Name: quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microrna expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment
Uploaded: 2022-04-29T13:00:00
Duration: 6 min 48 s
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	<li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+regulatory+role+of+lncRNA-miRNA-mRNA+axis+in+cardiovascular+diseases.">The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).</li><li>Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA-106b-5p+in+human+cancers:+diverse+functions+and+promising+biomarker.">MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211 (2020).</li><li>Lu, T. X., Rothenberg, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. 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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Die Expressionsniveaus der Ziel-miRNAs wurden erfolgreich durch das oben beschriebene Protokoll mittels qRT-PCR bestimmt. Die Auswertung der extrahierten miRNAs ist ein wichtiger Schritt, um aussagekräftige qRT-PCR-Daten zu erhalten. Um die adäquate Qualität der miRNAs vor der Durchführung der qRT-PCR zu bestätigen, sollte mittels Spektrophotometrie das Verhältnis der Absorption bei 260 nm zu der bei 280 nm bestimmt werden. DNA-Verunreinigungen können auftreten, und/oder Primer-Dimere in jeder Vertiefung der Reaktionsplatte können vorhanden sein, wenn die qRT-PCR keine einzige PCR-Amplifikation der erwarteten Länge und Schmelztemperatur liefert oder wenn sie eine monomodale Schmelzkurve liefert.
MiRNA-Expressionsniveaus können mit verschiedenen Methoden als qRT-PCR bewertet werden, einschließlich Northern Blotting, einem Microarray und Ribonuklease-Schutzassays. Die qRT-PCR-Methode ist jedoch ein empfindliches, genaues, einfaches und reproduzierbares Verfahren, das ein kleineres Probenvolumen erfordert als für Northern Blotting und Ribonuklease-Schutzassays19. Da Microarrays die Expression von Zehntausenden von miRNAs gleichzeitig messen können, können sie verwendet werden, um miRNA-Markerkandidaten zu identifizieren. Microarray-Daten zeigen auch eine hohe Gesamtkorrelation mit Daten, die mit qRT-PCR20 gewonnen wurden. Es wurde jedoch kein Konsens über die optimale Methodik für den Vergleich von Microarray-Daten erzielt, die in verschiedenen Studien gewonnen wurden21.
Die Auswertung von Serum-miRNAs weist folgende Merkmale auf. Erstens ist es einfach, Serum zu sammeln, und da Serum-miRNAs stabil gegen Einfrieren und Auftauen, Temperatur und Säure sind, können die miRNAs gute Biomarker sein. Zweitens gibt es eine hohe Homologie von miRNAs zwischen den Arten, und die Ergebnisse von Tierversuchen lassen sich leicht auf den Menschen übertragen. Drittens haben Serum-miRNAs Potenzial für den Einsatz als therapeutische Medikamente gezeigt3. Mehrere Studien haben auch gezeigt, dass der Grad der Expression von miRNA in Organen mit miRNA im Serumkorreliert ist 22,23,24. In der vorliegenden Studie zeigte miRNA-223-3p, deren Nierenspiegel keinen signifikanten Unterschied zwischen den SAMR1- und SAMP1-Mäusen zeigten, ebenfalls keinen signifikanten Unterschied zwischen den Stämmen im Serum. Im Gegensatz dazu zeigten miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p, deren Nierenspiegel einen signifikanten Unterschied zwischen den SAMR1- und SAMP1-Mäusen zeigten, erhebliche Unterschiede zwischen den Stämmen im Serum.
Für dieses Protokoll gelten die folgenden Einschränkungen. Erstens wurde seine Nützlichkeit in anderen Organen wie Leber und Lunge nicht nachgewiesen, und zweitens wurde es nicht an anderen Labortieren wie Ratten, Hunden und Schweinen getestet. Mehrere Forschungsgruppen haben dieses Protokoll für die Aufreinigung und den Nachweis von miRNAs mittels qRT-PCR verwendet und berichtet, dass dieses Protokoll die Reinigung von hochwertiger RNA aus Geweben und Serumermöglicht 13,14,22,23,24. Diese Methode hat nachweislich eine hohe Genauigkeit und Empfindlichkeit zum Nachweis der Expression von miRNAs 13,14,22,23,24. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen, dass dieses Protokoll die miRNA-Expression im Serum und in der Niere von Mäusen erfolgreich nachweisen kann. Daher kann das Protokoll verwendet werden, um die Serum- und Nieren-miRNA-Expressionsprofile bei Mäusen mit einer Vielzahl von Pathologien zu bestimmen. Aufgrund der Einfachheit des Protokolls kann eine große Anzahl von Proben gleichzeitig verarbeitet werden. Analysen der Expression vieler miRNAs bei verschiedenen pathologischen Zuständen der Niere können daher das hierin beschriebene Protokoll verwenden.
Es gibt bestimmte Aspekte des Protokolls zu beachten. Um den Abbau der gereinigten miRNAs zu vermeiden, der bei Raumtemperatur auftreten würde, müssen die miRNAs auf Eis gehalten werden. Die Nierenproben müssen homogenisiert werden, bis sie vollständig im Lysereagenz gelöst sind. Mausniere enthält eine beträchtliche Menge an Bindegewebe, das in Lysereagenz unlöslich ist, und daher ist ein Säulenschredder für die weitere Homogenisierung erforderlich. Darüber hinaus sollte die geeignete endogene Kontroll-miRNA (mit stabiler Expression unter den Proben) während des Aufbaus eines qRT-PCR-Experiments validiert werden. Dies liegt daran, dass die Interferenz verschiedener Substanzen während der Durchführung dieses Protokolls die Expressionsniveaus endogener Kontroll-miRNAs verändern kann, was möglicherweise die Ergebnisse beeinträchtigt. Zusammenfassend beschreibt dieser Artikel ein qRT-PCR-Protokoll zum Nachweis, zur Aufreinigung und Bewertung der miRNA-Expression im Serum und in der Niere von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung.

Es ist bekannt, dass die Expression verschiedener mRNAs, die sowohl in der Physiologie als auch in der Krankheit eine wichtige Rolle spielen (z. B. Entzündungen, Fibrose, Stoffwechselstörungen und Krebs), durch miRNAs reguliert wird, bei denen es sich um kurze, nicht-kodierende RNAs handelt, die den Abbau verursachen und die Transkription von mRNA1 hemmen. Es ist daher möglich, dass bestimmte miRNAs als neue Kandidatenbiomarker und/oder therapeutische Ziele für verschiedene Krankheitendienen könnten 2,3,4,5. Es wurden Untersuchungen zu miRNA-Expressionsprofilen in einer Vielzahl von Mausorganen und -geweben (einschließlich Gehirn6, Herz7, Lunge8, Leber9 und Niere10) durchgeführt. Es gibt jedoch keine Standard- oder etablierten Methoden zur Extraktion und Bewertung von miRNAs in den Nieren oder im Serum von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung.
Daher haben wir ein Protokoll etabliert, mit dem die miRNA-Expression im Serum und in der Niere von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung zuverlässig gereinigt und nachgewiesen werden kann. Es gibt sechs Hauptschritte im Protokoll: (1) Vorbereitung sowohl von 50 Wochen alten männlichen SAMR1-Mäusen als auch von männlichen SAMP1-Mäusen; (2) Entnahme von Blutproben aus der unteren Hohlvene beider Mäusestämme mit anschließender Verwendung eines Spitzröhrchens mit Heparin, gefolgt von Zentrifugation, um eine Serumprobe zu erhalten; (3) Nierenprobenextraktion aus den Mäusen - ein Siliziumhomogenisator wird verwendet, um die Nierenprobe separat zu homogenisieren, und die Probe wird dann in ein Biopolymer-Zerkleinerungssystem auf einer Mikrozentrifugenspinsäule11 überführt; (4) Gesamt-RNA-Extraktion (miRNA) aus den Serumproben unter Verwendung einer Siliciumdioxidmembran-basierten Spin-Säule12 und Gesamt-RNA-enthaltende miRNA-Extraktion aus den Nierenproben unter Verwendung einer Siliciumdioxidmembran-basierten Spin-Säule11; (5) Synthese komplementärer DNA (cDNA) aus der Gesamt-RNA unter Verwendung von reverser Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primer13,14; und (6) schließlich Bestimmung der miRNA-Expression mittels qRT-PCR und eines interkalierenden Farbstoffs13,14.
Dieses neue Protokoll basierte auf Studien, die es geschafft haben, miRNAs in verschiedenen Gewebearten zu extrahieren undzu bewerten 11,12,13. Es wurde gezeigt, dass das Biopolymer-Zerkleinerungssystem des Protokolls in der Lage ist, hochwertige Gesamt-RNA aus Gewebenzu reinigen 11. Die Genauigkeit und Sensitivität von Aspekten dieses Protokolls, die für die Bewertung der miRNA-Expression mittels qRT-PCR mit einem interkalierenden Farbstoff verwendet werden, wurden13,14 nachgewiesen, beispielsweise die cDNA-Synthese mit reverser Transkriptase, Poly(A)-Polymerase und Oligo-dT-Primern aus der extrahierten Gesamt-RNA. Das neue Protokoll hat mehrere Vorteile: Einfachheit, Zeitersparnis und reduzierte technische Fehler. Es kann daher für Untersuchungen verwendet werden, die eine genaue und sensitive Identifizierung von Nieren- und Serum-miRNA-Profilen erfordern. Studien zu vielen pathologischen Zuständen können auch das neue Protokoll verwenden.
Die miRNA-Expressionsprofile in SAMP1-Mäusen, die ein Modell für eine altersabhängige Nierenfunktionsstörung darstellen, können wie unten gezeigt bestimmt werden. Beim Menschen ist eine altersabhängige Nierenfunktionsstörung mit dem Fortschreiten der Niereninsuffizienz assoziiert und sowohl durch eine Zunahme des Bereichs der renalen interstitiellen Fibrose als auch durch das Fortschreiten der Glomerulosklerose gekennzeichnet15,16. Die altersabhängige Nierenfunktionsstörung ist auch ein wichtiges und häufiges Merkmal chronischer Nierenerkrankungen und terminaler Niereninsuffizienz15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL spitz with heparin</td>
			<td>Greiner-bio-one</td>
			<td>450534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-223-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003871</td>
			<td>5&#39;-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU 
			G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-423-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00012005</td>
			<td>5&#39;-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU 
			UU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-7218-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG 
			-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-7219-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA 
			GA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217184</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit (reverse transcription buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed due to confidentiality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMP1 male mice</td>
			<td>Nippon SLC Corporation</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMR1 male mice</td>
			<td>Nippon SLC Corporation</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microrna expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine, nicht-kodierende RNAs, die aus 21-25 Basen bestehen. Sie werden nicht in Proteine übersetzt, sondern behindern die Funktion ihrer Zielboten-RNAs (mRNAs), indem sie sie destabilisieren und ihre Translation stören. Obwohl die miRNA-Expressionsprofile in verschiedenen Mausorganen und -geweben untersucht wurden, gab es keine Standardmethoden zur Reinigung und Quantifizierung von Mausnieren- und Serum-miRNAs. Wir haben eine effektive und zuverlässige Methode zur Extraktion und Bewertung der miRNA-Expression im Serum und in der Niere von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung etabliert. 
Die Methode verwendet die quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), und das Protokoll erfordert sechs Schritte: (1) Vorbereitung von Seneszenz-beschleunigten Mauswiderstands-1 (SAMR1) Mäusen und Seneszenz-beschleunigten Maus-anfälligen (SAMP1) Mäusen; (2) Entnahme von Serumproben aus diesen Mäusen; (3) Entnahme einer Nierenprobe aus jeder Maus; (4) Extraktion der Gesamt-RNA (einschließlich miRNA) aus Nieren- und Serumproben jeder Maus; (5) die Synthese komplementärer DNA (cDNA) mit reverser Transkription aus der miRNA; (6) Durchführung einer qRT-PCR unter Verwendung der erhaltenen cDNA. 
Dieses Protokoll wurde verwendet, um zu bestätigen, dass im Vergleich zu den Kontrollen die Expression von miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p in der Niere und im Serum eines Mausmodells mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung signifikant verändert war. Dieses Protokoll klärte auch die Beziehung zwischen der Niere und dem Serum des Mausmodells der altersabhängigen Nierenfunktionsstörung. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die miRNA-Expression in der Niere und im Serum von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung zu bestimmen.

Für das Mausmodell mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung verwendeten wir 50 Wochen alte männliche SAMP1-Mäuse mit einem Gewicht von 40-45 g. Ungefähr 0,8 ml Blut wurden pro Maus gesammelt und in ein 1,0 ml Spitzröhrchen mit Heparin überführt, invertiert und zentrifugiert. Jede Niere wurde mit PBS gespült, seziert und zur weiteren Analyse in flüssigem Stickstoff gelagert. Fünfzig Wochen alte SAMR1-Mäuse dienten als Kontrollen. Basierend auf den miRNA qRT-PCR-Daten, die mit diesem altersabhängigen Nierenfunktionsmodell gewonnen wurden, beobachteten wir, dass der Nierenspiegel von miRNA-7219-5p signifikant erhöht und der Nierenspiegel von miRNA-7218-5p bei den SAMP1-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen signifikant erniedrigt war (Abbildung 1). Die Serumspiegel von miRNA-7219-5p und miRNA-7218-5p waren bei den SAMP1-Mäusen im Vergleich zu den Kontrollen erheblich erhöht (Abbildung 2). Die Expressionsniveaus von miRNA-223-3p änderten sich in keinem der beiden Stämme und zwischen Niere und Serum (Abbildung 1 und Abbildung 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig01.jpg"> Abbildung 1: Differentiell exprimierte microRNAs in den Nieren von SAMP1-Mäusen. qRT-PCR-Analyse der Expression von miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p in SAMR1-Mäusen (Kontrolle, n = 4) und SAMP1-Mäusen (n = 4). Die Daten sind Mittelwert ± Standardfehler (Fehlerbalken); t-Tests wurden verwendet, um Unterschiede zwischen Gruppen zu analysieren; p < 0,05 wurde als signifikant (*p < 0,05), n.s.: nicht signifikant angesehen. Abkürzungen: miRNA = microRNA; SAMP1 = seneszenzbeschleunigte Maus anfällig; SAMR1 = seneszenzbeschleunigter Mauswiderstand 1; qRT-PCR = quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig02.jpg"> Abbildung 2: Differentiell exprimierte miRNAs im Serum von SAMP1-Mäusen. qRT-PCR-Analyse der Expression von miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p und miRNA-7219-5p in SAMR1-Mäusen (Kontrolle, n = 4) und SAMP1-Mäusen (n = 4). Die Daten sind Mittelwert ± SE (Fehlerbalken); T-Tests wurden verwendet, um signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen zu untersuchen. *P < 0,05 durch t-Test. Abkürzungen: miRNA = microRNA; SAMP1 = seneszenzbeschleunigte Maus anfällig; SAMR1 = seneszenzbeschleunigter Mauswiderstand 1; qRT-PCR = quantitative Reverse-Transkription-Polymerase-Kettenreaktion <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment

Wir stellen eine Methode zur Bewertung der microRNA-Expression in Niere und Serum von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung durch quantitative Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion vor.

Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktions-Bewertung der MicroRNA-Expression in Niere und Serum von Mäusen mit altersabhängiger Nierenfunktionsstörung

MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs consisting of 21-25 bases. They are not translated into proteins but rather work to impede the functioning of ...

Diese qRT-PCR-Methode kann Fragen im Zusammenhang mit der Erstellung von microRNA-Expressionsprofilen im Serum von Mäusen unter Bedingungen wie altersabhängiger Nierenfunktionsstörung beantworten. Die Technik ermöglicht den Nachweis der microRNA-Expression mit hoher Genauigkeit und Empfindlichkeit durch einen einfachen Prozess, der Zeit spart und technische Fehler verhindert. Um zu beginnen, schneiden Sie die Haut des Bauches mit Pinzette und chirurgischer Schere.Schneiden Sie die Muskeln in der Peritonealmembran von der Blase bis zum unteren linken Rand der Rippen. Heben Sie die Peritonealmembran mit einer Pinzette an und machen Sie einen seitlichen Schnitt am oberen Rand mit einer chirurgischen Schere. Setzen Sie den Schnitt entlang der untersten Kante der Rippen fort.Identifizieren Sie die untere Hohlvene mit zwei PBS-befeuchteten Wattestäbchen. Führen Sie eine 30-G-Nadel, die an einer 1-Milliliter-Spritze befestigt ist, in die Vena cava inferior ein und ziehen Sie die Spritze. Ziehen Sie die Nadel langsam heraus, um Hämolyse zu vermeiden.Übertragen Sie das Blut in ein 1-Milliliter-Spitzröhrchen mit Heparin und mischen Sie es durch Invertieren. Zentrifugieren Sie das Spitzrohr für 10 Minuten bei 3000 mal G bei Raumtemperatur. Den Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.Nehmen Sie 200 Mikroliter Serumprobe und fügen Sie 1.000 Mikroliter Phenol / Guanidin-basiertes Lysereagenz hinzu. Wirbeln Sie die Mischung für 5 Sekunden und inkubieren Sie sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten. Fügen Sie 200 Mikroliter Chloroform hinzu und mischen Sie, indem Sie die Tube 15 Mal umdrehen.Inkubieren Sie die Probe bei Raumtemperatur für 3 Minuten, gefolgt von der Zentrifugation. Ohne das Pellet zu stören, wird der Überstand in ein frisches 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Fügen Sie 450 Mikroliter 100% Ethanol hinzu und wirbeln Sie die Röhre für 5 Sekunden.Laden Sie dann 700 Mikroliter der Probe auf eine membranverankerte Spinsäule und zentrifugieren Sie sie. Verwerfen Sie den Durchfluss und fügen Sie 700 Mikroliter Waschpuffer 1 hinzu, der im Kit enthalten ist. Zentrifugieren Sie erneut, und verwerfen Sie den Durchfluss.Wiederholen Sie das Waschen mit 500 Mikrolitern Wash Buffer 2, um Spurensalze zu entfernen. Fügen Sie 500 Mikroliter 80% Ethanol hinzu, zentrifugieren Sie und entsorgen Sie den Durchfluss aus dem Sammelrohr. Zentrifugieren Sie die Spin-Säule erneut und geben Sie die Säule in ein frisches 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen.Dann fügen Sie 14 Mikroliter RNase-freies Wasser hinzu und inkubieren Sie für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Drehen Sie die Säule erneut für 1 Minute bei 15000 mal G bei Raumtemperatur. Bereiten Sie eine Master-Mix-Lösung vor und fügen Sie 8 Mikroliter pro Vertiefung in ein 8-Well-Streifenrohr hinzu.Fügen Sie 12 Mikroliter der extrahierten Gesamt-RNA in jedes Röhrchen hinzu und zentrifugieren Sie das Röhrchen für 15 Sekunden bei 2000 mal G bei Raumtemperatur. Legen Sie das Röhrchen in einen Thermocycler und starten Sie die Inkubation, um die cDNA zu synthetisieren. Nach der Inkubation wird die cDNA in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Verdünnen Sie die cDNA zehnfach mit destilliertem Wasser. Dann Wirbel, gefolgt von Zentrifugation für 5 Sekunden bei 2000 mal G bei Raumtemperatur. Bereiten Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen die Master-Mix-Lösung wie im Textprotokoll beschrieben vor und wirbeln Sie die Lösung durch.Fügen Sie 22,5 Mikroliter Aliquots in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte hinzu, gefolgt von 2,5 Mikrolitern cDNA. Versiegeln Sie die Platte mit einem Klebefilm und zentrifugieren Sie die Platte 30 Sekunden lang mit dem 1000-fachen G.Legen Sie die Platte in das real-time PCR-System. Ändern Sie die Einstellungen, indem Sie einen Namen für das Experiment angeben.Wählen Sie dann 96-well 0,2 Milliliter als Experimenttyp, vergleichende CT als Quantifizierungsmethode, Standard als Systemlaufmodus und SYBR Green-Reagenzien als Reagenzien zum Nachweis der Zielsequenz. Geben Sie Namen für die Probe und die Ziel-miRNA in jeder Vertiefung an. Weisen Sie doppelte Proben zu, wählen Sie eine Referenzprobe und eine endogene Kontrolle aus, und wählen Sie keine für den Farbstoff aus, der als passive Referenz verwendet werden soll.Um eine Reagenzkreuzkontamination zu eliminieren, richten Sie eine negative Reverse-Transkriptase und eine Nicht-Template-Kontrolle für die miRNA-Expression ein. Als nächstes stellen Sie sicher, dass das Reaktionsvolumen auf 20 Mikroliter eingestellt wird und die PCR-Zyklusbedingungen für 15 Minuten auf 95 Grad Celsius eingestellt werden, dann 40 Denaturierungszyklen bei 94 Grad Celsius für 15 Sekunden, Glühen bei 55 Grad Celsius für 30 Sekunden und Verlängerung bei 70 Grad Celsius für 30 Sekunden. Nachdem der Vorgang abgeschlossen ist, klicken Sie auf Analysieren, um die qRT-PCR-Daten zu analysieren.Vergewissern Sie sich, dass die vom Programm automatisch ausgewählte Schwellenwertlinie für jede Vertiefung geeignet ist. Überprüfen Sie den Schwellenwert-Zykluswert der endogenen Kontroll- und Ziel-miRNAs, die in jeder Probe analysiert wurden. Bestimmen Sie die CT-Werte durch den Schnittpunkt der Verstärkungskurve und der Schwellenwertlinie.miRNA qRT-PCR-Daten für das altersabhängige Modell der Nierenfunktionsstörung zeigten, dass im Vergleich zu SAMR1-Kontrollmäusen der Nierenspiegel von miRNA-7219-5p bei SAMP1-Versuchsmäusen signifikant anstieg, während der Nierenspiegel von miRNA-7218-5p abnahm. Die Expressionsniveaus von miRNA-223-3p änderten sich in keinem der beiden Stämme. Die Serumspiegel von miRNA-7219-5p und miRNA-7218-5p waren in den SAMP1-Mäusen erheblich erhöht, während die Spiegel von miRNA-223-3p unverändert blieben.Sie sollten die Nadel in die Vena cava inferior einführen und Blut entnehmen, ohne in das Gefäß einzudringen. Diese Methode kann verwendet werden, um Schlüsselfragen im microRNA-Expressionsprofil in Mäuseserum für eine Vielzahl von pathologischen Zuständen zu beantworten.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Verbesserte Polymerase-Kettenreaktion-RFLP Genotypisierung von Toxic Kugelfisch durch Flüssigchromatographie / Massenspektrometrie

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Forschung

Genetik

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallel Messung von Circadian Clock Genexpression und Hormon-Sekretion in primären humanen Zellkulturen

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Induzierbares T7-RNA-Polymerase-vermitteltes Multigen-Expressionssystem, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Nachweis der microRNA-Expression in der peritonealen Membran von Ratten unter Verwendung der quantitativen Echtzeit-PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Bestimmung der optimalen chromosomalen Speicherorte für eine DNA-Element in Escherichia coli mit einem neuartigen Transposon-vermittelte Ansatz

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Semi-quantitativen Nachweis von RNA-abhängige RNA-Polymerase-Aktivität des menschlichen Telomerase Reverse Transkriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR-vermittelten Reorganisation der Chromatinstruktur mit Schleife

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Einzelne Tropfen digitale Polymerase-Kettenreaktion für umfassende und gleichzeitigen Nachweis von Mutationen im Hotspot-Regionen

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identifikation der homologen Rekombinationsereignisse in embryonalen Stammzellen der Maus mit Southern Blotting und Polymerase-Kettenreaktion

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...