Name: controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door de BBSRC (BB/S0001778/1). CR wordt gefinancierd door het Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. We danken David Greenald (CRH, University of Edinburgh) en Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) voor het vriendelijke geschenk van transgene vis (zie aanvullend bestand). We bedanken Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) voor de vriendelijke toegang tot de 3i spinning-disk confocal.

Alle dierstudies werden uitgevoerd met goedkeuring van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken en volgens zijn voorschriften, onder projectlicentie PP8160052. Het project werd goedgekeurd door de University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee. Voor experimentele analyses werden zebravislarven tot 5 dagen oud van beide geslachten gebruikt van de volgende beschikbare transgene lijnen: Tg (Xla.Tubb: DsRed;mpeg1: GFP), Tg (Xla.Tubb: DsRed), Tg (betaactin: utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb: GCaMP6s) en...

<ol>
	<li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration.">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li><li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish.">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li><li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals.">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li><li>Schl&#252;&#223;ler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging.">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li><li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord.">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li><li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury.">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li><li>. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: <a target="_blank" href="https://nc3rs.org.uk">https://nc3rs.org.uk</a> (2021)</li><li>Hui, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+wide+expression+profiling+during+spinal+cord+regeneration+identifies+comprehensive+cellular+responses+in+Zebrafish.">Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).</li><li>Vasudevan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+interneurons+integrate+into+locomotor+circuitry+following+spinal+cord+injury.">Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).</li><li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li><li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li><li>Briona, L. K., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+transection+in+the+larval+Zebrafish.">Spinal cord transection in the larval Zebrafish.</a> Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+regeneration+in+adult+Zebrafish+by+gentamicin+induced+injury.">Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).</li><li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li><li>Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mitochondrial+transport+in+single-axon+regeneration+of+zebrafish+mauthner+cells.">In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).</li><li>Nichols, E. L., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+sensory+root+via+axonal+invasion.">Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion.</a> Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).</li><li>Ellstr&#246;m, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+zebrafish+induced+by+near-infrared+femtosecond+laser+pulses.">Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).</li><li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion.">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li><li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination.">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+Zebrafish.">Stages of embryonic development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>. AndOr Micropoint Manual Available from: <a target="_blank" href="https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual">https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual</a> (2021)</li><li>Knafo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neurons+control+the+timing+of+spinal+microcircuit+selection+during+locomotion.">Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion.</a> eLife. 6, 25260 (2017).</li><li>Tsarouchas, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1&#946;+and+Tnf-&#945;+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration.">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1&#946; and Tnf-&#945; by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).</li><li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+voltage-gated+Na++and+K++currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li><li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+long-term,+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish.">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish.">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li></ol>

Er is dringend behoefte aan een dieper begrip van de processen die spelen tijdens regeneratie bij zebravissen. Dit diermodel biedt veel voordelen voor biomedisch onderzoek, in het bijzonder voor ruggenmergletsels1. De meeste studies hebben betrekking op handmatige laesies die een goed opgeleide operator vereisen en schade aan meerdere weefsels veroorzaken. Een laserlaesieprotocol wordt hier gepresenteerd, waardoor controle over de laesiekenmerken en verminderde schade aan de omliggende weefsels mo...

In tegenstelling tot zoogdieren kunnen zebravissen (Danio rerio) hun centrale zenuwstelsel (CZS) herstellen na een verwonding1. Het gebruik van zebravislarven als model voor regeneratie van het ruggenmerg is relatief recent. Het is waardevol gebleken om de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan reparatie2 te onderzoeken. Dit komt door het gemak van manipulatie, de korte experimentele cyclus (elke week nieuwe larven), de optische transparantie van de weefsels en de kleine omvang van de larven, bij uitstek geschikt voor in vivo fluorescentiemicroscopie.
In het geval van regeneratie van het ruggenmerg zijn twee extra voordelen van het gebruik van larven de snelheid van herstel, een paar dagen in vergelijking met een paar weken voor volwassenen, en het gemak van het induceren van verwondingen met behulp van handmatige technieken. Dit is met succes gebruikt in vele studies3,4,5, waaronder recente onderzoeken6,7. Over het algemeen leidt dit tot een verhoogde zinvolle gegevensproductie, een hoog aanpassingsvermogen van experimentele protocollen en lagere experimentele kosten. Het gebruik van larven jonger dan 5 dagen na de bevruchting vermindert ook het gebruik van dieren volgens de 3R-principes in dieronderzoek8.
Na een dwarslaesie bij zebravislarven treden veel biologische processen op, waaronder ontstekingsreactie, celproliferatie, neurogenese, migratie van overlevende of nieuw gegenereerde cellen, reformatie van functionele axonen en een wereldwijde remodellering van neurale processen circuits en wervelkolomweefsels6,7,9,10 . Om met succes te worden georkestreerd, omvatten deze processen een fijn gereguleerde interactie tussen een reeks celtypen, extracellulaire matrixcomponenten en biochemische signalen11,12. Het ontrafelen van de details van deze belangrijke reorganisatie van een complex weefsel zoals het ruggenmerg vereist het gebruik en de ontwikkeling van nauwkeurige en gecontroleerde experimentele benaderingen.
Het primaire experimentele paradigma dat wordt gebruikt om spinale regeneratie bij zebravissen te bestuderen, is het gebruik van chirurgische middelen om weefselschade te induceren door resectie, steken of cryo-letsel3,13. Deze benaderingen hebben het nadeel dat specifieke training in microchirurgische vaardigheden vereist is, wat tijdrovend is voor elke nieuwe operator en het gebruik ervan in kortetermijnprojecten kan voorkomen. Bovendien veroorzaken ze meestal schade aan de omliggende weefsels, wat de regeneratie kan beïnvloeden.
Een andere benadering is om celbeschadiging chemisch te induceren14 of door genetische manipulaties15. Dit laatste zorgt voor zeer gerichte schade. Een dergelijke techniek vereist echter lang voorbereidend werk om nieuwe transgene vissen te genereren voordat een experiment wordt uitgevoerd, vernieuwd telkens wanneer een uniek celtype wordt gericht.
Er is dus behoefte aan een methode die gerichte maar veelzijdige laesies mogelijk maakt die geschikt zijn voor een verscheidenheid aan onderzoeken naar regeneratie. Een oplossing is om een laser te gebruiken om gelokaliseerde schade in het weefsel van belang te induceren16,17,18,19,20. Inderdaad, het gebruik van laser-geïnduceerde weefselschade biedt een robuuste aanpak voor het genereren van ruggenmerglaesies met veel voordelen. De microscopen uitgerust met dergelijke lasermanipulatiemodules maken het mogelijk om een aangepast gevormd gebied te specificeren waar celablatie zal plaatsvinden, met het extra voordeel van temporele controle. De grootte en positie van de laesie kunnen zo worden aangepast om eventuele vragen te beantwoorden.
Het ontbrekende kenmerk van de meeste laserlaesiesystemen is de mogelijkheid om verwondingen op een zeer reproduceerbare manier te induceren voor een reeks larven. Hier wordt een origineel protocol beschreven met behulp van een UV-laser om semi-geautomatiseerde precieze en gecontroleerde laesies in zebravislarven te induceren op basis van een microfluïdisch platform dat is ontworpen voor geautomatiseerde larvenverwerking21. Bovendien worden larven in het hier gepresenteerde systeem ingebracht in een glazen capillair, waardoor het dier vrij rond zijn rostrocaudale as kan draaien. De gebruiker kan kiezen welke kant van de larve aan de laser wordt gepresenteerd, terwijl fluorescentiebeeldvorming de laserstraal nauwkeurig kan richten en de schade na de laesie kan beoordelen.
Het hier beschreven protocol wordt gebruikt met een semi-geautomatiseerd zebravislarve beeldvormingssysteem in combinatie met een draaiende schijf uitgerust met een UV-laser (hierna aangeduid als het VAST-systeem). De belangrijkste punten van het protocol en de meeste claims van de techniek zijn echter geldig voor elk systeem dat is uitgerust met een laser die in staat is tot celablatie, inclusief laserscanmicroscopen met twee fotonen, spinning-disk microscopen voorzien van een UV-laser (FRAP-module) of videomicroscopen met een lasermodule voor fotomanipulatie. Een van de belangrijkste verschillen tussen het VAST-systeem en de conventionele monsterbehandeling zal zijn dat voor de laatste, het monteren van larven in agarose met een laag smeltpunt op glazen afdekkingsplaten / petrischalen met glazen bodem in plaats van ze in een 96-putplaat te laden, vereist is.
De voordelen van deze methode bieden kansen voor innovatief onderzoek naar de cellulaire en moleculaire mechanismen tijdens het regeneratieproces. Bovendien maakt de hoge datakwaliteit kwantitatief onderzoek in een multidisciplinaire context mogelijk.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software Zen Blue 2.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Studio Code</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual AxioCam 506 m CCD cameras</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope LSM880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk module CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopeAxio Examiner D1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser</td>
			<td>Micropoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-It EdU Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin acetylated antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic zebrafish lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mnx1:gfp)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by Katy Reid, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae

Zebravislarven bezitten slechts enkele dagen na de bevruchting een volledig functioneel centraal zenuwstelsel (CZS) met een hoog regeneratief vermogen. Dit maakt dit diermodel zeer nuttig voor het bestuderen van dwarslaesie en regeneratie. Het standaardprotocol voor het induceren van dergelijke laesies is om het dorsale deel van de romp handmatig te transecteren. Deze techniek vereist echter uitgebreide training en beschadigt extra weefsels. Er werd een protocol ontwikkeld voor lasergeïnduceerde laesies om deze beperkingen te omzeilen, waardoor een hoge reproduceerbaarheid en volledigheid van de dwarsdoorsnede van het ruggenmerg over veel dieren en tussen verschillende sessies mogelijk is, zelfs voor een ongetrainde operator. Bovendien is weefselschade voornamelijk beperkt tot het ruggenmerg zelf, waardoor verstorende effecten van het verwonden van verschillende weefsels, bijvoorbeeld huid, spieren en CZS, worden verminderd. Bovendien zijn hemi-laesies van het ruggenmerg mogelijk. Verbeterd behoud van weefselintegriteit na laserletsel vergemakkelijkt verdere dissecties die nodig zijn voor aanvullende analyses, zoals elektrofysiologie. Daarom biedt deze methode een nauwkeurige controle van de letselomvang die handmatig onhaalbaar is. Dit maakt nieuwe experimentele paradigma's in dit krachtige model in de toekomst mogelijk.

Validatie van ruggenmergtranssectie Structurele en functionele onderzoeken werden uitgevoerd om te beoordelen of het protocol een volledige ruggenmergtranssectie mogelijk maakt.
Ten eerste, om te verifiëren dat het verlies in fluorescentie op de laesieplaats te wijten was aan neuronale weefselbeschadiging en niet aan fluorescentiefotobleaching door de laserverlichting, werd immunostaining uitgevoerd met behulp van een antilichaam tegen geacetyleerde tubuline (zie T...

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Het huidige protocol beschrijft een methode om weefselspecifieke en zeer reproduceerbare verwondingen bij zebravislarven te induceren met behulp van een laserlaesiesysteem in combinatie met een geautomatiseerd microfluïdisch platform voor het hanteren van larven.

Gecontroleerde semi-geautomatiseerde lasergeïnduceerde verwondingen voor het bestuderen van spinale regeneratie bij zebravislarven

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

De techniek die we hier voorstellen, stelt ons in staat om de beperkingen van handmatige laesieprotocollen te overwinnen door schade aan aangrenzende weefsels te verminderen en de reproduceerbaarheid te verbeteren, zelfs voor onervaren operators. Deze techniek stelt ons in staat om precies te kiezen waar we de laesie willen induceren zonder omliggende weefsels te beschadigen dankzij roterende glazen capillair in combinatie met een gerichte UV-laser. Er zijn veel stappen betrokken bij het bedienen van de VAST-apparatuur, dus ik zou aanraden om elke stap af te vinken om ervoor te zorgen dat alles correct wordt gedaan.Begin met het verdoven van de larven met behulp van het medium dat het verdovingsmiddel bevat en breng ze vervolgens over naar een plaat met 96 putten met 300 microliter medium per put. Schakel alle systeemcomponenten in, inclusief de laser voor ablatie. Start vervolgens de geautomatiseerde zebravisbeeldvorming of VAST-software, kies Plate in het eerste venster en klik op de knop Gereed.Er verschijnt een klein venster met de vraag of het capillair leeg en schoon is. Controleer de afbeelding van het capillair op eventuele luchtbellen binnenin. Als er geen luchtbellen in zitten, klikt u op Ja in het pop-upvenster.Ga vervolgens in het venster LP Sampler naar het menu Bestand en selecteer de optie Script openen. Kies een bestand met het script dat overeenkomt met het uit te voeren experiment. Ga vervolgens in het hoofdvenster van vast-software naar Bestand en kies Experiment openen.Kies het experimentbestand dat overeenkomt met het geplande experiment. Start ImageJ/Fiji-software, ga naar het menu Bestand en kies Nieuw script om het scriptvenster te openen. Ga vervolgens naar het menu Bestand en kies Openen om het laserlaesiescript te laden.Om vervolgens de Python IDE te starten, gaat u naar het menu Bestand en kiest u Bestand openen om het script te laden om de laser te beheren. Klik vervolgens op het menu Uitvoeren en kies Uitvoeren zonder foutopsporing om het script uit te voeren. Zorg ervoor dat er een reeks berichten in het terminalpaneel wordt weergegeven, samen met wat ruis terwijl de laserverzwakker wordt geïnitialiseerd.Klik in het hoofdvenster van de VAST-software op de pijlknoppen om het podium te verplaatsen en het capillair ten opzichte van het microscoopobjectief te centreren. Kijk door de oculairs en focus op de bovenkant van het capillair met behulp van het doorgelaten licht van de microscoop. Plaats een 96-well plaat met de larven op de linker plaathouder van de LP sampler.Plaats vervolgens een andere plaat voor verzameling op de rechterplaathouder van de sampler. Zorg ervoor dat de A1-put van de plaat zich in de linkervoorhoek van de houder bevindt. Klik in het LP Sampler-venster van de VAST-software op de knop Plaatsjabloon en selecteer alle putten die larven bevatten.Klik op de knop OK om het venster te valideren en te sluiten. Klik vervolgens op de knop Plaat uitvoeren in het LP Sampler-venster om te beginnen met het laden van de larve. Ga vervolgens naar de microscoopsoftware en klik op de live-knop om de larve in beeld te brengen.Draai de focusknop van de microscoop aan totdat het centrale kanaal van het ruggenmerg zichtbaar is. Maak een momentopname in fluorescentie en sla de afbeelding op in een map. Open de afbeelding in ImageJ en pas indien nodig het contrast aan.Klik op het lijngereedschap van het interessegebied en teken een korte lijn gecentreerd op het ruggenmerg. Schakel de microscoop naar de 100% reflecterende spiegelpositie. Laad het ImageJ-script en stel Herhaling in op 2, Voorbeeld op 1, Breedte op 40 micron en Demping op 89.Nadat u alle parameters hebt ingesteld, klikt u op de knop OK. Wanneer de laseropnamesequentie is voltooid, schakelt u over naar fluorescentiebeeldvorming op de beeldvormingssoftware en past u de focus aan. Maak een nieuwe momentopname en sla deze op.Open deze nieuwe afbeelding in ImageJ en teken een nieuwe lijn die groter is dan het ruggenmerg zelf. Schakel de microscoop naar de 100% reflecterende spiegelpositie. Ga naar het scriptvenster ImageJ en stel Herhaling in op 2, Voorbeeld op 1, Breedte op 40 micron en Demping op 89.Nadat u alle parameters hebt ingesteld, klikt u op de knop OK. Wanneer de laseropnamesequentie is voltooid, controleert u de transsectiekwaliteit door fluorescentie en scherpstelling in beeld te brengen. Zorg ervoor dat er geen cellen of axonen intact blijven op de plaats van de laesie.Ga naar het hoofdvenster van de VAST-software en klik op de knop Verzamelen om de laesielarven in de lege 96-putplaat te verzamelen. Klik vervolgens op het selectievakje-ladelampje om het VAST-systeemlampje weer in te schakelen. Haal de larve zo snel mogelijk uit de 96-putplaat en breng ze over naar een schone petrischaal met vers viswater zodat de larve na de laesie kan herstellen.Zet de petrischaal in een couveuse op 28 graden Celsius. Geacetyleerde tubuline immunokleuring en calciumbeeldvorming geven aan dat laserlaesie de continuïteit van spinale weefsel volledig verstoort. Een intact ruggenmerg is te zien in deze afbeelding.Een volledige verstoring van de axonen tussen de caudale en rostrale zijden van de laesie bevestigt de volledige transsectie van het ruggenmerg. Een voorbeeld van onvolledige transsectie wordt hier getoond. Het getransceerde ruggenmerg op een NBTG cAMP 6-S larve is op deze afbeelding te zien.De rechthoeken tonen de ROIs die worden gebruikt om de fluorescentie-intensiteit in de rostrale en caudale zijden van de laesies te kwantificeren. Het grafische beeld geeft de fluorescentie-intensiteitsverandering in de loop van de tijd weer in de rostrale en caudale analyse-ROI's. De maximale intensiteitsprojectie fluorescentiebeelden van een NBT:dsRed larve vóór de laserlaesie, na drie uur, 24 uur en 48 uur van de laserlaesie worden hier weergegeven.Na 24 uur na het letsel begonnen de wonden te sluiten, wat leidde tot een gedeeltelijk herstel van de oorspronkelijke structuur van het ruggenmerg na 48 uur. Een gedeeltelijke functionele herverbinding werd bevestigd na 48 uur na het letsel met behulp van calciumbeeldvorming. De verhouding tussen de amplitude van de pieken in het caudale gebied en het rostrale gebied vertoonde een toename tussen 3, 24 en 48 uur na het letsel.Macrofaag rekrutering werd waargenomen na laserlaesies met behulp van NBT:dsRed mpeg1 GFP larven laser laesies. Er werd geen verschil waargenomen in het aantal gelabelde cellen tussen handmatige en laserlaesies. Tenzij vis minder dubbel gelabelde cellen vertoonde dan laesievissen in beide laesieomstandigheden.Laserlaesie induceert minder spier- en huidbeschadiging dan handmatige laesie. Het is van cruciaal belang om te controleren of de laesie volledig is of niet. Er mag geen intacte cel of structuur zichtbaar zijn in het laesiegebied, alleen een donkere achtergrond.Om spinale regeneratie te bestuderen, gebruiken we veel methoden, waaronder immuno-histochemie en calciumbeeldvorming. Belangrijk is dat we ook elektrofysiologie kunnen doen, omdat het weefsel bestand is tegen dissectie, in tegenstelling tot handmatig laesiedieren. Deze nieuwe techniek stelt ons in staat om de structurele en functionele weefselorganisatie in het ruggenmerg na een blessure kwantitatief te bestuderen door reproduceerbare en gecontroleerde laesies mogelijk te maken.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Acute en chronische Tactile Sensory Testing na ruggenmergletsel bij ratten

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

Chirurgische Techniek voor Spinal Cord Levering van therapieën: Demonstratie van orde in Göttingen minivarkens

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Gecontroleerde Cervicale Laceration Letsel in Muizen

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

Een Kneuzing Model van Severe ruggenmergletsel bij ratten

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

A Novel Vertebral Stabilization werkwijze voor het produceren Contusive Spinal Cord Injury

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Gecontroleerde Corticale Impact Model voor traumatisch hersenletsel

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

Een radio-telemetrische systeem om de cardiovasculaire functie bij ratten met Spinal Cord doorsnijding en embryonale neurale stamcellen Enten Monitor

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Gekalibreerde tang Model van Spinal Cord Injury Compression

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Contrast Enhanced Imaging Ultrasound voor de Beoordeling van Spinal Cord Blood Flow in Experimentele Spinal Cord Injury

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...