Name: quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microrna expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment
Uploaded: 2022-04-29T13:00:00
Duration: 6 min 48 s
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	<li>Huang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+regulatory+role+of+lncRNA-miRNA-mRNA+axis+in+cardiovascular+diseases.">The novel regulatory role of lncRNA-miRNA-mRNA axis in cardiovascular diseases.</a> Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (12), 5768-5775 (2018).</li><li>Yang, C., Dou, R., Yin, T., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiRNA-106b-5p+in+human+cancers:+diverse+functions+and+promising+biomarker.">MiRNA-106b-5p in human cancers: diverse functions and promising biomarker.</a> Biomedicine and Pharmacotherapy. 127, 110211 (2020).</li><li>Lu, T. X., Rothenberg, M. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIQE+guidelines:+minimum+information+for+publication+of+quantitative+real-time+PCR+experiments.">The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.</a> Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Rajeevan, M. S., Vernon, S. D., Taysavang, N., Unger, E. 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Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Los niveles de expresión de los miRNAs diana se determinaron con éxito mediante el protocolo descrito anteriormente utilizando qRT-PCR. La evaluación de los miRNAs extraídos es un paso importante para obtener datos significativos de qRT-PCR. Para confirmar la calidad adecuada de los miRNAs antes de realizar la qRT-PCR, se debe utilizar espectrofotometría para determinar la relación de absorbancia a 260 nm a 280 nm. Puede producirse contaminación por ADN y/o dímeros de cebador en cada pocillo de la placa de reacción si la qRT-PCR no proporciona una sola amplificación por PCR de la longitud esperada y la temperatura de fusión, o si proporciona una curva de fusión monomodal.
Los niveles de expresión de MiRNA se pueden evaluar mediante varios métodos distintos de qRT-PCR, incluyendo northern blotting, un microarray y ensayos de protección de ribonucleasa. Sin embargo, el método qRT-PCR es un procedimiento sensible, preciso, simple y reproducible que requiere un volumen de muestra menor que los requeridos para los ensayos de Northern Blot y protección contra ribonucleasa19. Dado que los microarrays pueden medir la expresión de decenas de miles de miRNAs simultáneamente, pueden usarse para identificar marcadores de miRNA candidatos. Los datos de microarrays también muestran una alta correlación general con los datos obtenidos por qRT-PCR20. Sin embargo, no se ha llegado a un consenso sobre la metodología óptima para comparar los datos de microarrays obtenidos en diferentes estudios21.
La evaluación de los miRNAs séricos tiene las siguientes características. En primer lugar, es fácil recolectar suero, y como los miARN séricos son estables contra la congelación y descongelación, la temperatura y el ácido, los miARN pueden ser buenos biomarcadores. En segundo lugar, existe una alta homología de miARN entre especies, y los resultados de los experimentos con animales se extrapolan fácilmente a los humanos. En tercer lugar, los miRNAs séricos han mostrado potencial para su uso como fármacos terapéuticos3. Varios estudios también han demostrado que el nivel de expresión de miRNA en órganos se correlaciona con miRNA en suero22,23,24. En el presente estudio, miRNA-223-3p, cuyos niveles renales no mostraron una diferencia significativa entre los ratones SAMR1 y SAMP1, tampoco mostraron diferencias significativas entre cepas en el suero. En contraste, miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p, cuyos niveles renales mostraron una diferencia significativa entre los ratones SAMR1 y SAMP1, mostraron diferencias considerables entre cepas en el suero.
Este protocolo tiene las siguientes limitaciones. En primer lugar, su utilidad no se ha verificado en otros órganos como el hígado y el pulmón, y en segundo lugar, no se ha probado en otros animales de laboratorio como ratas, perros y cerdos. Varios grupos de investigación han utilizado este protocolo para la purificación y detección de miRNAs mediante qRT-PCR y han informado de que este protocolo permitió la purificación de ARN de alta calidad a partir de tejidos y suero 13,14,22,23,24. Se ha demostrado que este método tiene una alta precisión y sensibilidad para detectar la expresión de miRNAs 13,14,22,23,24. Los resultados del presente estudio demuestran que este protocolo puede detectar con éxito la expresión de miARN en el suero y el riñón de ratones. Por lo tanto, el protocolo se puede utilizar para determinar los perfiles de expresión de miARN sérico y renal en ratones con una variedad de patologías. Debido a la simplicidad del protocolo, se puede procesar simultáneamente un gran número de muestras. Los análisis de la expresión de muchos miRNAs en diversas condiciones patológicas del riñón pueden, por lo tanto, utilizar el protocolo descrito en este documento.
Hay ciertos aspectos del protocolo a tener en cuenta. Para evitar la degradación de los miARN purificados que ocurriría a temperatura ambiente, los miARN deben mantenerse en hielo. Las muestras de riñón deben homogeneizarse hasta que se disuelvan completamente en el reactivo de lisis. El riñón de ratón contiene una cantidad sustancial de tejido conectivo que es insoluble en el reactivo de lisis y, por lo tanto, se requiere una trituradora de columna para una mayor homogeneización. Además, el miARN de control endógeno apropiado (con expresión estable entre las muestras) debe validarse a lo largo de la configuración de un experimento qRT-PCR. Esto se debe a que la interferencia de diversas sustancias durante la realización de este protocolo puede alterar los niveles de expresión de los miRNAs de control endógenos, posiblemente comprometiendo los resultados. En conclusión, este artículo describe un protocolo qRT-PCR para la detección, purificación y evaluación de la expresión de miRNA en suero y riñón de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad.

Se sabe que la expresión de varios ARNm que desempeñan un papel importante tanto en la fisiología como en la enfermedad (por ejemplo, inflamación, fibrosis, trastornos metabólicos y cáncer) está regulada por miARN, que son ARN cortos y no codificantes que causan la degradación e inhiben la transcripción del ARNm1. Por lo tanto, es posible que ciertos miRNAs puedan servir como nuevos candidatos a biomarcadores y/o dianas terapéuticas para diversas enfermedades 2,3,4,5. Se han realizado investigaciones sobre perfiles de expresión de miARN en una variedad de órganos y tejidos de ratón (incluidos el cerebro6, el corazón7, el pulmón8, el hígado9 y el riñón10). Sin embargo, no existen métodos estándar o establecidos para extraer y evaluar miRNAs en los riñones o suero de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad.
Por lo tanto, establecimos un protocolo que se puede utilizar para purificar y detectar de manera confiable la expresión de miRNA en el suero y el riñón de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad. Hay seis pasos principales en el protocolo: (1) preparación de ratones machos SAMR1 de 50 semanas de edad y ratones machos SAMP1; (2) extracción de muestras de sangre de la vena cava inferior de ambas cepas de ratones, con el uso posterior de un tubo de spitz con heparina, seguido de centrifugación, para obtener una muestra de suero; (3) extracción de muestras de riñón de los ratones: se utiliza un homogeneizador de silicio para homogeneizar la muestra de riñón por separado, y luego la muestra se transfiere a un sistema de trituración de biopolímeros en una columna de centrifugación de microcentrífuga11; (4) extracción de ARN total (que contiene miARN) de las muestras de suero con el uso de una columna de espín12 basada en membrana de sílice y extracción total de ARN que contiene miARN de las muestras renales con el uso de una columna de espín11 basada en membrana de sílice; (5) síntesis de ADN complementario (ADNc) a partir del ARN total utilizando transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa y oligo-dT cebador13,14; y (6) finalmente, determinación de la expresión de miRNA mediante qRT-PCR y un colorante intercalante13,14.
Este nuevo protocolo se basó en estudios que lograron extraer y evaluar miRNAs en varios tipos de tejido11,12,13. Se demostró que el sistema de trituración de biopolímeros del protocolo es capaz de purificar ARN total de alta calidad de los tejidos11. Se ha establecido la precisión y sensibilidad de aspectos de este protocolo utilizado para la evaluación de la expresión de miARN por qRT-PCR con un colorante intercalante13,14, por ejemplo, la síntesis de ADNc con transcriptasa inversa, poli(A) polimerasa y cebadores oligo-dT a partir del ARN total extraído. El nuevo protocolo tiene varias ventajas: simplicidad, ahorro de tiempo y reducción de errores técnicos. Por lo tanto, se puede utilizar para investigaciones que requieren una identificación precisa y sensible de los perfiles de miARN renal y sérico. Los estudios de muchas condiciones patológicas también pueden utilizar el nuevo protocolo.
Los perfiles de expresión de miARN en ratones SAMP1, que son un modelo de insuficiencia renal dependiente de la edad, se pueden determinar como se muestra a continuación. En humanos, la insuficiencia renal dependiente de la edad se asocia con la progresión de la insuficiencia renal y se caracteriza tanto por un aumento en el área de fibrosis intersticial renal como por la progresión de la glomeruloesclerosis15,16. La insuficiencia renal dependiente de la edad también es una característica importante y frecuente de la enfermedad renal crónica y de la enfermedad renal terminal15,16.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 mL spitz with heparin</td>
			<td>Greiner-bio-one</td>
			<td>450534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RPE (wash buffer #2 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:4)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79216</td>
			<td>Wash buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RWT (wash buffer #1 containing guanidine and ethanol in ratio of 1:2)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>1067933</td>
			<td>Wash buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-well reaction plate for qRT-PCR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4316813</td>
			<td>96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td>Adhesive film for 96-well reaction plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-223-3p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00003871</td>
			<td>5&#39;-CGUGUAUUUGACAAGCUGAGUU 
			G-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-423-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00012005</td>
			<td>5&#39;-UGAGGGGCAGAGAGCGAGACU 
			UU-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-7218-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068067</td>
			<td>5&#39;-UGCAGGGUUUAGUGUAGAGGG 
			-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNA-7219-5p primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00068081</td>
			<td>5&#39;-UGUGUUAGAGCUCAGGGUUGA 
			GA-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miRNeasy Serum/Plasma kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217184</td>
			<td>Membrane anchored spin column in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript II RT kit (reverse transcription buffer)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218161</td>
			<td>Reverse transcriptase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>miScript SYBR Green PCR kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>218073</td>
			<td>Green dye-based PCR kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIA shredder</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79654</td>
			<td>Biopolymer spin columns in a 2.0 mL collection tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAzol Lysis Reagent (phenol/guanidine-based lysis reagent)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79306</td>
			<td>Phenol/guanidine-based lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Flex Real-Time PCR system</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex Software version 1.2.1.</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4472380</td>
			<td>Real-time PCR instrument software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-free water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNU6-2 primer</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>MS00033740</td>
			<td>Not disclosed due to confidentiality</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMP1 male mice</td>
			<td>Nippon SLC Corporation</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMR1 male mice</td>
			<td>Nippon SLC Corporation</td>
			<td>Not assigned</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Takara biomasher standard</td>
			<td>Takara Bio</td>
			<td>9790B</td>
			<td>Silicon homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative real-time polymerase chain reaction evaluation of microrna expression in kidney and serum of mice with age-dependent renal impairment

Los microARN (miARN) son pequeños ARN no codificantes que constan de 21-25 bases. No se traducen en proteínas, sino que trabajan para impedir el funcionamiento de sus ARN mensajeros objetivo (ARNm) desestabilizándolos e interrumpiendo su traducción. Aunque se han investigado los perfiles de expresión de miARN en varios órganos y tejidos de ratón, no ha habido métodos estándar para purificar y cuantificar miARN de riñón y suero de ratón. Hemos establecido un método eficaz y fiable para extraer y evaluar la expresión de miRNA en suero y riñón de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad. 
El método utiliza la reacción en cadena cuantitativa de la polimerasa con transcripción inversa (qRT-PCR), y el protocolo requiere seis pasos: (1) preparación de ratones con resistencia de ratón acelerada por senescencia 1 (SAMR1) y ratones propensos a ratones con propenso a la senescencia acelerada (SAMP1); (2) extraer muestras de suero de estos ratones; (3) extraer una muestra de riñón de cada ratón; (4) extraer ARN total (incluido miARN) de muestras de riñón y suero de cada ratón; (5) la síntesis de ADN complementario (ADNc) con transcripción inversa del miARN; (6) realizar una qRT-PCR utilizando el ADNc obtenido. 
Este protocolo se utilizó para confirmar que, en comparación con los controles, la expresión de miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p cambió significativamente en el riñón y el suero de un modelo de ratón de insuficiencia renal dependiente de la edad. Este protocolo también aclaró la relación entre el riñón y el suero del modelo de ratón de insuficiencia renal dependiente de la edad. Este protocolo se puede utilizar para determinar la expresión de miARN en el riñón y el suero de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad.

Para el modelo de ratón con insuficiencia renal dependiente de la edad, utilizamos ratones machos SAMP1 de 50 semanas de edad que pesaban 40-45 g. Se recolectaron aproximadamente 0,8 ml de sangre por ratón y se transfirieron a un tubo de spitz de 1,0 ml con heparina, invertido y centrifugado. Cada riñón se enjuagó con PBS, se diseccionó y se almacenó en nitrógeno líquido para su posterior análisis. Los ratones SAMR1 de cincuenta semanas de edad sirvieron como controles. Basándonos en los datos de miRNA qRT-PCR obtenidos utilizando este modelo de insuficiencia renal dependiente de la edad, observamos que el nivel renal de miRNA-7219-5p aumentó significativamente y el nivel renal de miRNA-7218-5p disminuyó considerablemente en los ratones SAMP1 en comparación con los controles (Figura 1). Los niveles séricos de miRNA-7219-5p y miRNA-7218-5p aumentaron considerablemente en los ratones SAMP1 en comparación con los controles (Figura 2). Los niveles de expresión de miRNA-223-3p no cambiaron en ninguna de las cepas ni entre el riñón y el suero (Figura 1 y Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig01.jpg"> Figura 1: MicroRNAs expresados diferencialmente en los riñones de ratones SAMP1. Análisis qRT-PCR de la expresión de miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p en ratones SAMR1 (control, n = 4) y ratones SAMP1 (n = 4). Los datos son medios ± error estándar (barras de error); Se utilizaron pruebas t para analizar las diferencias entre los grupos; p < 0,05 fue considerado significativo (*p < 0,05), n.s.: no significativo. Abreviaturas: miRNA = microRNA; SAMP1 = propenso al ratón acelerado por senescencia; SAMR1 = resistencia del ratón acelerada por senescencia 1; qRT-PCR = reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con transcripción inversa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63258/63258fig02.jpg"> Figura 2: MiRNAs expresados diferencialmente en el suero de ratones SAMP1. Análisis qRT-PCR de la expresión de miRNA-223-3p, miRNA-7218-5p y miRNA-7219-5p en ratones SAMR1 (control, n = 4) y ratones SAMP1 (n = 4). Los datos son medias ± SE (barras de error); Se utilizaron pruebas t para investigar diferencias significativas entre los grupos. *P < 0,05 por la prueba T. Abreviaturas: miRNA = microRNA; SAMP1 = propenso al ratón acelerado por senescencia; SAMR1 = resistencia del ratón acelerada por senescencia 1; qRT-PCR = reacción cuantitativa en cadena de la polimerasa con <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63258/63258fig02large.jpg" target="_blank">transcriptasa inversa Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction Evaluation of MicroRNA Expression in Kidney and Serum of Mice with Age-Dependent Renal Impairment

Presentamos un método para evaluar la expresión de microARN en el riñón y el suero de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa.

Evaluación cuantitativa de la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real de la expresión de microARN en riñón y suero de ratones con insuficiencia renal dependiente de la edad

MicroRNAs (miRNAs) are small, noncoding RNAs consisting of 21-25 bases. They are not translated into proteins but rather work to impede the functioning of ...

Este método qRT-PCR puede abordar preguntas relacionadas con el perfil de expresión de microARN en suero de ratones en condiciones tales como insuficiencia renal dependiente de la edad. La técnica permite la detección de la expresión de microARN con alta precisión y sensibilidad mediante un proceso simple que ahorra tiempo y evita errores técnicos. Para comenzar, incise la piel del abdomen con pinzas y tijeras quirúrgicas.Corte los músculos de la membrana peritoneal desde la vejiga hasta el borde inferior izquierdo de las costillas. Levante la membrana peritoneal con pinzas y haga una incisión lateral en el borde superior con tijeras quirúrgicas. Continúe la incisión a lo largo del borde más bajo de las costillas.Identifique la vena cava inferior mediante el uso de dos hisopos de algodón humedecidos con PBS. Inserte una aguja de 30 G conectada a una jeringa de 1 mililitro en la vena cava inferior y tire de la jeringa. Tire lentamente de la aguja para evitar la hemólisis.Transfiera la sangre a un tubo de spitz de 1 mililitro con heparina y mezcle invirtiendo. Centrifugar el tubo de spitz durante 10 minutos a 3000 veces G a temperatura ambiente. Transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mililitros.Tome 200 microlitros de muestra de suero y agregue 1, 000 microlitros de reactivo de lisis a base de fenol / guanidina. Vortex la mezcla durante 5 segundos e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Agregue 200 microlitros de cloroformo y mezcle invirtiendo el tubo 15 veces.Incubar la muestra a temperatura ambiente durante 3 minutos, seguida de centrifugación. Sin alterar el pellet, transfiera el sobrenadante a un tubo de microcentrífuga fresco de 1,5 mililitros. Agregue 450 microlitros de etanol al 100% y voltee el tubo durante 5 segundos.Luego cargue 700 microlitros de la muestra en una columna de centrifugado anclada a la membrana y centrifugarla. Deseche el flujo y agregue 700 microlitros de Wash Buffer 1 provisto en el kit. Centrifugar de nuevo y desechar el flujo.Repita el lavado con 500 microlitros de Wash Buffer 2 para eliminar las sales traza. Agregue 500 microlitros de etanol al 80%, centrifugar y deseche el flujo del tubo de recolección. Centrifuga la columna de centrifugado de nuevo y transfiera la columna a un tubo de recolección fresco de 1,5 mililitros.Luego agregue 14 microlitros de agua libre de RNasa e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente. Gire la columna de nuevo durante 1 minuto a 15000 veces G a temperatura ambiente. Prepare una solución de mezcla maestra y agregue 8 microlitros por pocillo en un tubo de tira de 8 pocillos.Agregue 12 microlitros del ARN total extraído en cada tubo y centrifugue el tubo durante 15 segundos a 2000 veces G a temperatura ambiente. Coloque el tubo en un termociclador y comience la incubación para sintetizar el ADNc. Después de la incubación, transfiera el ADNc a un tubo de microcentrífuga nuevo.Diluir el ADNc diez veces con agua destilada. Luego vórtice, seguido de centrifugación durante 5 segundos a 2000 veces G a temperatura ambiente. En un tubo de microcentrífuga, prepare la solución de mezcla maestra como se describe en el protocolo de texto y haga un vórtice de la solución.Agregue alícuotas de 22.5 microlitros en cada pocillo de una placa de 96 pocillos, seguido de 2.5 microlitros de ADNc. Selle la placa con una película adhesiva y centrifugue la placa durante 30 segundos a 1000 veces G.Coloque la placa en el sistema de PCR en tiempo real. Modifique la configuración proporcionando un nombre para el experimento.Luego seleccione 0.2 mililitros de 96 pocillos como el tipo de experimento, CT comparativo como método de cuantificación, estándar como el modo de funcionamiento del sistema y reactivos SYBR Green como los reactivos para detectar la secuencia objetivo. Proporcione nombres para la muestra y el miARN objetivo en cada pocillo. Asigne muestras duplicadas, elija una muestra de referencia y un control endógeno, y seleccione ninguna para que el tinte la use como referencia pasiva.Para eliminar la contaminación cruzada de reactivos, configure una transcriptasa inversa negativa y un control sin plantilla para la expresión de miARN. A continuación, asegúrese de que el volumen de reacción se ajuste a 20 microlitros, y las condiciones de ciclo de PCR se establecen en 95 grados centígrados durante 15 minutos, luego 40 ciclos de desnaturalización a 94 grados centígrados durante 15 segundos, recocido a 55 grados centígrados durante 30 segundos y extensión a 70 grados centígrados durante 30 segundos. Una vez completado el proceso, haga clic en analizar para analizar los datos de qRT-PCR.Confirme que la línea de umbral seleccionada automáticamente por el programa es apropiada para cada pozo. Compruebe el valor umbral del ciclo de los miRNAs de control endógeno y diana analizados en cada muestra. Determine los valores de CT mediante la intersección de la curva de amplificación y la línea umbral.Los datos de miRNA qRT-PCR para el modelo de insuficiencia renal dependiente de la edad mostraron que, en comparación con los ratones control SAMR1, el nivel renal de miRNA-7219-5p aumentó significativamente en ratones experimentales SAMP1, mientras que el nivel renal de miRNA-7218-5p disminuyó. Los niveles de expresión de miRNA-223-3p no cambiaron en ninguna de las cepas. Los niveles séricos de miRNA-7219-5p y miRNA-7218-5p aumentaron considerablemente en los ratones SAMP1, mientras que los niveles de miRNA-223-3p se mantuvieron sin cambios.Debe insertar la aguja en la vena cava inferior y extraer sangre sin penetrar en el vaso. Este método se puede utilizar para responder preguntas clave en el perfil de expresión de microARN en suero de ratones para una amplia gama de condiciones patológicas.

Research

JoVE Journal

Genetics

Improved Polymerase Chain Reaction-restriction Fragment Length Polymorphism Genotyping of Toxic Pufferfish by Liquid Chromatography/Mass Spectrometry

Mejora de la reacción en cadena de polimerasa-polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción Genotipado de Pez globo Tóxico por cromatografía líquida / espectrometría de masas

An improved version of a polymerase chain reaction (PCR)-restriction fragment length polymorphism (RFLP) method for genotyping toxic pufferfish species by ...

Investigación

Genética

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Inducible T7 RNA Polymerase-mediated Multigene Expression System, pMGX

Inducible T7 RNA polimerasa mediada Multigene Expression System, pMGX

Co-expression of multiple proteins is increasingly essential for synthetic biology, studying protein-protein complexes, and characterizing and harnessing ...

Detection of microRNA Expression in Peritoneal Membrane of Rats Using Quantitative Real-time PCR

Detección de la expresión de microARN en la membrana peritoneal de ratas mediante PCR cuantitativa en tiempo real

MicroRNAs (miRNAs) are small noncoding RNAs that regulate messenger RNA expression post-transcriptionally. The miRNA expression profile has been ...

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Detección semicuantitativa de la actividad de la ARN polimerasa ARN-dependiente de proteína transcriptasa reversa de Telomerasa humana

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

CRISPR-Mediated Reorganization of Chromatin Loop Structure

Mediada por CRISPR reorganización de la estructura de bucles de cromatina

Recent studies have clearly shown that long-range, three-dimensional chromatin looping interactions play a significant role in the regulation of gene ...

Single Droplet Digital Polymerase Chain Reaction for Comprehensive and Simultaneous Detection of Mutations in Hotspot Regions

Reacción en cadena polimerasa Digital sola gota para la detección integral y simultánea de mutaciones en las regiones de Hotspot

Droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) is a highly sensitive quantitative polymerase chain reaction (PCR) method based on sample fractionation ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...