Name: controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة من قبل BBSRC (BB / S0001778/1). يتم تمويل CR من قبل برنامج الأميرة رويال تينوفوس اسكتلندا للمنح الدراسية للبحوث الطبية. نشكر ديفيد غرينالد (CRH ، جامعة إدنبرة) وكاتي ريد (CDBS ، جامعة إدنبرة) على الهدية اللطيفة للأسماك المعدلة وراثيا (انظر الملف التكميلي). نشكر دانيال سونغ (CRH ، جامعة إدنبرة) على الوصول الكريم إلى قرص الغزل 3i confocal.

تم إجراء جميع الدراسات على الحيوانات بموافقة من وزارة الداخلية البريطانية ووفقا لوائحها ، بموجب ترخيص المشروع PP8160052. تمت الموافقة على المشروع من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة إدنبرة. ولأغراض التحليل التجريبي، استخدمت يرقات أسماك الزرد التي يصل عمرها إلى 5 أيام من أي م...

<ol>
	<li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration.">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li><li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish.">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li><li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals.">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li><li>Schl&#252;&#223;ler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging.">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li><li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord.">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li><li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury.">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li><li>. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: <a target="_blank" href="https://nc3rs.org.uk">https://nc3rs.org.uk</a> (2021)</li><li>Hui, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+wide+expression+profiling+during+spinal+cord+regeneration+identifies+comprehensive+cellular+responses+in+Zebrafish.">Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).</li><li>Vasudevan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+interneurons+integrate+into+locomotor+circuitry+following+spinal+cord+injury.">Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).</li><li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li><li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li><li>Briona, L. K., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+transection+in+the+larval+Zebrafish.">Spinal cord transection in the larval Zebrafish.</a> Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+regeneration+in+adult+Zebrafish+by+gentamicin+induced+injury.">Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).</li><li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li><li>Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mitochondrial+transport+in+single-axon+regeneration+of+zebrafish+mauthner+cells.">In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).</li><li>Nichols, E. L., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+sensory+root+via+axonal+invasion.">Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion.</a> Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).</li><li>Ellstr&#246;m, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+zebrafish+induced+by+near-infrared+femtosecond+laser+pulses.">Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).</li><li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion.">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li><li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination.">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+Zebrafish.">Stages of embryonic development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>. AndOr Micropoint Manual Available from: <a target="_blank" href="https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual">https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual</a> (2021)</li><li>Knafo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neurons+control+the+timing+of+spinal+microcircuit+selection+during+locomotion.">Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion.</a> eLife. 6, 25260 (2017).</li><li>Tsarouchas, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1&#946;+and+Tnf-&#945;+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration.">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1&#946; and Tnf-&#945; by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).</li><li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+voltage-gated+Na++and+K++currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li><li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+long-term,+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish.">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish.">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li></ol>

هناك حاجة ملحة لفهم أعمق للعمليات التي تلعب دورا أثناء التجديد في أسماك الزرد. يقدم هذا النموذج الحيواني العديد من الفوائد للبحوث الطبية الحيوية، وخاصة لإصابات الحبل الشوكي1. تتضمن معظم الدراسات آفات يدوية تتطلب مشغلا مدربا تدريبا جيدا وتحفز على تلف الأنسجة المتعددة. يتم تقد...

على النقيض من الثدييات، يمكن لسمك الزرد (دانيو ريريو) إصلاح الجهاز العصبي المركزي (CNS) بعد الإصابة1. استخدام يرقات الزرد كنموذج لتجديد الحبل الشوكي حديث نسبيا. وقد ثبت أنه من المفيد التحقيق في الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء الإصلاح2. ويرجع ذلك إلى سهولة التلاعب ، والدورة التجريبية القصيرة (يرقات جديدة كل أسبوع) ، والشفافية البصرية للأنسجة ، وصغر حجم اليرقات ، وهي مناسبة بشكل مثالي للفحص المجهري الفلوري في الجسم الحي .
في حالة تجديد الحبل الشوكي ، هناك ميزتان إضافيتان لاستخدام اليرقات هما سرعة الشفاء ، بضعة أيام مقارنة ببضعة أسابيع للبالغين ، وسهولة إحداث إصابات باستخدام التقنيات اليدوية. وقد استخدم هذا بنجاح في العديد من الدراسات3،4،5، بما في ذلك التحقيقات الأخيرة6،7. بشكل عام ، يؤدي هذا إلى زيادة إنتاج البيانات ذات المغزى ، والقدرة العالية على التكيف مع البروتوكولات التجريبية ، وانخفاض التكاليف التجريبية. كما أن استخدام اليرقات التي يقل عمرها عن 5 أيام بعد الإخصاب يقلل أيضا من استخدام الحيوانات التي تتبع مبادئ 3R في البحوث على الحيوانات8.
بعد إصابة الحبل الشوكي في يرقات الزرد ، تحدث العديد من العمليات البيولوجية ، بما في ذلك الاستجابة الالتهابية ، وانتشار الخلايا ، وتكوين الخلايا العصبية ، وهجرة الخلايا الباقية أو المتولدة حديثا ، وإصلاح المحاور الوظيفية ، وإعادة تشكيل عالمي لدوائر العمليات العصبية وأنسجة العمود الفقري6،7،9،10 . ولكي يتم تنسيق هذه العمليات بنجاح، فإنها تنطوي على تفاعل منظم بدقة بين مجموعة من أنواع الخلايا، ومكونات المصفوفة خارج الخلية، والإشارات الكيميائية الحيوية11،12. إن الكشف عن تفاصيل إعادة التنظيم الكبيرة هذه لنسيج معقد مثل الحبل الشوكي يتطلب استخدام وتطوير مناهج تجريبية دقيقة وخاضعة للرقابة.
النموذج التجريبي الأساسي المستخدم لدراسة تجديد الحبل الشوكي في أسماك الزرد هو استخدام الوسائل الجراحية للحث على تلف الأنسجة عن طريق الاستئصال أو الطعن أو الإصابة بالتبريد3,13. ومن عيوب هذه النهج أنها تتطلب تدريبا محددا على مهارات الجراحة المجهرية، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا لأي مشغل جديد وقد يمنع استخدامها في مشاريع قصيرة الأجل. علاوة على ذلك ، فإنها عادة ما تحفز تلف الأنسجة المحيطة ، مما قد يؤثر على التجديد.
وهناك نهج آخر يتمثل في الحث على تلف الخلايا كيميائيا14 أو عن طريق التلاعب الجيني15. هذا الأخير يسمح بأضرار مستهدفة للغاية. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية عملا تحضيريا طويلا لتوليد أسماك معدلة وراثيا جديدة قبل إجراء أي تجربة ، يتم تجديدها في كل مرة يتم فيها استهداف نوع خلية فريد.
وبالتالي ، هناك حاجة إلى طريقة تسمح بالآفات المستهدفة ولكن متعددة الاستخدامات المناسبة لمجموعة متنوعة من الدراسات في التجديد. الحل هو استخدام الليزر للحث على تلف موضعي في الأنسجة ذات الاهتمام16،17،18،19،20. في الواقع ، يمثل استخدام تلف الأنسجة الناجم عن الليزر نهجا قويا لتوليد آفات الحبل الشوكي مع العديد من المزايا. تسمح المجاهر المجهزة بوحدات معالجة الليزر هذه بتحديد منطقة مخصصة الشكل حيث سيحدث استئصال الخلايا ، مع فائدة إضافية تتمثل في التحكم الزمني. وبالتالي يمكن تكييف حجم وموضع الآفة لمعالجة أي أسئلة.
السمة المفقودة لمعظم أنظمة آفات الليزر هي إمكانية إحداث إصابات بطريقة قابلة للتكرار بشكل كبير لسلسلة من اليرقات. هنا يتم وصف بروتوكول أصلي باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية للحث على آفات دقيقة ومضبوطة شبه آلية في يرقات أسماك الزرد استنادا إلى منصة ميكروفلويديك مصممة للتعامل الآلي مع اليرقات21. علاوة على ذلك ، في النظام المعروض هنا ، يتم إدخال اليرقات في الشعيرات الدموية الزجاجية ، مما يسمح بالدوران الحر للحيوان حول محوره الوردي. يمكن للمستخدم اختيار أي جانب من اليرقة لتقديمه إلى الليزر مع السماح للتصوير الفلوري باستهداف شعاع الليزر بدقة وتقييم الضرر بعد الآفة.
يستخدم البروتوكول الموصوف هنا مع نظام تصوير يرقات الزرد شبه الآلي جنبا إلى جنب مع قرص دوار مجهز بليزر الأشعة فوق البنفسجية (المسمى فيما يلي باسم نظام VAST ). ومع ذلك ، فإن النقاط الرئيسية للبروتوكول ومعظم ادعاءات هذه التقنية صالحة لأي نظام مجهز بالليزر قادر على استئصال الخلايا ، بما في ذلك المجاهر الضوئية بالليزر ثنائي الفوتون ، أو المجاهر ذات القرص الدوار المزودة بليزر الأشعة فوق البنفسجية (وحدة FRAP) ، أو مجاهر الفيديو مع وحدة ليزر لمعالجة الصور. سيكون أحد الاختلافات الرئيسية بين نظام VAST ومعالجة العينات التقليدية هو أنه بالنسبة لهذا الأخير ، ستكون هناك حاجة إلى تركيب يرقات في أغاروز منخفض درجة الانصهار على أغطية زجاجية / أطباق بتري ذات قاع زجاجي بدلا من تحميلها في طبق من 96 بئرا.
الفوائد التي توفرها هذه الطريقة تفتح فرصا للبحث المبتكر حول الآليات الخلوية والجزيئية أثناء عملية التجديد. علاوة على ذلك ، تسمح جودة البيانات العالية بإجراء تحقيقات كمية في سياق متعدد التخصصات.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software Zen Blue 2.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Studio Code</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual AxioCam 506 m CCD cameras</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope LSM880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk module CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopeAxio Examiner D1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser</td>
			<td>Micropoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-It EdU Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin acetylated antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic zebrafish lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mnx1:gfp)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by Katy Reid, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae

تمتلك يرقات الزرد جهازا عصبيا مركزيا يعمل بكامل طاقته (CNS) مع قدرة تجديدية عالية بعد أيام قليلة فقط من الإخصاب. هذا يجعل هذا النموذج الحيواني مفيدا جدا لدراسة إصابة الحبل الشوكي وتجديده. البروتوكول القياسي لتحفيز مثل هذه الآفات هو عبور الجزء الظهري من الجذع يدويا. ومع ذلك ، تتطلب هذه التقنية تدريبا مكثفا وتلحق الضرر بأنسجة إضافية. تم تطوير بروتوكول للآفات الناجمة عن الليزر للتحايل على هذه القيود ، مما يسمح بقابلية عالية للتكاثر واكتمال انتقال الحبل الشوكي على العديد من الحيوانات وبين الجلسات المختلفة ، حتى بالنسبة لمشغل غير مدرب. علاوة على ذلك ، يقتصر تلف الأنسجة بشكل أساسي على الحبل الشوكي نفسه ، مما يقلل من الآثار المربكة الناجمة عن إصابة الأنسجة المختلفة ، على سبيل المثال ، الجلد والعضلات والجهاز العصبي المركزي. علاوة على ذلك ، من الممكن حدوث آفات نصف في الحبل الشوكي. إن تحسين الحفاظ على سلامة الأنسجة بعد إصابة الليزر يسهل إجراء المزيد من التشريحات اللازمة لإجراء تحليلات إضافية، مثل الفيزيولوجيا الكهربية. وبالتالي ، توفر هذه الطريقة تحكما دقيقا في مدى الإصابة الذي لا يمكن تحقيقه يدويا. وهذا يسمح بنماذج تجريبية جديدة في هذا النموذج القوي في المستقبل.

التحقق من صحة نقل الحبل الشوكي تم إجراء فحوصات هيكلية ووظيفية لتقييم ما إذا كان البروتوكول يسمح بنقل الحبل الشوكي بالكامل.
أولا ، للتحقق من أن الخسارة في التألق في موقع الآفة كانت بسبب تلف الأنسجة العصبية وليس التبييض الضوئي الفلوري من إضاءة الليزر ، تم إجراء تلط...

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

يصف هذا البروتوكول طريقة للحث على إصابات خاصة بالأنسجة وقابلة للتكرار بدرجة كبيرة في يرقات أسماك الزرد باستخدام نظام آفة ليزر مقترن بمنصة ميكروفلويديك آلية للتعامل مع اليرقات.

الإصابات شبه الآلية التي يسببها الليزر لدراسة تجديد الحبل الشوكي في يرقات أسماك الزرد

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

تسمح لنا التقنية التي نقترحها هنا بالتغلب على قيود بروتوكولات الآفات اليدوية عن طريق تقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة المجاورة وتحسين قابلية التكرار ، حتى بالنسبة للمشغلين عديمي الخبرة. تسمح لنا هذه التقنية باختيار مكان تحفيز الآفة بدقة دون إتلاف الأنسجة المحيطة بفضل الشعيرات الدموية الزجاجية الدوارة جنبا إلى جنب مع ليزر الأشعة فوق البنفسجية المستهدف. تشارك العديد من الخطوات في تشغيل معدات VAST ، لذلك أوصي بوضع علامة على كل خطوة أثناء التنقل من أجل ضمان القيام بكل شيء بشكل صحيح.ابدأ بتخدير اليرقات باستخدام الوسط الذي يحتوي على المخدر ، ثم انقلها إلى صفيحة 96 بئرا تحتوي على 300 ميكرولتر من الوسط لكل بئر. قم بتشغيل جميع مكونات النظام بما في ذلك الليزر للاستئصال. ثم ، قم بتشغيل التصوير الآلي لأسماك الزرد ، أو برنامج VAST ، واختر Plate في النافذة الأولى ، وانقر فوق الزر تم.ستظهر نافذة صغيرة تسأل عما إذا كانت الشعيرات الدموية فارغة ونظيفة. تحقق من صورة الشعيرات الدموية بحثا عن أي فقاعات هواء في الداخل. إذا لم تكن هناك فقاعات هواء في الداخل ، فانقر فوق نعم في النافذة المنبثقة.التالي في نافذة LP Sampler ، انتقل إلى القائمة ملف وحدد خيار فتح البرنامج النصي. اختر ملفا يحتوي على البرنامج النصي المقابل للتجربة المراد تنفيذها. ثم، في نافذة برنامج VAST الرئيسية، انتقل إلى ملف واختر فتح تجربة.اختر ملف التجربة المقابل للتجربة المخطط لها. قم بتشغيل برنامج ImageJ/Fiji ، وانتقل إلى القائمة ملف ، واختر برنامج نصي جديد لفتح نافذة البرنامج النصي. ثم انتقل إلى القائمة ملف واختر فتح لتحميل البرنامج النصي لآفة الليزر.بعد ذلك ، لتشغيل Python IDE ، انتقل إلى القائمة ملف واختر فتح ملف لتحميل البرنامج النصي لإدارة الليزر. ثم انقر فوق القائمة تشغيل واختر تشغيل بدون تصحيح الأخطاء لتشغيل البرنامج النصي. تأكد من ظهور سلسلة من الرسائل في اللوحة الطرفية مع بعض الضوضاء أثناء تهيئة مخفف الليزر.في النافذة الرئيسية لبرنامج VAST ، انقر فوق أزرار الأسهم لتحريك المرحلة وتوسيط الشعيرات الدموية بالنسبة لهدف المجهر. انظر من خلال العدسات وركز على الجزء العلوي من الشعيرات الدموية باستخدام الضوء المنقول من المجهر. ضع صفيحة 96 بئرا تحتوي على اليرقات على حامل اللوحة الأيسر لجهاز أخذ العينات LP.ثم ضع لوحة أخرى للجمع على حامل اللوحة الأيمن لجهاز أخذ العينات. تأكد من أن بئر A1 من اللوحة في الزاوية اليسرى الأمامية من الحامل. في نافذة LP Sampler لبرنامج VAST ، انقر فوق زر قالب اللوحة وحدد جميع الآبار التي تحتوي على يرقات.انقر فوق الزر موافق ( OK) للتحقق من صحة النافذة وإغلاقها. ثم ، انقر فوق الزر "تشغيل اللوحة" في نافذة LP Sampler لبدء تحميل اليرقات. بعد ذلك ، انتقل إلى برنامج المجهر وانقر على الزر Live لتصوير اليرقات.قم بتشغيل مقبض تركيز المجهر حتى تصبح القناة المركزية للحبل الشوكي مرئية. التقط لقطة في التألق واحفظ الصورة في مجلد. افتح الصورة في ImageJ واضبط التباين إذا لزم الأمر.انقر على أداة خط منطقة الاهتمام وارسم خطا قصيرا يركز على الحبل الشوكي. قم بتبديل المجهر إلى موضع مرآة عاكس بنسبة 100٪. قم بتحميل البرنامج النصي ImageJ واضبط التكرار على 2 والعينة على 1 والعرض على 40 ميكرون والتوهين على 89.بعد تعيين جميع المعلمات ، انقر فوق الزر موافق ( OK) . عند الانتهاء من تسلسل لقطات الليزر، قم بالتبديل إلى التصوير الفلوري على برنامج التصوير واضبط التركيز. التقط لقطة جديدة واحفظها.افتح هذه الصورة الجديدة في ImageJ وارسم خطا جديدا أكبر من الحبل الشوكي نفسه. قم بتبديل المجهر إلى موضع مرآة عاكس بنسبة 100٪. انتقل إلى نافذة البرنامج النصي ImageJ واضبط التكرار على 2 والعينة على 1 والعرض على 40 ميكرون والتوهين على 89.بعد تعيين جميع المعلمات ، انقر فوق الزر موافق ( OK) . عند الانتهاء من تسلسل لقطة الليزر، تحقق من جودة النقل عن طريق التصوير الفلوري والتركيز. تأكد من عدم بقاء أي خلايا أو محاور سليمة في موقع الآفة.انتقل إلى نافذة برنامج VAST الرئيسية وانقر على زر Collect لجمع اليرقات المصابة في لوحة 96-well الفارغة. ثم انقر فوق ضوء علبة مربع الاختيار للتبديل مرة أخرى على ضوء نظام VAST . أخرج اليرقة من طبق 96 بئرا في أقرب وقت ممكن ، وانقلها إلى طبق بتري نظيف بمياه السمك العذبة حتى تتعافى اليرقة بعد الآفة.ضع طبق بتري في حاضنة عند 28 درجة مئوية. يشير تلطيخ التوبولين المناعي الأستيل وتصوير الكالسيوم إلى أن آفة الليزر تعطل تماما استمرارية الأنسجة الشوكية. يظهر الحبل الشوكي السليم في هذه الصورة.يؤكد الاضطراب الكامل للمحاور العصبية بين الجانبين الذيلي والسطحي للآفة الانتقال الكامل للحبل الشوكي. يظهر هنا مثال على التحويل غير المكتمل. يظهر الحبل الشوكي العابر على يرقة NBTG cAMP 6-S في هذه الصورة.تظهر المستطيلات عائد الاستثمار المستخدم لقياس شدة التألق في الجانبين الذيلية والذيلية للآفات. تمثل الصورة الرسومية تغير كثافة التألق بمرور الوقت في عائد الاستثمار للتحليل السطحي والذيلي. يتم عرض صور التألق القصوى للإسقاط المكثف ليرقة NBT:dsRed قبل آفة الليزر ، بعد ثلاث ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة من آفة الليزر هنا.بعد 24 ساعة بعد الإصابة ، بدأت الجروح في الإغلاق ، مما أدى إلى استعادة جزئية للبنية الأولية للحبل الشوكي بعد 48 ساعة. تم تأكيد إعادة الاتصال الوظيفي الجزئي بعد 48 ساعة من الإصابة باستخدام تصوير الكالسيوم. أظهرت النسبة بين سعة المسامير في المنطقة الذيلية ومنطقة السطح زيادة بين 3 و 24 و 48 ساعة بعد الإصابة.لوحظ تجنيد البلاعم بعد آفات الليزر باستخدام آفات ليزر NBT:dsRed mpeg1 GFP. لم يلاحظ أي فرق في عدد الخلايا المصنفة بين الآفات اليدوية والليزر. أظهرت الأسماك غير المتضررة عددا أقل من الخلايا ذات العلامات المزدوجة مقارنة بالأسماك المصابة في كلتا الحالتين الآفتين.تحفز آفة الليزر تلفا أقل للعضلات والجلد من الآفة اليدوية. من الأهمية بمكان التحقق مما إذا كانت الآفة كاملة أم لا. لا ينبغي أن تكون أي خلية أو بنية سليمة مرئية في منطقة الآفة ، فقط خلفية قاتمة.لدراسة تجديد الحبل الشوكي ، نستخدم العديد من الطرق ، بما في ذلك الكيمياء النسيجية المناعية وتصوير الكالسيوم. الأهم من ذلك ، يمكننا أيضا القيام بالفيزيولوجيا الكهربية ، حيث يمكن للأنسجة تحمل التشريح ، على عكس الحيوانات المصابة يدويا. تسمح لنا هذه التقنية الجديدة بدراسة كمية لتنظيم الأنسجة الهيكلية والوظيفية في الحبل الشوكي بعد الإصابة من خلال السماح بالآفات القابلة للتكرار والتحكم فيها.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

الحادة والمزمنة الاختبارات الحسية اللمس بعد إصابة الحبل الشوكي في الجرذان

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

تقنية جراحية لتسليم الحبل الشوكي من العلاجات: مظاهرة الداخلي في Minipigs جوتنجن

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

تسيطر الاصابات تهتك عنق في الفئران

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

نموذج كدمة شديدة اصابات الحبل الشوكي في الجرذان

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

رواية الفقري طريقة لتحقيق الاستقرار لإنتاج Contusive إصابة الحبل الشوكي

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

زرع النخاع الشوكي زجاج نوافذ في الفئران الكبار مع التهاب الدماغ التجريبية المناعة الذاتية

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

تسيطر الموديل أثر القشرية لإصابات الدماغ الرضية

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

ونظام القياس عن بعد راديو لمراقبة وظيفة القلب والأوعية الدموية في الحبل الشوكي مع الفئران Transection والعصبية الجذعية الجنينية الطعوم خلية

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

معايرة الملقط نموذج من الحبل الشوكي ضغط الإصابات

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

على النقيض المحسن التصوير بالموجات فوق الصوتية لتقييم الحبل الشوكي تدفق الدم في التجريبية العمود الفقري اصابات الحبل

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...