابة باختلال كلوي يعتمد على العمر. وهناك ست خطوات رئيسية في البروتوكول: (1) إعداد كل من الفئران الذكور SAMR1 البالغة من العمر 50 أسبوعا والفئران الذكور SAMP1؛ (2) إعداد كل من الفئران الذكور SAMR1 البالغة من العمر 50 أسبوعا والفئران الذكور SAMP1؛ (2) إعداد كل من الفئران الذكور SAMR1 البالغة من العمر 50 أسبوعا والفئران الذكور SAMP1؛ (2) إعداد كل من الفئران الذكور SAMR (2) استخراج عينات الدم من الوريد الأجوف السفلي لكلتا السلالتين من الفئران ، مع الاستخدام اللاحق لأنبوب سبيتز مع الهيبارين ، يليه الطرد المركزي ، للحصول على عينة مصل ؛ (3) استخراج عينة الكلى من الفئران - يتم استخدام مجانس السيليكون لتجانس عينة الكلى بشكل منفصل ، ثم يتم نقل العينة إلى نظام تمزيق البوليمر الحيوي على عمود دوران جهاز الطرد المركزي الدقيق11 ؛ (4) إجمالي استخراج الحمض النووي الريبي (الذي يحتوي على miRNA) من عينات المصل باستخدام عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا12 وإجمالي الحمض النووي الريبي الذي يحتوي على استخراج miRNA من عينات الكلى باستخدام عمود الدوران القائم على غشاء السيليكا11 ؛ (5) تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) من الحمض النووي الريبي الكلي باستخدام النسخ العكسي ، بوليميراز البولي (A) ، وأوليغو-دي تي التمهيدي13،14 ؛ و (6) أخيرا ، تحديد تعبير miRNA باستخدام qRT-PCR وصبغة متداخلة13,14.
استند هذا البروتوكول الجديد إلى دراسات نجحت في استخراج وتقييم الحمض النووي الريبوزي المرسال في أنواع مختلفة من الأنسجة11،12،13. وقد ثبت أن نظام تمزيق البوليمر الحيوي في البروتوكول قادر على تنقية الحمض النووي الريبي الكلي عالي الجودة من الأنسجة11. تم تحديد دقة وحساسية جوانب هذا البروتوكول المستخدم لتقييم تعبير miRNA بواسطة qRT-PCR مع صبغة متداخلة13,14 ، على سبيل المثال ، تخليق cDNA مع النسخ العكسي ، بوليميراز بولي (A) ، وأوليغو-dT الاشعال من الحمض النووي الريبي الكلي المستخلص. يتمتع البروتوكول الجديد بالعديد من المزايا: البساطة وتوفير الوقت وتقليل الأخطاء الفنية. وبالتالي ، يمكن استخدامه للتحقيقات التي تتطلب تحديد دقيق وحساس لملامح الكلى والدم miRNA. يمكن لدراسات العديد من الحالات المرضية أيضا استخدام البروتوكول الجديد.
يمكن تحديد ملامح تعبير miRNA في فئران SAMP1 ، والتي تعد نموذجا للاختلال الكلوي المعتمد على العمر ، كما هو موضح أدناه. في البشر ، يرتبط القصور الكلوي المعتمد على العمر بتطور الفشل الكلوي ويتميز بزيادة في مساحة التليف الخلالي الكلوي وتطور تصلب الكبيبات15,16. القصور الكلوي المعتمد على العمر هو أيضا سمة مهمة ومتكررة لأمراض الكلى المزمنة وأمراض الكلى في المرحلة النهائية15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL spitz with heparin</td>
			<td>Greiner-bio-one</td>
			<td>450534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-223-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003871</td>
			<td>5&#39;-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU 
			G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-423-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00012005</td>
			<td>5&#39;-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU 
			UU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-7218-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG 
			-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-7219-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA 
			GA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217184</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit (reverse transcription buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed due to confidentiality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMP1 male mice</td>
			<td>Nippon SLC Corporation</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMR1 male mice</td>
			<td>Nippon SLC Corporation</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microrna expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment

MicroRNAs (miRNAs) هي RNAs صغيرة غير مشفرة تتكون من 21-25 قاعدة. فهي لا تترجم إلى بروتينات بل تعمل على إعاقة عمل الحمض النووي الريبي الرسول المستهدف (mRNAs) عن طريق زعزعة استقرارها وتعطيل ترجمتها. على الرغم من أنه تم التحقيق في ملامح تعبير miRNA في مختلف أعضاء وأنسجة الفئران ، إلا أنه لم تكن هناك طرق قياسية لتنقية وقياس كمية الكلى الفأرية و miRNAs في المصل. لقد أنشأنا طريقة فعالة وموثوقة لاستخراج وتقييم تعبير miRNA في مصل وكلية الفئران المصابة باختلال كلوي يعتمد على العمر. 
وتستخدم هذه الطريقة التفاعل المتسلسل الكمي للنسخ العكسي والبوليميراز (qRT-PCR)، ويتطلب البروتوكول ست خطوات: (1) إعداد الفئران المقاومة للفئران المسرعة للشيخوخة 1 (SAMR1) والفئران المعرضة للشيخوخة المتسارعة (SAMP1)؛ (2) إعداد الفئران المعرضة للشيخوخة المسرعة للشيخوخة (SAMP1)؛ (2) إعداد الفئران المعرضة للشيخوخة (SAMP1) والفئران المعرضة للشيخوخة (SAMP1)؛ (2) إعداد الفئران المعرضة للشيخوخة (SAMP1) والفئران المعرضة للشيخوخة (SAMP1)؛ (2) إعداد الفئران المعرضة للشيخوخة (SAMP1) والفئران المعرضة للشيخوخة ( (2) استخراج عينات المصل من هذه الفئران. (3) استخراج عينة من الكلى من كل فأر ؛ (4) استخراج الحمض النووي الريبي الكلي (بما في ذلك miRNA) من عينات الكلى والمصل من كل فأر ؛ (5) تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA) مع النسخ العكسي من miRNA ؛ (6) إجراء qRT-PCR باستخدام cDNA الذي تم الحصول عليه. 
تم استخدام هذا البروتوكول لتأكيد أنه ، مقارنة بالضوابط ، تم تغيير التعبير عن miRNA-7218-5p و miRNA-7219-5p بشكل كبير في الكلى والمصل لنموذج الفأر من القصور الكلوي المعتمد على العمر. أوضح هذا البروتوكول أيضا العلاقة بين الكلى والمصل لنموذج الفأر للاختلال الكلوي المعتمد على العمر. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد تعبير miRNA في الكلى ومصل الفئران المصابة باختلال كلوي يعتمد على العمر.

بالنسبة لنموذج فأر القصور الكلوي المعتمد على العمر ، استخدمنا الفئران الذكور SAMP1 البالغة من العمر 50 أسبوعا والتي تزن 40-45 جم. تم جمع ما يقرب من 0.8 مل من الدم لكل فأر ونقلها إلى أنبوب سبيتز سعة 1.0 مل مع الهيبارين والمقلوب والطرد المركزي. تم شطف كل كلية باستخدام PBS ، وتشريحها ، وتخزينها في النيتروجين السائل لمزيد من التحليل. كانت الفئران SAMR1 البالغة من العمر خمسين أسبوعا بمثابة عناصر تحكم. استنادا إلى بيانات miRNA qRT-PCR التي تم الحصول عليها باستخدام نموذج القصور الكلوي المعتمد على العمر ، لاحظنا أن مستوى الكلى من miRNA-7219-5p قد زاد بشكل كبير وانخفض مستوى الكلى من miRNA-7218-5p بشكل كبير في الفئران SAMP1 مقارنة بالضوابط (الشكل 1). زادت مستويات المصل لكل من miRNA-7219-5p و miRNA-7218-5p بشكل كبير في فئران SAMP1 مقارنة بالضوابط (الشكل 2). لم تتغير مستويات التعبير عن miRNA-223-3p في أي من السلالتين وبين الكلى والمصل (الشكل 1 والشكل 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig01.jpg"> الشكل 1: الحمض النووي الريبي الميكروي المعبر عنه بشكل تفاضلي في كليتي الفئران SAMP1. تحليل qRT-PCR للتعبير عن miRNA-223-3p و miRNA-7218-5p و miRNA-7219-5p في فئران SAMR1 (التحكم ، n = 4) والفئران SAMP1 (n = 4). البيانات متوسطة ± خطأ قياسي (أشرطة الخطأ) ؛ تم استخدام اختبارات t لتحليل الاختلافات بين المجموعات. p < 0.05 اعتبرت معنوية (* p < 0.05) ، n.s.: ليست مهمة. الاختصارات: miRNA = microRNA; SAMP1 = الفأر المتسارع الشيخوخة عرضة ؛ SAMR1 = مقاومة الماوس المتسارعة للشيخوخة 1 ؛ qRT-PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي النسخ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig02.jpg"> الشكل 2: الحمض النووي الريبوزي المرسال المعبر عنه بشكل تفاضلي في مصل فئران SAMP1. تحليل qRT-PCR للتعبير عن miRNA-223-3p و miRNA-7218-5p و miRNA-7219-5p في فئران SAMR1 (التحكم ، n = 4) وفئران SAMP1 (n = 4). البيانات متوسطة ± SE (أشرطة الخطأ) ؛ تم استخدام اختبارات t للتحقيق في الاختلافات الكبيرة بين المجموعات. * p < 0.05 بواسطة t-test. الاختصارات: miRNA = microRNA; SAMP1 = الفأر المتسارع الشيخوخة عرضة ؛ SAMR1 = مقاومة الماوس المتسارعة للشيخوخة 1 ؛ qRT-PCR = تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي النسخ العكسي <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment at JoVE.com

Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment

نقدم طريقة لتقييم تعبير microRNA في الكلى والمصل للفئران التي تعاني من اختلال كلوي يعتمد على العمر عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي العكسي.

التقييم الكمي لتفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لتعبير الحمض النووي الريبي الميكروي في الكلى ومصل الفئران المصابة باختلال كلوي معتمد على العمر

MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs consisting of 21-25 bases. They are not translated into proteins but rather work to impede the functioning of ...

يمكن أن تعالج طريقة qRT-PCR هذه الأسئلة المتعلقة بتنميط تعبير الحمض النووي الريبي الميكروي في مصل الفئران في ظروف مثل القصور الكلوي المعتمد على العمر. تمكن هذه التقنية من اكتشاف تعبير microRNA بدقة وحساسية عالية من خلال عملية بسيطة توفر الوقت وتمنع الخطأ الفني. للبدء ، قم بشق جلد البطن باستخدام ملاقط ومقص جراحي.قطع العضلات في الغشاء البريتوني من المثانة إلى الحافة اليسرى السفلى من الأضلاع. ارفع الغشاء البريتوني باستخدام ملاقط ، وقم بعمل شق جانبي في الحافة العلوية باستخدام مقص جراحي. استمر في الشق على طول الحافة السفلية للأضلاع.حدد الوريد الأجوف السفلي باستخدام مسحتين من القطن المبلل بواسطة PBS. أدخل إبرة 30 جم متصلة بحقنة 1 ملليلتر في الوريد الأجوف السفلي ، واسحب المحقنة. اسحب الإبرة ببطء لتجنب انحلال الدم.انقل الدم إلى أنبوب سبيتز 1 ملليلتر مع الهيبارين ، واخلطه عن طريق الانعكاس. قم بالطرد المركزي لأنبوب سبيتز لمدة 10 دقائق عند 3000 مرة من الغرام في درجة حرارة الغرفة. انقل السوبرناتانت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر.خذ 200 ميكرولتر من عينة المصل ، وأضف 1000 ميكرولتر من كاشف التحلل القائم على الفينول / جوانيدين. دوامة الخليط لمدة 5 ثوان ، وحضانت في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم ، واخلطها عن طريق عكس الأنبوب 15 مرة.احتضان العينة في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق ، تليها الطرد المركزي. دون إزعاج الكريات ، انقل السوبرناتانت إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر. أضف 450 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ ، ودوامة الأنبوب لمدة 5 ثوان.ثم قم بتحميل 700 ميكرولتر من العينة على عمود دوران مثبت بالغشاء ، وقم بطرده مركزيا. تخلص من التدفق ، وأضف 700 ميكرولتر من Wash Buffer 1 المتوفرة في المجموعة. جهاز طرد مركزي مرة أخرى ، وتخلص من التدفق من خلاله.كرر الغسيل مع 500 ميكرولتر من Wash Buffer 2 لإزالة الأملاح النزرة. أضف 500 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول ، وأجهزة الطرد المركزي ، وتخلص من التدفق من أنبوب التجميع. قم بالطرد المركزي لعمود الدوران مرة أخرى ، وانقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد سعة 1.5 ملليلتر.ثم أضف 14 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase ، واحتضنه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بتدوير العمود مرة أخرى لمدة 1 دقيقة عند 15000 مرة G في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد محلول خلط رئيسي ، وأضف 8 ميكرولترات لكل بئر في أنبوب شريط 8 آبار.أضف 12 ميكرولترا من إجمالي الحمض النووي الريبي المستخرج في كل أنبوب، وقم بالطرد المركزي للأنبوب لمدة 15 ثانية عند 2000 مرة من G في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنبوب في جهاز تدوير حراري ، وابدأ الحضانة لتوليف cDNA. بعد الحضانة ، انقل cDNA إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد.تمييع cDNA عشرة أضعاف مع الماء المقطر. ثم دوامة ، تليها الطرد المركزي لمدة 5 ثوان في 2000 مرة G في درجة حرارة الغرفة. في أنبوب الطرد المركزي الدقيق ، قم بإعداد محلول المزيج الرئيسي كما هو موضح في بروتوكول النص ، ودوامة المحلول.أضف 22.5 ميكرولتر أليكوت في كل بئر من صفيحة 96 بئرا ، متبوعا ب 2.5 ميكرولتر من cDNA. أغلق اللوحة باستخدام فيلم لاصق ، وقم بالطرد المركزي للصفيحة لمدة 30 ثانية عند 1000 مرة G.ضع اللوحة في نظام PCR في الوقت الفعلي. عدل الإعدادات عن طريق توفير اسم للتجربة.ثم حدد 96-well 0.2 ملليلتر كنوع التجربة ، والتصوير المقطعي المحوسب المقارن كطريقة القياس الكمي ، والمعيار كوضع تشغيل النظام ، وكواشف SYBR Green ككواشف للكشف عن التسلسل المستهدف. قدم أسماء للعينة والحمض النووي الريبوزي المرسال المستهدف في كل بئر. قم بتعيين عينات مكررة، واختر عينة مرجعية وعنصر تحكم داخلي، وحدد لا شيء للصبغة لاستخدامها كمرجع سلبي.للقضاء على التلوث المتبادل للكاشف، قم بإعداد النسخ العكسي السلبي وعنصر تحكم غير قالب لتعبير miRNA. بعد ذلك تأكد من ضبط حجم التفاعل على 20 ميكرولتر، وضبط ظروف دورة PCR على 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، ثم 40 دورة من تمسخ عند 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، والتلدين عند 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، والتمديد عند 70 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. بعد اكتمال العملية ، انقر فوق تحليل لتحليل بيانات qRT-PCR.تأكد من أن خط العتبة الذي يحدده البرنامج تلقائيا مناسب لكل بئر. تحقق من قيمة دورة العتبة للتحكم الداخلي والحمض النووي الريبوزي المرسال المستهدف الذي تم تحليله في كل عينة. أوجد قيم التصوير المقطعي المحوسب عن طريق تقاطع منحنى التضخيم وخط العتبة.أظهرت بيانات miRNA qRT-PCR لنموذج القصور الكلوي المعتمد على العمر أنه بالمقارنة مع الفئران الضابطة SAMR1 ، زاد مستوى الكلى من miRNA-7219-5p بشكل كبير في الفئران التجريبية SAMP1 ، في حين انخفض مستوى الكلى من miRNA-7218-5p. لم تتغير مستويات التعبير عن miRNA-223-3p في أي من السلالتين. زادت مستويات المصل لكل من miRNA-7219-5p و miRNA-7218-5p بشكل كبير في فئران SAMP1 ، في حين أن مستويات miRNA-223-3p لم تتغير.يجب عليك إدخال الإبرة في الوريد الأجوف السفلي واستخراج الدم دون اختراق الوعاء. يمكن استخدام هذه الطريقة للإجابة على الأسئلة الرئيسية في تنميط تعبير microRNA في مصل الفئران لمجموعة واسعة من الحالات المرضية.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

تحسين تفاعل البلمرة المتسلسل-تقييد جزء طول تعدد الأشكال الجيني من ينفوخية السامة من قبل اللوني السائل / قياس الطيف الكتلي

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

قياس موازية التعبير الإيقاعية جين ساعة وهرمون إفراز في مزارع الخلايا الأولية البشرية

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

مستحلب T7 الحمض النووي الريبي البلمرة بوساطة مولتيجين نظام التعبير، بمغس

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

الكشف عن التعبير ميكرورنا في الغشاء البريتوني من الفئران باستخدام الكمي في الوقت الحقيقي ير

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

تحديد المواقع صبغية أمثل لعنصر الحمض النووي في الإشريكيّة القولونية باستخدام نهج ينقول بوساطة جديدة

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

كشف شبه كمي النشاط المعتمدة على الحمض النووي الريبي بوليميراز الحمض النووي الريبي للبروتين البشري Telomerase المنتسخة العكسية

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

كريسبر بوساطة إعادة تنظيم هيكل حلقة الكروماتين

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

قطره واحدة رقمي البلمرة المتسلسل لكشف شامل ومتزامن من الطفرات في المناطق الساخنة

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

تحديد الأحداث جزئ مثلى في الخلايا الجذعية الجنينية الماوس باستخدام النشاف الجنوبي وتفاعل البوليميراز المتسلسل

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...