Name: quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microrna expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment
Uploaded: 2022-04-29T13:00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment at JoVE.com

<ol>
	<li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+regulatory+role+of+lncRNA-miRNA-mRNA+axis+in+cardiovascular+diseases.">The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).</li><li>Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA-106b-5p+in+human+cancers:+diverse+functions+and+promising+biomarker.">MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211 (2020).</li><li>Lu, T. X., Rothenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA.">MicroRNA.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).</li><li>McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+breast+cancer:+the+potential+of+miRNA+for+diagnosis+and+treatment+monitoring.">Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).</li><li>Bjorkman, S., Taylor, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+endometriosis:+biological+function+and+emerging+biomarker+candidates.">MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates.</a> Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).</li><li>Zhou, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+and+circRNA+expression+patterns+in+mouse+brain+during+toxoplasmosis+development.">miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development.</a> BMC Genomics. 21 (1), 46 (2020).</li><li>Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulated+miRNA-26a-5p+induces+the+apoptosis+of+endothelial+cells+in+coronary+heart+disease+by+inhibiting+PI3K/AKT+pathway.">Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Bala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+exosomes+indicate+hepatocyte+injury+and+inflammation+in+alcoholic,+drug-induced,+and+inflammatory+liver+diseases.">Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases.</a> Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).</li><li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease.">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research. 237, 31-52 (2021).</li><li>Mastropasqua, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNA+levels+in+diabetes+mellitus.">Serum microRNA levels in diabetes mellitus.</a> Diagnostics (Basel). 11 (2), 284 (2021).</li><li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+detection+in+prostate+tumors+by+quantitative+real-time+PCR+(qPCR).">MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874 (2012).</li><li>Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+accurate+analysis+of+microRNA+using+a+specific+extension+sequence.">Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence.</a> Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).</li><li>Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+changes+With+the+aging+kidney.">Structural and functional changes With the aging kidney.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).</li><li>Weinstein, J. R., Anderson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+kidney:+physiological+changes.">The aging kidney: physiological changes.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+array-based+gene+expression+profiles+by+real-time+(kinetic)+RT-PCR.">Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).</li><li>Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+quantitative+RT-PCR+array+in+miRNA+expression+profiling+and+comparison+with+microarray+analysis.">Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis.</a> BMC Genomics. 10, 407 (2009).</li><li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate.">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate.</a> BMC Genomics. 6, 59 (2005).</li><li>Petriella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+profiling+in+serum+and+tissue+samples+to+assess+noninvasive+biomarkers+for+NSCLC+clinical+outcome.">miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome.</a> Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).</li><li>Skrzypa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-146a-5p+is+upregulated+in+serum+and+cartilage+samples+of+patients+with+osteoarthritis.">miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis.</a> Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).</li><li>Farzanehpour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+tissue+miRNAs:+potential+biomarkers+for+the+diagnosis+of+cervical+cancer.">Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer.</a> Journal of Virology Journal. 16 (1), 116 (2019).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים.

רמות הביטוי של miRNAs היעד נקבעו בהצלחה על ידי הפרוטוקול המתואר לעיל באמצעות qRT-PCR. הערכת ה-miRNAs שחולצו היא שלב חשוב בהשגת נתוני qRT-PCR משמעותיים. כדי לאשר את האיכות הנאותה של miRNAs לפני ביצוע qRT-PCR, יש להשתמש בספקטרופוטומטריה כדי לקבוע את יחס הספיגה ב-260 ננומטר לזה שב-280 ננומטר. זיהום דנ"א עלול להתרחש, ו/או דימרים ראשוניים בכל באר של לוחית התגובה עשויים להיות נוכחים אם qRT-PCR אינו מספק הגברה אחת של PCR של האורך הצפוי וטמפרטורת ההיתוך, או אם הוא מספק עקומת התכה מונומודלית.
ניתן להעריך את רמות הביטוי של MiRNA במספר שיטות שאינן qRT-PCR, כולל כתם צפוני, מיקרו-מערך ומבחני הגנה על ריבונוקלאז. עם זאת, שיטת qRT-PCR היא הליך רגיש, מדויק, פשוט וניתן לשחזור הדורש נפח דגימה קטן יותר מאלו הנדרשים למבחני הגנה מפני כתמים צפוניים וריבונוקלאז19. מאחר שמיקרו-מערכים יכולים למדוד את הביטוי של עשרות אלפי miRNAs בו-זמנית, ניתן להשתמש בהם כדי לזהות סמני miRNA מועמדים. נתוני Microarray מראים גם מתאם כולל גבוה עם נתונים המתקבלים על ידי qRT-PCR20. עם זאת, לא הושגה הסכמה לגבי המתודולוגיה האופטימלית להשוואת נתוני מיקרו-מערך שהתקבלו במחקרים שונים21.
ההערכה של miRNAs בסרום יש את התכונות הבאות. ראשית, קל לאסוף סרום, וכיוון ש-miRNAs בסרום יציבים נגד הקפאה והפשרה, טמפרטורה וחומצה, ה-miRNAs יכולים להיות סמנים ביולוגיים טובים. שנית, יש הומולוגיה גבוהה של miRNAs בין מינים, ותוצאות ניסויים בבעלי חיים ניתנות לאקסטרפולציה בקלות לבני אדם. שלישית, miRNAs בסרום הראו פוטנציאל לשימוש כתרופות טיפוליות3. מספר מחקרים הראו גם כי רמת הביטוי של miRNA באיברים מתואמת עם miRNA בסרום 22,23,24. במחקר הנוכחי, miRNA-223-3p, שגם רמות הכליות שלו לא הראו הבדל משמעותי בין עכברי SAMR1 ו-SAMP1, לא הראו הבדל משמעותי בין הזנים בסרום. לעומת זאת, miRNA-7218-5p ו-miRNA-7219-5p, שרמות הכליות שלהן הראו הבדל משמעותי בין עכברי SAMR1 ו-SAMP1, הראו הבדלים ניכרים בין הזנים בסרום.
לפרוטוקול זה יש את המגבלות הבאות. ראשית, התועלת שלו לא אומתה באיברים אחרים כגון הכבד והריאות, ושנית, הוא לא נבדק על חיות מעבדה אחרות כגון חולדות, כלבים וחזירים. מספר קבוצות מחקר השתמשו בפרוטוקול זה לטיהור וזיהוי של miRNAs על ידי qRT-PCR ודיווחו כי פרוטוקול זה איפשר טיהור של RNA באיכות גבוהה מרקמות וסרום 13,14,22,23,24. שיטה זו הוכחה כבעלת דיוק ורגישות גבוהים לאיתור ביטוי של miRNAs 13,14,22,23,24. תוצאות המחקר הנוכחי מראות כי פרוטוקול זה יכול לזהות בהצלחה ביטוי miRNA בסרום ובכליות של עכברים. לכן, ניתן להשתמש בפרוטוקול כדי לקבוע את פרופילי הביטוי miRNA בסרום ובכליות בעכברים עם מגוון פתולוגיות. בשל פשטות הפרוטוקול, ניתן לעבד מספר רב של דגימות בו זמנית. ניתוחים של ביטוי של miRNAs רבים בתנאים פתולוגיים שונים של הכליה יכול, ובכך, להשתמש בפרוטוקול המתואר כאן.
ישנם היבטים מסוימים של הפרוטוקול שיש לזכור. כדי למנוע את ההתפרקות של ה-miRNAs המטוהרים שיתרחשו בטמפרטורת החדר, יש לשמור את ה-miRNAs על קרח. דגימות הכליות חייבות להיות הומוגניות עד שהן מומסות לחלוטין במגיב התזה. כליות עכבר מכילות כמות משמעותית של רקמת חיבור שאינה מסיסה במגיב תזה, ולכן נדרשת מגרסת עמודים להמשך הומוגניזציה. בנוסף, יש לאמת את miRNA הבקרה האנדוגנית המתאימה (עם ביטוי יציב בין הדגימות) לאורך כל ההתקנה של ניסוי qRT-PCR. הסיבה לכך היא שהתערבות של חומרים שונים במהלך הביצועים של פרוטוקול זה יכולה לשנות את רמות הביטוי של miRNAs בקרה אנדוגנית, ואולי לפגוע בתוצאות. לסיכום, מאמר זה מתאר פרוטוקול qRT-PCR לזיהוי, טיהור והערכה של ביטוי miRNA בסרום ובכליות של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל.

ידוע כי הביטוי של mRNA שונים הממלאים תפקידים חשובים הן בפיזיולוגיה והן במחלות (למשל, דלקת, פיברוזיס, הפרעות מטבוליות וסרטן) מווסת על ידי miRNAs, שהם רנ"א קצרים ולא מקודדים הגורמים להתפרקות ומעכבים את שעתוק ה-mRNA1. ייתכן, אם כן, כי miRNAs מסוימים יכולים לשמש סמנים ביולוגיים מועמדים חדשים ו / או מטרות טיפוליות למחלות שונות 2,3,4,5. נערכו מחקרים על פרופילי ביטוי miRNA במגוון איברים ורקמות של עכברים (כולל מוח6, לב7, ריאה8, כבד9 וכליה10). עם זאת, אין שיטות סטנדרטיות או מבוססות לחילוץ והערכה של miRNAs בכליות או בסרום של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל.
לכן, קבענו פרוטוקול שניתן להשתמש בו כדי לטהר ולזהות באופן אמין ביטוי miRNA בסרום ובכליות של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל. ישנם שישה שלבים עיקריים בפרוטוקול: (1) הכנה של עכברים זכרים SAMR1 בני 50 שבועות ועכברים זכרים SAMP1; (2) הפקת דגימות דם מהווריד הנבוב התחתון של שני זני העכברים, עם שימוש לאחר מכן בצינור שפיץ עם הפרין, ואחריו צנטריפוגה, כדי לקבל דגימת סרום; (3) מיצוי דגימת כליה מהעכברים - הומוגנייזר סיליקון משמש להומוגניזציה של דגימת הכליה בנפרד, ולאחר מכן הדגימה מועברת למערכת גריסת ביופולימרים על עמוד ספין מיקרוצנטריפוגה11; (4) סה"כ מיצוי RNA (המכיל miRNA) מדגימות הסרום תוך שימוש בעמודת ספין12 מבוססת ממברנת סיליקה וסך RNA המכיל מיצוי miRNA מדגימות הכליה תוך שימוש בעמודת ספין מבוססת קרום סיליקה11; (5) סינתזה של דנ"א משלים (cDNA) מסך הרנ"א באמצעות טרנסקריפטאז הפוך, פולי(A) פולימראז ופריימר אוליגו-dT13,14; ו-(6) לבסוף, קביעת ביטוי miRNA באמצעות qRT-PCR וצבע אינטרקלציה13,14.
פרוטוקול חדש זה התבסס על מחקרים שהצליחו לחלץ ולהעריך miRNAs בסוגים שונים של רקמות11,12,13. מערכת גריסת הביופולימרים של הפרוטוקול הוכחה כבעלת יכולת לטהר RNA כולל באיכות גבוהה מרקמות11. הדיוק והרגישות של היבטים של פרוטוקול זה המשמשים להערכת ביטוי miRNA על ידי qRT-PCR עם צבע אינטרקלציה נקבעו13,14, לדוגמה, סינתזת cDNA עם טרנסקריפטאז הפוך, פולי(A) פולימראז ופריימרים oligo-dT מהרנ"א הכולל שחולץ. לפרוטוקול החדש מספר יתרונות: פשטות, חיסכון בזמן וצמצום טעויות טכניות. זה יכול, אם כן, לשמש לחקירות הדורשות זיהוי מדויק ורגיש של פרופילי miRNA כליות וסרום. מחקרים של מצבים פתולוגיים רבים יכולים גם הם להשתמש בפרוטוקול החדש.
פרופילי הביטוי miRNA בעכברי SAMP1, שהם מודל של פגיעה כלייתית תלוית גיל, ניתנים לקביעה כפי שמוצג להלן. אצל בני אדם, פגיעה כלייתית תלוית גיל קשורה להתקדמות של אי ספיקת כליות ומאופיינת הן על ידי עלייה באזור של פיברוזיס אינטרסטיציאלי כלייתי והן על ידי התקדמות של glomerulosclerosis15,16. פגיעה כלייתית תלוית גיל היא גם מאפיין חשוב ושכיח של מחלת כליות כרונית ומחלת כליות סופנית15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL spitz with heparin</td>
			<td>Greiner-bio-one</td>
			<td>450534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-223-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003871</td>
			<td>5&#39;-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU 
			G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-423-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00012005</td>
			<td>5&#39;-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU 
			UU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-7218-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG 
			-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-7219-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA 
			GA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217184</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit (reverse transcription buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed due to confidentiality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMP1 male mice</td>
			<td>Nippon SLC Corporation</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMR1 male mice</td>
			<td>Nippon SLC Corporation</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microrna expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment

מיקרו-רנ"א (miRNAs) הם רנ"א קטנים ולא מקודדים המורכבים מ-21-25 בסיסים. הם אינם מתורגמים לחלבונים אלא פועלים כדי לעכב את תפקודם של רנ"א שליח המטרה שלהם (mRNA) על ידי ערעור יציבותם ושיבוש התרגום שלהם. למרות שפרופילי ביטוי ה-miRNA באיברי עכברים שונים וברקמות שונות נחקרו, לא היו שיטות סטנדרטיות לטיהור וכימות של כליות עכברים ו-miRNAs בסרום. ביססנו שיטה יעילה ואמינה לחילוץ והערכה של ביטוי miRNA בסרום ובכליות של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל. 
השיטה משתמשת בתגובת שרשרת כמותית של שעתוק הפוך-פולימראז (qRT-PCR), והפרוטוקול דורש שישה שלבים: (1) הכנת עכברי התנגדות עכברים מואצים 1 (SAMR1) ועכברי עכברים המואצים על ידי סנסנציה (SAMP1); (2) הפקת דגימות סרום מעכברים אלה; (3) הוצאת דגימת כליה מכל עכבר; (4) חילוץ RNA כולל (כולל miRNA) מדגימות כליות וסרום מכל עכבר; (5) סינתזה של דנ"א משלים (cDNA) עם שעתוק הפוך מה-miRNA; (6) ביצוע qRT-PCR באמצעות ה-cDNA המתקבל. 
פרוטוקול זה שימש כדי לאשר כי, בהשוואה לבקרים, הביטוי של miRNA-7218-5p ו- miRNA-7219-5p השתנה באופן משמעותי בכליות ובסרום של מודל עכבר של פגיעה כלייתית תלוית גיל. פרוטוקול זה גם הבהיר את הקשר בין הכליה לסרום של מודל העכבר של פגיעה כלייתית תלוית גיל. פרוטוקול זה יכול לשמש לקביעת ביטוי miRNA בכליות ובסרום של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל.

עבור מודל עכברי הפגיעה הכלייתית תלוי הגיל, השתמשנו בעכברים זכרים SAMP1 בני 50 שבועות במשקל 40-45 גרם. כ-0.8 מ"ל דם נאסף לכל עכבר והועבר לצינור שפיץ של 1.0 מ"ל עם הפרין, הפוך וצנטריפוגה. כל כליה נשטפה ב-PBS, נותחה ואוחסנה בחנקן נוזלי לצורך ניתוח נוסף. עכברי SAMR1 בני חמישים שבועות שימשו כבקרה. בהתבסס על נתוני miRNA qRT-PCR שהתקבלו באמצעות מודל זה של פגיעה כלייתית תלוית גיל, ראינו שרמת הכליות של miRNA-7219-5p עלתה באופן משמעותי ורמת הכליות של miRNA-7218-5p ירדה במידה ניכרת בעכברי SAMP1 בהשוואה לבקרים (איור 1). רמות ה-miRNA-7219-5p וה-miRNA-7218-5p בסרום היו גבוהות משמעותית בעכברי SAMP1 בהשוואה לבקרים (איור 2). רמות הביטוי של miRNA-223-3p לא השתנו באף אחד מהזנים ובין הכליות לסרום (איור 1 ואיור 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig01.jpg"> איור 1: מיקרו-רנ"א המתבטא באופן דיפרנציאלי בכליות של עכברי SAMP1. ניתוח qRT-PCR של הביטוי של miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p ו-miRNA-7219-5p בעכברי SAMR1 (בקרה, n = 4) ובעכברי SAMP1 (n = 4). הנתונים ממוצעים ± שגיאת תקן (קווי שגיאה); מבחני t שימשו לניתוח הבדלים בין קבוצות; p < 0.05 נחשב משמעותי (*p < 0.05), n.s.: לא משמעותי. קיצורים: miRNA = מיקרו-רנ"א; SAMP1 = עכבר מואץ מואץ; SAMR1 = התנגדות עכבר מואצת סנסנציה 1; qRT-PCR = תגובת שרשרת כמותית של שעתוק הפוך-פולימראז. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig02.jpg"> איור 2: miRNAs המתבטאים באופן דיפרנציאלי בסרום של עכברי SAMP1. ניתוח qRT-PCR של הביטוי של miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p ו-miRNA-7219-5p בעכברי SAMR1 (בקרה, n = 4) ובעכברי SAMP1 (n = 4). הנתונים ממוצעים ± SE (קווי שגיאה); מבחני T שימשו כדי לחקור הבדלים משמעותיים בין קבוצות. *P < 0.05 על ידי T-test. קיצורים: miRNA = מיקרו-רנ"א; SAMP1 = עכבר מואץ מואץ; SAMR1 = התנגדות עכבר מואצת סנסנציה 1; qRT-PCR = תגובת שרשרת כמותית של שעתוק הפוך-פולימראז <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment at JoVE.com

Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment

אנו מציגים שיטה להערכת ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות ובסרום של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל על ידי תגובת שרשרת פולימראז כמותית של שעתוק הפוך.

הערכת תגובת שרשרת פולימראז כמותית בזמן אמת של ביטוי מיקרו-רנ"א בכליות ובסרום של עכברים עם פגיעה כלייתית תלוית גיל

MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs consisting of 21-25 bases. They are not translated into proteins but rather work to impede the functioning of ...

שיטת qRT-PCR זו יכולה לענות על שאלות הקשורות ליצירת פרופיל ביטוי מיקרו-רנ"א בסרום של עכברים במצבים כגון פגיעה כלייתית תלוית גיל. הטכניקה מאפשרת זיהוי ביטוי מיקרו רנ"א בדיוק וברגישות גבוהים על ידי תהליך פשוט החוסך זמן ומונע טעויות טכניות. כדי להתחיל, לחדור את העור של הבטן באמצעות פינצטה ומספריים כירורגיים.חותכים את השרירים בקרום הצפק משלפוחית השתן לקצה השמאלי התחתון של הצלעות. הרם את קרום הצפק באמצעות פינצטה, ולעשות חתך לרוחב בקצה העליון עם מספריים כירורגיים. ממשיכים את החתך לאורך הקצה הנמוך ביותר של הצלעות.זהה את הווריד הנבוב התחתון באמצעות שני מקלוני צמר גפן לחים PBS. הכנס מחט של 30 גרם המחוברת למזרק של 1 מיליליטר לתוך הווריד הנבוב התחתון, ומשוך את המזרק. לאט לאט למשוך את המחט החוצה כדי למנוע המוליזה.מעבירים את הדם לצינור שפיץ של מיליליטר אחד עם הפרין, ומערבבים על ידי היפוך. צנטריפוגה של צינור spitz במשך 10 דקות ב 3000 פעמים G בטמפרטורת החדר. העבירו את הסופר-נטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר.קח 200 מיקרוליטר של דגימת סרום, והוסף 1, 000 מיקרוליטר של מגיב ליזה על בסיס פנול / גואנידין. מערבבים את התערובת במשך 5 שניות, ודוגרים בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של כלורופורם, ומערבבים על ידי היפוך הצינור 15 פעמים.דגירה של הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה. מבלי להפריע לכדור, העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי של 1.5 מיליליטר. מוסיפים 450 מיקרוליטרים של 100% אתנול, ומערבבים את הצינור למשך 5 שניות.לאחר מכן טען 700 מיקרוליטרים של הדגימה על עמוד ספין מעוגן ממברנה, וצנטריפוגה אותו. השליכו את הזרימה, והוסיפו 700 מיקרוליטרים של Wash Buffer 1 המסופקים בערכה. צנטריפוגה שוב, ולהשליך את הזרימה.חזור על לשטוף עם 500 microliters של Wash Buffer 2 כדי להסיר מלחי קורט. הוסף 500 מיקרוליטרים של 80% אתנול, צנטריפוגה, והשלך את הזרימה דרך צינור האיסוף. צנטריפוגה עמודת ספין שוב, ולהעביר את הטור לצינור איסוף טרי 1.5 מיליליטר.לאחר מכן מוסיפים 14 מיקרוליטרים של מים ללא RNase, ודוגרים במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. סובבו את העמודה שוב במשך דקה אחת ב-15000 פעמים G בטמפרטורת החדר. הכינו תמיסת תערובת מאסטר, והוסיפו 8 מיקרוליטרים לבאר בצינור רצועה של 8 בארות.הוסיפו 12 מיקרוליטרים של הרנ"א הכולל המופק בכל צינור, וצנטריפוגה של הצינור למשך 15 שניות ב-2000 פעמים G בטמפרטורת החדר. מניחים את הצינור במחזור תרמי, ומתחילים את הדגירה כדי לסנתז את ה-cDNA. לאחר הדגירה, העבירו את ה-cDNA לצינור מיקרוצנטריפוגה טרי.יש לדלל את ה-cDNA פי עשרה במים מזוקקים. ואז מערבולת, ואחריה צנטריפוגה במשך 5 שניות ב 2000 פעמים G בטמפרטורת החדר. בצינור מיקרוצנטריפוגה, הכינו את תמיסת תערובת האב כמתואר בפרוטוקול הטקסט, ומערבבים את הפתרון.הוסיפו 22.5 מיקרוליטרים בכל באר של צלחת בת 96 בארות, ואחריהם 2.5 מיקרוליטרים של cDNA. אטמו את הצלחת באמצעות סרט דבק, וסובבו את הצלחת למשך 30 שניות במהירות של 1000 פעמים G.הניחו את הצלחת במערכת ה-PCR בזמן אמת. שנה את ההגדרות על-ידי מתן שם לניסוי.לאחר מכן בחר 96-well 0.2 מיליליטר כסוג הניסוי, CT השוואתי כשיטת הכמות, סטנדרטי כמצב הפעלת המערכת, וריאגנטים ירוקים SYBR כריאגנטים לזיהוי רצף המטרה. ספק שמות לדגימה ול-miRNA היעד בכל באר. הקצה דגימות כפולות, בחר דגימת ייחוס ופקד אנדוגני, ובחר ללא עבור הצבע שישמש כהפניה הפסיבית.כדי למנוע זיהום צולב מגיב, הגדר טרנסקריפטאז הפוך שלילי ובקרה שאינה תבנית לביטוי miRNA. לאחר מכן יש לוודא שנפח התגובה מוגדר ל-20 מיקרוליטרים, ותנאי מחזור ה-PCR נקבעים על 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, ולאחר מכן 40 מחזורים של דנטורציה ב-94 מעלות צלזיוס למשך 15 שניות, חישול ב-55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, והארכה ב-70 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. לאחר השלמת התהליך, לחץ על ניתוח כדי לנתח את נתוני qRT-PCR.ודא ששורת הסף שנבחרה באופן אוטומטי על-ידי התוכנית מתאימה לכל באר. בדוק את ערך מחזור הסף של הבקרה האנדוגנית ו- miRNAs היעד שנותחו בכל דגימה. קבע את ערכי ה- CT לפי ההצטלבות של עקומת ההגברה וקו הסף.נתוני miRNA qRT-PCR עבור מודל הפגיעה הכלייתית תלוית הגיל הראו כי בהשוואה לעכברי בקרה SAMR1, רמת הכליות של miRNA-7219-5p עלתה באופן משמעותי בעכברים ניסיוניים SAMP1, בעוד שרמת הכליות של miRNA-7218-5p ירדה. רמות הביטוי של miRNA-223-3p לא השתנו באף אחד מהזנים. רמות ה-miRNA-7219-5p וה-miRNA-7218-5p בסרום עלו במידה ניכרת בעכברי SAMP1, בעוד שרמות ה-miRNA-223-3p לא השתנו.אתה צריך להכניס את המחט לתוך הווריד הנבוב נחות ולחלץ דם מבלי לחדור את כלי השיט. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לענות על שאלות מפתח בפרופיל ביטוי מיקרו-רנ"א בסרום עכברים עבור מגוון רחב של מצבים פתולוגיים.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

שרשרת פולימראז משופר אורך קטע התגובה הגבלת Genotyping פולימורפיזם של נפוחיתיים רעילים ידי נוזלי כרומטוגרפיה / ספקטרומטריית מסה

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

T7 RNA פולימראז בתיווך Multigene הביטוי מערכת, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

איתור הביטוי microRNA בממברנה פריטוניאלית של חולדות באמצעות כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

גילוי הכמותיים למחצה של RNA תלוית RNA פולימראז פעילות החלבון רוורס טרנסקריפטאז טלומראז אנושי

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

CRISPR בתיווך ארגון מחדש של הכרומטין לולאה

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Droplet יחיד שרשרת התגובה פולימראז דיגיטלי עבור זיהוי מקיף, בו זמנית של מוטציות באזורים חמה

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

זיהוי של אירועי רקומבינציה הומולוגית בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג הדרומי ואת תגובת שרשרת פולימראזית

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...