Name: quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microrna expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment
Uploaded: 2022-04-29T13:00:00
Duration: 6 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment at JoVE.com

Никакой.

<ol>
	<li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+regulatory+role+of+lncRNA-miRNA-mRNA+axis+in+cardiovascular+diseases.">The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).</li><li>Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA-106b-5p+in+human+cancers:+diverse+functions+and+promising+biomarker.">MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211 (2020).</li><li>Lu, T. X., Rothenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA.">MicroRNA.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (4), 1202-1207 (2018).</li><li>McGuire, A., Brown, J. A., Kerin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metastatic+breast+cancer:+the+potential+of+miRNA+for+diagnosis+and+treatment+monitoring.">Metastatic breast cancer: the potential of miRNA for diagnosis and treatment monitoring.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 34 (1), 145-155 (2015).</li><li>Bjorkman, S., Taylor, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+in+endometriosis:+biological+function+and+emerging+biomarker+candidates.">MicroRNAs in endometriosis: biological function and emerging biomarker candidates.</a> Biology of Reproduction. 100 (5), 1135-1146 (2019).</li><li>Zhou, C. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+and+circRNA+expression+patterns+in+mouse+brain+during+toxoplasmosis+development.">miRNA and circRNA expression patterns in mouse brain during toxoplasmosis development.</a> BMC Genomics. 21 (1), 46 (2020).</li><li>Jing, R., Zhong, Q. Q., Long, T. Y., Pan, W., Qian, Z. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downregulated+miRNA-26a-5p+induces+the+apoptosis+of+endothelial+cells+in+coronary+heart+disease+by+inhibiting+PI3K/AKT+pathway.">Downregulated miRNA-26a-5p induces the apoptosis of endothelial cells in coronary heart disease by inhibiting PI3K/AKT pathway.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 23 (11), 4940-4947 (2019).</li><li>Xie, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miR-34b-5p+inhibition+attenuates+lung+inflammation+and+apoptosis+in+an+LPS-induced+acute+lung+injury+mouse+model+by+targeting+progranulin.">miR-34b-5p inhibition attenuates lung inflammation and apoptosis in an LPS-induced acute lung injury mouse model by targeting progranulin.</a> Journal of Cellular Physiology. 233 (9), 6615-6631 (2018).</li><li>Bala, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+exosomes+indicate+hepatocyte+injury+and+inflammation+in+alcoholic,+drug-induced,+and+inflammatory+liver+diseases.">Circulating microRNAs in exosomes indicate hepatocyte injury and inflammation in alcoholic, drug-induced, and inflammatory liver diseases.</a> Hepatology. 56 (5), 1946-1957 (2012).</li><li>Ishii, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+expression+profiling+in+diabetic+kidney+disease.">MicroRNA expression profiling in diabetic kidney disease.</a> Translational Research. 237, 31-52 (2021).</li><li>Mastropasqua, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNA+levels+in+diabetes+mellitus.">Serum microRNA levels in diabetes mellitus.</a> Diagnostics (Basel). 11 (2), 284 (2021).</li><li>Gordanpour, A., Nam, R. K., Sugar, L., Bacopulos, S., Seth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+detection+in+prostate+tumors+by+quantitative+real-time+PCR+(qPCR).">MicroRNA detection in prostate tumors by quantitative real-time PCR (qPCR).</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (63), e3874 (2012).</li><li>Ahn, J. H., Kwak, J., Lee, J. H., Lee, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+accurate+analysis+of+microRNA+using+a+specific+extension+sequence.">Efficient and accurate analysis of microRNA using a specific extension sequence.</a> Molecular Biology Reports. 45 (4), 611-619 (2018).</li><li>Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+changes+With+the+aging+kidney.">Structural and functional changes With the aging kidney.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).</li><li>Weinstein, J. R., Anderson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+aging+kidney:+physiological+changes.">The aging kidney: physiological changes.</a> Advances in Chronic Kidney Disease. 17 (4), 302-307 (2010).</li><li>Bustin, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+array-based+gene+expression+profiles+by+real-time+(kinetic)+RT-PCR.">Validation of array-based gene expression profiles by real-time (kinetic) RT-PCR.</a> The Journal of Molecular Diagnostics. 3 (1), 26-31 (2001).</li><li>Chen, Y., Gelfond, J. A., McManus, L. M., Shireman, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducibility+of+quantitative+RT-PCR+array+in+miRNA+expression+profiling+and+comparison+with+microarray+analysis.">Reproducibility of quantitative RT-PCR array in miRNA expression profiling and comparison with microarray analysis.</a> BMC Genomics. 10, 407 (2009).</li><li>Dallas, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+levels+assessed+by+oligonucleotide+microarray+analysis+and+quantitative+real-time+RT-PCR+--+how+well+do+they+correlate.">Gene expression levels assessed by oligonucleotide microarray analysis and quantitative real-time RT-PCR -- how well do they correlate.</a> BMC Genomics. 6, 59 (2005).</li><li>Petriella, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA+profiling+in+serum+and+tissue+samples+to+assess+noninvasive+biomarkers+for+NSCLC+clinical+outcome.">miRNA profiling in serum and tissue samples to assess noninvasive biomarkers for NSCLC clinical outcome.</a> Tumour Biology. 37 (4), 5503-5513 (2016).</li><li>Skrzypa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNA-146a-5p+is+upregulated+in+serum+and+cartilage+samples+of+patients+with+osteoarthritis.">miRNA-146a-5p is upregulated in serum and cartilage samples of patients with osteoarthritis.</a> Polski Przeglad Chirurgiczny. 91 (3), 1-5 (2019).</li><li>Farzanehpour, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+and+tissue+miRNAs:+potential+biomarkers+for+the+diagnosis+of+cervical+cancer.">Serum and tissue miRNAs: potential biomarkers for the diagnosis of cervical cancer.</a> Journal of Virology Journal. 16 (1), 116 (2019).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Уровни экспрессии целевых миРНК были успешно определены по вышеописанному протоколу с использованием qRT-PCR. Оценка извлеченных миРНК является важным шагом в получении значимых данных qRT-PCR. Для подтверждения адекватного качества миРНК перед выполнением qRT-PCR следует использовать спектрофотометрию для определения отношения абсорбции при 260 нм к соотношению абсорбции при 280 нм. Может произойти загрязнение ДНК, и/или димеры праймера в каждой скважине реакционной пластины могут присутствовать, если qRT-PCR не обеспечивает ни одной ПЦР-амплификации ожидаемой длины и температуры плавления или если она обеспечивает мономодальную кривую плавления.
Уровни экспрессии MiRNA могут быть оценены несколькими методами, отличными от qRT-PCR, включая северное блотттинг, микрочип и анализы защиты рибонуклеазы. Тем не менее, метод qRT-PCR является чувствительной, точной, простой и воспроизводимой процедурой, которая требует меньшего объема образца, чем те, которые требуются для северного блоттинга и анализов защиты рибонуклеазы19. Поскольку микрочипы могут измерять экспрессию десятков тысяч микроРНК одновременно, их можно использовать для идентификации маркеров миРНК-кандидатов. Данные микрочипов также показывают высокую общую корреляцию с данными, полученными с помощью qRT-PCR20. Однако не было достигнуто консенсуса относительно оптимальной методологии сравнения данных микрочипов, полученных в различных исследованиях21.
Оценка сывороточных микроРНК имеет следующие особенности. Во-первых, легко собрать сыворотку, и поскольку сывороточные миРНК устойчивы к замораживанию и оттаиванию, температуре и кислоте, миРНК могут быть хорошими биомаркерами. Во-вторых, среди видов высока гомология миРНК, а результаты экспериментов на животных легко экстраполируются на человека. В-третьих, сывороточные миРНК показали потенциал для использования в качестве терапевтических препаратов3. Несколько исследований также продемонстрировали, что уровень экспрессии миРНК в органах коррелирует с миРНК в сыворотке 22,23,24. В настоящем исследовании miRNA-223-3p, уровни в почках которого не показали существенной разницы между мышами SAMR1 и SAMP1, также не показали значимой разницы между штаммами в сыворотке крови. Напротив, miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p, уровни в почках которых показали значительную разницу между мышами SAMR1 и SAMP1, показали значительные различия между штаммами в сыворотке крови.
Этот протокол имеет следующие ограничения. Во-первых, его полезность не была проверена в других органах, таких как печень и легкие, а во-вторых, он не был протестирован на других лабораторных животных, таких как крысы, собаки и свиньи. Несколько исследовательских групп использовали этот протокол для очистки и обнаружения миРНК с помощью qRT-PCR и сообщили, что этот протокол позволил очистить высококачественную РНК из тканей и сыворотки 13,14,22,23,24. Было продемонстрировано, что этот метод обладает высокой точностью и чувствительностью для обнаружения экспрессии миРНК 13,14,22,23,24. Результаты настоящего исследования показывают, что этот протокол может успешно обнаруживать экспрессию миРНК в сыворотке и почках мышей. Поэтому протокол может быть использован для определения профилей экспрессии миРНК сыворотки и почек у мышей с различными патологиями. Благодаря простоте протокола, большое количество образцов может быть обработано одновременно. Анализы экспрессии многих микроРНК при различных патологических состояниях почек могут, таким образом, использовать протокол, описанный в настоящем описании.
Есть определенные аспекты протокола, которые следует иметь в виду. Чтобы избежать деградации очищенных миРНК, которая будет происходить при комнатной температуре, миРНК должны храниться на льду. Образцы почек должны быть гомогенизированы до тех пор, пока они полностью не растворятся в реагенте лизиса. Почка мыши содержит значительное количество соединительной ткани, которая нерастворима в реагенте лизиса, и, таким образом, для дальнейшей гомогенизации требуется столбчатый измельчитель. Кроме того, соответствующая эндогенная контрольная миРНК (со стабильной экспрессией среди образцов) должна быть проверена на протяжении всего эксперимента qRT-PCR. Это связано с тем, что интерференция различных веществ во время выполнения этого протокола может изменять уровни экспрессии эндогенных контрольных микроРНК, возможно, ставя под угрозу результаты. В заключение в этой статье описывается протокол qRT-PCR для обнаружения, очистки и оценки экспрессии миРНК в сыворотке и почках мышей с возрастной почечной недостаточностью.

Известно, что экспрессия различных мРНК, которые играют важную роль как в физиологии, так и в заболевании (например, воспаление, фиброз, метаболические нарушения и рак), регулируется миРНК, которые являются короткими, некодирующими РНК, которые вызывают деградацию и ингибируют транскрипцию мРНК1. Поэтому возможно, что некоторые микроРНК могут служить новыми кандидатами-биомаркерами и/или терапевтическими мишенями для различных заболеваний 2,3,4,5. Были проведены исследования профилей экспрессии миРНК в различных органах и тканях мышей (включая мозг6, сердце7, легкие8, печень9 и почки10). Однако не существует стандартных или установленных методов извлечения и оценки миРНК в почках или сыворотке мышей с возрастной почечной недостаточностью.
Поэтому мы установили протокол, который можно использовать для надежной очистки и обнаружения экспрессии миРНК в сыворотке и почках мышей с возрастной почечной недостаточностью. Протокол состоит из шести основных этапов: (1) подготовка как 50-недельных самцов мышей SAMR1, так и самцов мышей SAMP1; (2) извлечение образцов крови из нижней полой вены обоих штаммов мышей с последующим использованием шпицевой трубки с гепарином с последующим центрифугированием для получения образца сыворотки; (3) извлечение образца почки из мышей - гомогенизатор кремния используется для гомогенизации образца почки отдельно, и образец затем переносят в систему измельчения биополимеров на спиновой колонке11 микроцентрифуги; (4) извлечение общей РНК (содержащей миРНК) из образцов сыворотки с использованием спиновой колонки12 на основе мембраны кремнезема и полной РНК, содержащей миРНК, экстракции из образцов почек с использованием спиновой колонки11 на основе мембраны кремнезема; (5) синтез комплементарной ДНК (кДНК) из общей РНК с использованием обратной транскриптазы, поли(А) полимеразы и олиго-dT праймера13,14; и (6) наконец, определение экспрессии миРНК с помощью qRT-PCR и интеркалирующего красителя13,14.
Этот новый протокол был основан на исследованиях, которые преуспели в извлечении и оценке микроРНК в различных типах тканей 11,12,13. Было продемонстрировано, что система измельчения биополимеров протокола способна очищать высококачественную общую РНК из тканей11. Точность и чувствительность аспектов этого протокола, используемых для оценки экспрессии миРНК методом qRT-PCR с интеркалирующим красителем, были установлены 13,14, например, синтез кДНК с обратной транскриптазой, поли(А)полимеразой и олиго-dT праймерами из экстрагированной общей РНК. Новый протокол имеет ряд преимуществ: простоту, экономию времени и снижение технических ошибок. Таким образом, он может быть использован для исследований, которые требуют точной и чувствительной идентификации профилей миРНК почек и сыворотки. Исследования многих патологических состояний также могут использовать новый протокол.
Профили экспрессии миРНК у мышей SAMP1, которые являются моделью возрастной почечной недостаточности, могут быть определены, как показано ниже. У человека возрастно-зависимая почечная недостаточность связана с прогрессированием почечной недостаточности и характеризуется как увеличением площади почечного интерстициального фиброза, так и прогрессированием гломерулосклероза15,16. Возрастная почечная недостаточность также является важной и частой особенностью хронической болезни почек и терминальной стадии почечной недостаточности15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL spitz with heparin</td>
			<td>Greiner-bio-one</td>
			<td>450534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-223-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003871</td>
			<td>5&#39;-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU 
			G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-423-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00012005</td>
			<td>5&#39;-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU 
			UU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-7218-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG 
			-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-7219-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA 
			GA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217184</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit (reverse transcription buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed due to confidentiality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMP1 male mice</td>
			<td>Nippon SLC Corporation</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMR1 male mice</td>
			<td>Nippon SLC Corporation</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microrna expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment

МикроРНК (миРНК) представляют собой небольшие, некодирующие РНК, состоящие из 21-25 оснований. Они не переводятся в белки, а скорее работают, чтобы препятствовать функционированию своих целевых мессенджерных РНК (мРНК), дестабилизируя их и нарушая их трансляцию. Хотя были исследованы профили экспрессии миРНК в различных органах и тканях мышей, не было стандартных методов очистки и количественной оценки миРНК почек и сыворотки мыши. Мы установили эффективный и надежный метод извлечения и оценки экспрессии миРНК в сыворотке и почках мышей с возрастной почечной недостаточностью. 
Метод использует количественную обратную транскрипцию-полимеразную цепную реакцию (qRT-PCR), и протокол требует шести этапов: (1) подготовка мышей с ускоренным сопротивлением старению 1 (SAMR1) и мышей, склонных к старению (SAMP1); (2) извлечение образцов сыворотки из этих мышей; (3) извлечение образца почки из каждой мыши; (4) извлечение общей РНК (включая миРНК) из образцов почек и сыворотки крови каждой мыши; (5) синтез комплементарной ДНК (кДНК) с обратной транскрипцией из миРНК; (6) проведение qRT-PCR с использованием полученной кДНК. 
Этот протокол был использован для подтверждения того, что по сравнению с контрольной группой экспрессия miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p была значительно изменена в почках и сыворотке мышиной модели возрастной почечной недостаточности. Этот протокол также прояснил взаимосвязь между почкой и сывороткой мышиной модели возрастной почечной недостаточности. Этот протокол может быть использован для определения экспрессии миРНК в почках и сыворотке мышей с возрастной почечной недостаточностью.

Для мышиной модели с возрастными нарушениями почек мы использовали 50-недельных самцов мышей SAMP1 весом 40-45 г. Примерно 0,8 мл крови было собрано на одну мышь и перенесено в 1,0 мл шпицевой трубки с гепарином, инвертированной и центрифугированной. Каждую почку промывали PBS, рассекали и хранили в жидком азоте для дальнейшего анализа. Пятидесятинедельные мыши SAMR1 служили в качестве контроля. Основываясь на данных миРНК qRT-PCR, полученных с использованием этой возрастно-зависимой модели почечной недостаточности, мы наблюдали, что уровень miRNA-7219-5p в почках был значительно повышен, а уровень miRNA-7218-5p в почках значительно снизился у мышей SAMP1 по сравнению с контрольной группой (рисунок 1). Сывороточные уровни как miRNA-7219-5p, так и miRNA-7218-5p были значительно увеличены у мышей SAMP1 по сравнению с контрольной группой (рисунок 2). Уровни экспрессии miRNA-223-3p не изменялись ни в одном штамме, а также между почками и сывороткой (Рисунок 1 и Рисунок 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig01.jpg"> Рисунок 1: Дифференциально экспрессированные микроРНК в почках мышей SAMP1. qRT-PCR анализ экспрессии miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p у мышей SAMR1 (контроль, n = 4) и SAMP1 мышей (n = 4). Данные являются средними ± стандартной погрешности (полосы ошибок); t-тесты использовались для анализа межгрупповых различий; p < 0,05 считалось значимым (*p < 0,05), n.s.: незначимым. Сокращения: miRNA = микроРНК; SAMP1 = мышь, склонная к ускоренному старению; SAMR1 = сопротивление мыши с ускорением старения 1; qRT-PCR = количественная обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig02.jpg"> Рисунок 2: Дифференциально экспрессированные миРНК в сыворотке мышей SAMP1. qRT-PCR анализ экспрессии miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p и miRNA-7219-5p у мышей SAMR1 (контроль, n = 4) и мышей SAMP1 (n = 4). Данные являются средними ± SE (полосы ошибок); t-тесты использовались для исследования существенных различий между группами. *p < 0,05 по t-тесту. Сокращения: miRNA = микроРНК; SAMP1 = мышь, склонная к ускоренному старению; SAMR1 = сопротивление мыши с ускорением старения 1; qRT-PCR = количественная обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment at JoVE.com

Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment

Представлен метод оценки экспрессии микроРНК в почках и сыворотке мышей с возрастной почечной недостаточностью методом количественной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией.

Количественная оценка полимеразной цепной реакции в режиме реального времени экспрессии микроРНК в почках и сыворотке мышей с возрастной почечной недостаточностью

MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs consisting of 21-25 bases. They are not translated into proteins but rather work to impede the functioning of ...

Этот метод qRT-PCR может решать вопросы, связанные с профилированием экспрессии микроРНК в сыворотке крови мышей в таких состояниях, как возрастно-зависимая почечная недостаточность. Метод позволяет обнаруживать экспрессию микроРНК с высокой точностью и чувствительностью с помощью простого процесса, который экономит время и предотвращает техническую ошибку. Для начала прорежьте кожу живота с помощью пинцета и хирургических ножниц.Разрежьте мышцы брюшины от мочевого пузыря до нижнего левого края ребер. Поднимите брюшинную оболочку с помощью пинцета, а также сделайте боковой разрез в верхнем крае хирургическими ножницами. Продолжайте разрез вдоль нижнего края ребер.Определите нижнюю полую вену с помощью двух увлажненных PBS ватных тампонов. Вставьте иглу весом 30 г, прикрепленную к 1-миллилитровому шприцу, в нижнюю полую вену и потяните шприц. Медленно вытащите иглу, чтобы избежать гемолиза.Переложите кровь в 1-миллилитрную шпицевую трубку с гепарином и перемешайте путем инвертирования. Центрифугируйте трубку шпица в течение 10 минут при 3000 G при комнатной температуре. Перенесите супернатант в свежую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку.Возьмите 200 микролитров образца сыворотки и добавьте 1000 микролитров реагента лизиса на основе фенола / гуанидина. Вращайте смесь в течение 5 секунд и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавьте 200 микролитров хлороформа и перемешайте, перевернув трубку 15 раз.Инкубируйте образец при комнатной температуре в течение 3 минут с последующей центрифугированием. Не нарушая гранулу, перенесите супернатант в свежую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку. Добавьте 450 микролитров 100% этанола и вращайте трубку в течение 5 секунд.Затем загрузите 700 микролитров образца на спиновую колонну с мембранным креплением и центрифугируйте ее. Отбросьте сквозной поток и добавьте 700 микролитров Wash Buffer 1, входящего в комплект. Снова центрифугируйте и отбросьте сквозной поток.Повторите промывку с 500 микролитрами Wash Buffer 2, чтобы удалить следы солей. Добавьте 500 микролитров 80% этанола, центрифугу и выбросьте проточную трубу из коллекторной трубки. Снова центрифугируйте спиновую колонну и перенесите колонну в свежую 1,5-миллилитровую коллекторную трубку.Затем добавьте 14 микролитров воды, не содержащей РНКазы, и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Снова вращайте колонку в течение 1 минуты при 15000 g при комнатной температуре. Приготовьте раствор для мастер-смеси и добавьте 8 микролитров на лунку в 8-луночную ленточную трубу.Добавьте 12 микролитров извлеченной общей РНК в каждую трубку и центрифугируйте трубку в течение 15 секунд при 2000 G при комнатной температуре. Поместите трубку в термоциклер и начните инкубацию для синтеза кДНК. После инкубации переложите кДНК в свежую микроцентрифужную трубку.Разбавить кДНК десятикратно дистиллированной водой. Затем вихрь с последующим центрифугированием в течение 5 секунд при 2000 раз G при комнатной температуре. В микроцентрифужной трубке приготовьте раствор мастер-микса, как описано в текстовом протоколе, и вихрь раствора.Добавьте 22,5 микролитра аликвоты в каждую лунку 96-луночной пластины, а затем 2,5 микролитра кДНК. Запечатайте пластину с помощью клейкой пленки и центрифугируйте пластину в течение 30 секунд в 1000 раз G.Поместите пластину в систему ПЦР в режиме реального времени. Измените параметры, указав имя эксперимента.Затем выберите 96-луночные 0,2 миллилитра в качестве типа эксперимента, сравнительную КТ в качестве метода количественного определения, стандартную в качестве режима работы системы и реагенты SYBR Green в качестве реагентов для обнаружения целевой последовательности. Укажите имена для образца и целевой микроРНК в каждой лунке. Назначьте дубликаты образцов, выберите эталонный образец и эндогенный элемент управления, а также не выберите ни одного для красителя для использования в качестве пассивного эталона.Для устранения перекрестного загрязнения реагентов настройте отрицательную обратную транскриптазу и нешаблонный контроль экспрессии миРНК. Затем убедитесь, что объем реакции установлен на 20 микролитров, а условия цикла ПЦР установлены на уровне 95 градусов Цельсия в течение 15 минут, затем 40 циклов денатурации при 94 градусах Цельсия в течение 15 секунд, отжига при 55 градусах Цельсия в течение 30 секунд и продления при 70 градусах Цельсия в течение 30 секунд. После завершения процесса нажмите «Анализ», чтобы проанализировать данные qRT-PCR.Убедитесь, что пороговая линия, автоматически выбранная программой, подходит для каждой скважины. Проверьте пороговое значение цикла эндогенного контроля и целевых микроРНК, проанализированных в каждом образце. Определите значения КТ по пересечению кривой усиления и пороговой линии.Данные qRT-PCR miRNA для модели возрастной почечной недостаточности показали, что по сравнению с контрольными мышами SAMR1 уровень miRNA-7219-5p в почках значительно увеличился у экспериментальных мышей SAMP1, в то время как уровень miRNA-7218-5p в почках снизился. Уровни экспрессии miRNA-223-3p не изменялись ни у одного из штаммов. Сывороточные уровни как miRNA-7219-5p, так и miRNA-7218-5p были значительно увеличены у мышей SAMP1, в то время как уровни miRNA-223-3p были неизменными.Следует ввести иглу в нижнюю полую вену и извлечь кровь, не проникая в сосуд. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в профилировании экспрессии микроРНК в сыворотке мышей для широкого спектра патологических состояний.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Улучшенная полимеразная цепная реакция-рестрикционного фрагмента полиморфизма длины генотипирование Toxic Pufferfish методом жидкостной хроматографии / масс-спектрометрии

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Параллельное измерение циркадных часов экспрессии генов и гормональную секрецией человека первичных клеточных культур

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Индуцируемая T7-РНК-полимераза-опосредованная мультигенная экспрессия, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Обнаружение экспрессии микроРНК в перитонеальной мембране крыс с использованием количественной ПЦР в реальном времени

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в Escherichia coli с помощью Роман Transposon опосредованный подход

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Анализ в реальном времени транскрипционного фактора привязки, транскрипция, перевод и оборот для отображения глобальных событий в процессе активации клеточного

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Полуколичественного обнаружение РНК зависимой РНК-полимеразы активности человека теломеразы транскриптазы белка

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

ТРИФОСФАТЫ опосредованной реорганизация структуры хроматина цикла

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Одной капли цифровой полимеразной цепной реакции для комплексного и одновременного обнаружения мутаций в регионах Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...