Name: quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microrna expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment
Uploaded: 2022-04-29T13:00:00
Duration: 6 min 48 s
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	<li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+regulatory+role+of+lncRNA-miRNA-mRNA+axis+in+cardiovascular+diseases.">The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).</li><li>Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA-106b-5p+in+human+cancers:+diverse+functions+and+promising+biomarker.">MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211 (2020).</li><li>Lu, T. X., Rothenberg, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. 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B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate.">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate.</a> BMC Genomics. 6, 59 (2005).</li><li>Petriella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+profiling+in+serum+and+tissue+samples+to+assess+noninvasive+biomarkers+for+NSCLC+clinical+outcome.">miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome.</a> Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).</li><li>Skrzypa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-146a-5p+is+upregulated+in+serum+and+cartilage+samples+of+patients+with+osteoarthritis.">miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis.</a> Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).</li><li>Farzanehpour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+tissue+miRNAs:+potential+biomarkers+for+the+diagnosis+of+cervical+cancer.">Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer.</a> Journal of Virology Journal. 16 (1), 116 (2019).</li></ol>

著者は、利益相反がないことを宣言します。

標的miRNAの発現レベルは、qRT−PCRを用いた上述のプロトコルによって首尾よく決定された。抽出されたmiRNAの評価は、意味のあるqRT-PCRデータを得るための重要なステップです。qRT-PCRを実行する前にmiRNAの適切な品質を確認するには、分光光度法を使用して、260 nmの吸光度と280 nmの吸光度の比を決定する必要があります。qRT-PCRが予想される長さと融解温度の単一のPCR増幅を提供しない場合、またはモノモーダル融解曲線を提供する場合、DNA汚染が発生する可能性があり、および/または反応プレートの各ウェルにプライマーダイマーが存在する可能性があります。
MiRNA発現レベルは、ノーザンブロッティング、マイクロアレイ、リボヌクレアーゼ保護アッセイなど、qRT-PCR以外のいくつかの方法で評価できます。ただし、qRT-PCR法は、ノーザンブロッティングおよびリボヌクレアーゼ保護アッセイに必要なサンプル量よりも少ないサンプル量を必要とする、高感度、正確、単純、かつ再現性のある手順です19。マイクロアレイは数万個のmiRNAの発現を同時に測定できるため、候補となるmiRNAマーカーの同定に使用できます。マイクロアレイデータはまた、qRT−PCR20によって得られたデータと高い全体的な相関を示す。しかし、異なる研究で得られたマイクロアレイデータを比較するための最適な方法論に関してはコンセンサスに達していません21。
血清miRNAの評価には以下のような特徴があります。まず、血清の採取が容易であり、血清miRNAは凍結融解、温度、酸に対して安定であるため、miRNAは優れたバイオマーカーになり得ます。第二に、種間のmiRNAの高い相同性があり、動物実験の結果はヒトに容易に外挿されます。第三に、血清miRNAは治療薬としての可能性を示しています3。いくつかの研究はまた、臓器におけるmiRNAの発現レベルが血清中のmiRNAと相関していることを実証している22,23,24。本試験において、miRNA-223-3pは、腎臓レベルがSAMR1マウスとSAMP1マウスとの間に有意差を示さなかったが、血清中にも系統間有意差を示さなかった。対照的に、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pは、腎臓レベルがSAMR1マウスとSAMP1マウスの間で有意差を示したが、血清中にかなりの系統間差異を示した。
このプロトコルには、次の制限があります。第一に、その有用性は肝臓や肺などの他の臓器で検証されておらず、第二に、ラット、イヌ、ブタなどの他の実験動物ではテストされていません。いくつかの研究グループは、qRT-PCRによるmiRNAの精製と検出にこのプロトコルを使用し、このプロトコルが組織および血清からの高品質のRNAの精製を可能にすることを報告しました13,14,22,23,24。この方法は、miRNA13、14、22、23、24の発現を検出するための高い精度および感度を有することが実証されている。本研究の結果は、このプロトコルがマウスの血清および腎臓におけるmiRNA発現を首尾よく検出できることを示しています。したがって、このプロトコルを使用して、さまざまな病状を持つマウスの血清および腎臓miRNA発現プロファイルを決定することができます。プロトコルがシンプルなため、多数のサンプルを同時に処理できます。腎臓の様々な病的状態における多くのmiRNAの発現の分析は、したがって、本明細書に記載のプロトコールを使用することができる。
覚えておくべきプロトコルの特定の側面があります。室温で起こる精製されたmiRNAの分解を避けるために、miRNAは氷上に保たれなければなりません。腎臓サンプルは、溶解試薬に完全に溶解するまで均質化する必要があります。マウス腎臓には、溶解試薬に不溶性の結合組織が大量に含まれているため、さらなる均質化にはカラムシュレッダーが必要です。さらに、適切な内因性コントロールmiRNA(サンプル間で安定した発現を有する)は、qRT-PCR実験のセットアップ全体を通して検証する必要があります。これは、このプロトコルの実行中のさまざまな物質の干渉が内因性コントロールmiRNAの発現レベルを変化させ、結果を損なう可能性があるためです。結論として、この論文は、加齢性腎機能障害を有するマウスの血清および腎臓におけるmiRNA発現の検出、精製、および評価のためのqRT-PCRプロトコルについて述べる。

生理機能と疾患(炎症、線維症、代謝障害、がんなど)の両方で重要な役割を果たす様々なmRNAの発現は、mRNA1の分解を引き起こして転写を阻害する短いノンコーディングRNAであるmiRNAによって制御されていることが知られています。したがって、特定のmiRNAがさまざまな疾患の新しい候補バイオマーカーおよび/または治療標的として役立つ可能性があります2,3,4,5。さまざまなマウスの臓器や組織(脳6、心臓7、肺8、肝臓9、腎臓10など)におけるmiRNA発現プロファイルに関する研究が行われています。しかし、加齢依存性腎障害を有するマウスの腎臓または血清中のmiRNAを抽出および評価するための標準的または確立された方法はありません。
そこで、加齢依存性腎機能障害を有するマウスの血清および腎臓におけるmiRNA発現を確実に精製および検出するために使用できるプロトコルを確立しました。プロトコルには6つの主要なステップがあります:(1)50週齢のSAMR1オスマウスとSAMP1オスマウスの両方の準備。(2)両系統のマウスの下大静脈から血液試料を抽出し、その後ヘパリンを含むスピッツ管を使用し、続いて遠心分離して、血清試料を得る工程;(3)マウスからの腎臓サンプル抽出-シリコンホモジナイザーを使用して腎臓サンプルを個別にホモジナイズし、サンプルをマイクロ遠心スピンカラム11上の生体高分子細断システムに移します。(4)シリカ膜ベースのスピンカラム12を用いた血清試料からのトータルRNA(miRNA含有)抽出、およびシリカ膜ベースのスピンカラム11を用いた腎臓サンプルからのmiRNAを含む全RNA抽出;(5)逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびオリゴdTプライマーを用いた全RNAからの相補的DNA(cDNA)の合成13,14;(6)最後に、qRT-PCRおよびインターカレーティング色素を用いたmiRNA発現の測定13、14。
この新しいプロトコルは、さまざまな種類の組織でmiRNAを抽出して評価することに成功した研究に基づいていました11,12,13。プロトコルのバイオポリマーシュレッダーシステムは、組織から高品質のトータルRNAを精製できることが実証されました11。インターカレーティング色素を用いたqRT-PCRによるmiRNA発現の評価に使用されるこのプロトコルの側面の精度と感度は確立されており13,14、例えば、抽出された全RNAからの逆転写酵素、ポリ(A)ポリメラーゼ、およびoligo-dTプライマーによるcDNA合成。新しいプロトコルには、シンプルさ、時間の節約、技術的エラーの削減など、いくつかの利点があります。したがって、腎臓および血清miRNAプロファイルの正確で高感度な同定を必要とする調査に使用できます。多くの病理学的状態の研究も新しいプロトコルを利用することができます。
加齢性腎障害のモデルであるSAMP1マウスにおけるmiRNA発現プロファイルは、以下に示すように決定することができる。ヒトでは、加齢性腎障害は腎不全の進行に関連しており、腎間質線維症の領域の増加と糸球体硬化症の進行の両方を特徴としています15,16。加齢性腎障害も慢性腎臓病および末期腎疾患の重要かつ頻繁な特徴である15,16。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL spitz with heparin</td>
			<td>Greiner-bio-one</td>
			<td>450534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-223-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003871</td>
			<td>5&#39;-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU 
			G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-423-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00012005</td>
			<td>5&#39;-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU 
			UU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-7218-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG 
			-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-7219-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA 
			GA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217184</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit (reverse transcription buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed due to confidentiality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMP1 male mice</td>
			<td>Nippon SLC Corporation</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMR1 male mice</td>
			<td>Nippon SLC Corporation</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microrna expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment

マイクロRNA(miRNA)は、21〜25塩基からなる小さなノンコーディングRNAです。それらはタンパク質に翻訳されるのではなく、標的メッセンジャーRNA(mRNA)を不安定にし、翻訳を破壊することによって、それらの機能を妨げる働きをします。さまざまなマウスの臓器や組織におけるmiRNA発現プロファイルが調査されていますが、マウスの腎臓および血清miRNAを精製および定量するための標準的な方法はありませんでした。我々は、加齢性腎障害を有するマウスの血清および腎臓におけるmiRNA発現を抽出および評価するための有効かつ信頼性の高い方法を確立しました。 
この方法は、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)を使用し、プロトコルには6つのステップが必要です:(1)老化加速マウス耐性1(SAMR1)マウスおよび老化加速マウス伏せ(SAMP1)マウスの準備。(2)これらのマウスから血清試料を抽出する工程;(3)各マウスから腎臓試料を抽出する工程;(4)各マウスの腎臓および血清サンプルからトータルRNA(miRNAを含む)を抽出する工程;(5)miRNAからの逆転写を伴う相補的DNA(cDNA)の合成;(6)得られたcDNAを用いてqRT-PCRを行う工程。 
このプロトコルを使用して、対照と比較して、miRNA-7218-5pおよびmiRNA-7219-5pの発現が、加齢性腎障害のマウスモデルの腎臓および血清において有意に変化したことを確認した。このプロトコールはまた、加齢性腎障害のマウスモデルの腎臓と血清との関係を明らかにした。このプロトコルは、加齢依存性腎機能障害を有するマウスの腎臓および血清におけるmiRNA発現を決定するために使用することができる。

加齢性腎障害マウスモデルでは、体重40〜45gの50週齢SAMP1雄マウスを使用し、マウスあたり約0.8mLの血液を採取し、ヘパリンを入れた1.0mLスピッツチューブに移し、倒立させ、遠心分離した。各腎臓をPBSですすぎ、解剖し、さらなる分析のために液体窒素に保存しました。50週齢のSAMR1マウスが対照として役立った。この加齢性腎障害モデルを用いて得られたmiRNA qRT-PCRデータに基づいて、SAMP1マウスでは、対照と比較してmiRNA-7219-5pの腎臓レベルが有意に増加し、miRNA-7218-5pの腎臓レベルが大幅に低下していることが観察されました(図1)。miRNA-7219-5pとmiRNA-7218-5pの両方の血清レベルは、対照と比較してSAMP1マウスで有意に増加しました(図2)。miRNA-223-3pの発現レベルは、いずれの系統でも、また腎臓と血清の間でも変化しませんでした(図1および図2)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig01.jpg"> 図1:SAMP1マウスの腎臓における発現差のあるマイクロRNA 。 SAMR1マウス(対照、n = 4)およびSAMP1マウス(n = 4)におけるmiRNA-223-3p、miRNA-7218-5p、およびmiRNA-7219-5pの発現のqRT-PCR分析。データは標準誤差(エラーバー)±平均値です。 T検定は、グループ間の差を分析するために使用されました。p < 0.05は有意と見なされました(*P < 0.05)、N.S.:有意ではありません。略語:マイクロRNA =マイクロRNA;SAMP1 =老化加速マウスが起こりやすい;SAMR1 = 老化加速マウス抵抗性1;qRT-PCR = 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig02.jpg"> 図2:SAMP1マウスの血清中の発現差のあるmiRNA 。 SAMR1マウス(対照、n = 4)およびSAMP1マウス(n = 4)におけるmiRNA-223-3p、miRNA-7218-5p、およびmiRNA-7219-5pの発現のqRT-PCR分析。データはSE(エラーバー)±平均値です。 T検定は、群間の有意差を調べるために用いられた。*p < t検定で0.05。略語:マイクロRNA =マイクロRNA;SAMP1 =老化加速マウスが起こりやすい;SAMR1 = 老化加速マウス抵抗性1;qRT-PCR = 定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment

加齢性腎機能障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現を定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を提示する。

加齢性腎障害マウスの腎臓および血清におけるマイクロRNA発現の定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応評価

MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs consisting of 21-25 bases. They are not translated into proteins but rather work to impede the functioning of ...

このqRT-PCR法は、加齢性腎障害などの状態のマウスの血清中のマイクロRNA発現プロファイリングに関連する質問に対処することができます。この技術は、時間を節約し、技術的なエラーを防ぐ簡単なプロセスによって、高精度かつ高感度でマイクロRNA発現の検出を可能にします。はじめに、ピンセットと外科用ハサミを使用して腹部の皮膚を切開します。腹膜の筋肉を膀胱から肋骨の左下端まで切ります。ピンセットを使用して腹膜を持ち上げ、外科用ハサミで上端を横方向に切開します。肋骨の下端に沿って切開を続けます。PBSで湿らせた綿棒2本を使用して、下大静脈を特定します。1ミリリットルの注射器に取り付けられた30Gの針を下大静脈に挿入し、注射器を引きます。溶血を避けるためにゆっくりと針を引き抜きます。血液をヘパリンを含む1ミリリットルのスピッツチューブに移し、反転させて混合します。スピッツチューブを室温で3000倍Gで10分間遠心分離します。上清を新しい1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移します。200マイクロリットルの血清サンプルを取り、1, 000マイクロリットルのフェノール/グアニジンベースの溶解試薬を加えます。混合物を5秒間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートする。200マイクロリットルのクロロホルムを加え、チューブを15回反転させて混合する。サンプルを室温で3分間インキュベートし、続いて遠心分離します。ペレットを乱すことなく、上清を新しい1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。450マイクロリットルの100%エタノールを加え、チューブを5秒間ボルテックスします。次に、700マイクロリットルのサンプルをメンブレンアンカースピンカラムにロードし、遠心分離します。フロースルーを廃棄し、キットに含まれている700マイクロリットルの洗浄バッファー1を追加します。再度遠心分離し、フロースルーを廃棄する。500マイクロリットルの洗浄バッファー2で洗浄を繰り返し、微量の塩分を除去します。500マイクロリットルの80%エタノールを加え、遠心分離機で、収集チューブからのフロースルーを廃棄します。スピンカラムを再度遠心分離し、カラムを新しい1.5ミリリットルの収集チューブに移します。次に、14マイクロリットルのRNaseフリー水を加え、室温で5分間インキュベートします。カラムを室温で15000倍Gで1分間再度スピンさせる。マスターミックス溶液を調製し、8ウェルストリップチューブにウェルあたり8マイクロリットルを追加します。抽出したトータルRNAを各チューブに12マイクロリットル加え、室温で2000倍Gで15秒間チューブを遠心分離する。チューブをサーマルサイクラーに入れ、インキュベーションを開始してcDNAを合成します。インキュベーション後、cDNAを新しいマイクロ遠心チューブに移します。cDNAを蒸留水で10倍に希釈します。その後ボルテックス、室温で2000倍Gで5秒間遠心分離を行った。マイクロ遠心チューブ内で、テキストプロトコルに記載されているようにマスターミックス溶液を調製し、溶液をボルテックスします。96ウェルプレートの各ウェルに22.5マイクロリットルのアリコートを加え、続いて2.5マイクロリットルのcDNAを加えます。粘着フィルムを使用してプレートを密封し、プレートを1000回G.で30秒間遠心分離します プレートをリアルタイムPCRシステムに入れます。実験の名前を指定して設定を変更します。次に、実験タイプとして96ウェル0.2ミリリットル、定量方法として比較CT、システム実行モードとして標準、およびターゲット配列を検出するための試薬としてSYBR Green試薬を選択します。各ウェルのサンプルとターゲット miRNA の名前を指定します。重複サンプルを割り当て、参照サンプルと内在性コントロールを選択し、パッシブリファレンスとして使用する色素にはなしを選択します。試薬のクロスコンタミネーションを排除するには、陰性の逆転写酵素とmiRNA発現の非テンプレートコントロールを設定します。次に、反応量を20マイクロリットルに設定し、PCRサイクル条件を摂氏95度で15分間設定し、次に摂氏94度で15秒間40サイクル変性し、摂氏55度で30秒間アニーリングし、摂氏70度で30秒間伸長します。プロセスが完了したら、分析をクリックしてqRT-PCRデータを分析します。プログラムによって自動的に選択された閾値線が各ウェルに適していることを確認します。各サンプルで分析された内在性コントロールおよび標的miRNAの閾値サイクル値を確認します。増幅曲線と閾値線の交点によってCT値を決定する。加齢腎障害モデルのmiRNA qRT-PCRデータは、SAMR1対照マウスと比較して、SAMP1実験マウスではmiRNA-7219-5pの腎臓レベルが有意に増加し、miRNA-7218-5pの腎臓レベルが低下したことを示しました。miRNA-223-3pの発現レベルは、いずれの株においても変化しなかった。miRNA-7219-5pおよびmiRNA-7218-5pの両方の血清レベルはSAMP1マウスで有意に増加したが、miRNA-223-3pのレベルは変化しなかった。下大静脈に針を挿入し、血管を貫通せずに血液を抽出する必要があります。この方法は、幅広い病的状態に対するマウス血清中のマイクロRNA発現プロファイリングにおける重要な質問に答えるために使用できます。

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

液体クロマトグラフィー/質量分析法による有毒フグの改善されたポリメラーゼ連鎖反応 - 制限断片長多型ジェノタイピング

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

誘導性T7 RNAポリメラーゼ媒介マルチ遺伝子発現システム、pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

定量的リアルタイムPCRを用いたラットの腹膜におけるマイクロRNA発現の検出

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

テロメラーゼ逆転写酵素蛋白質の RNA 依存 RNA ポリメラーゼ活性の半定量的な検出

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

クロマチンのループ構造の再編を CRISPR 媒介

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

ホット スポット領域の変異の包括的かつ同時検出のための単一液滴デジタル ポリメラーゼの連鎖反応

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...