Name: controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Cette étude a été soutenue par le BBSRC (BB/S0001778/1). CR est financé par le Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Nous remercions David Greenald (CRH, Université d’Édimbourg) et Katy Reid (CDBS, Université d’Édimbourg) pour l’aimable don de poisson transgénique (voir dossier supplémentaire). Nous remercions Daniel Soong (CRH, Université d’Édimbourg) pour l’aimable accès au disque rotatif confocal 3i.

Toutes les études sur les animaux ont été réalisées avec l’approbation du ministère de l’Intérieur du Royaume-Uni et conformément à sa réglementation, sous la licence de projet PP8160052. Le projet a été approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’Édimbourg. Pour les analyses expérimentales, des larves de poisson zèbre âgées de moins de 5 jours de l’un ou l’autre sexe ont été utilisées parmi les lignées transgéniques disponibles suiv...

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	<li>Becker, C. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li><li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li><li>Briona, L. K., Dorsky, R. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion.">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li><li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination.">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1&#946;+and+Tnf-&#945;+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration.">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1&#946; and Tnf-&#945; by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).</li><li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+voltage-gated+Na++and+K++currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li><li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+long-term,+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish.">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish.">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li></ol>

Il est urgent de mieux comprendre les processus en jeu lors de la régénération chez le poisson-zèbre. Ce modèle animal offre de nombreux avantages pour la recherche biomédicale, en particulier pour les lésions de la moelle épinière1. La plupart des études portent sur des lésions manuelles qui nécessitent un opérateur bien formé et induisent des lésions multi-tissulaires. Un protocole de lésion laser est présenté ici, permettant de contrôler les caractéristiques de la lésion et...

Contrairement aux mammifères, le poisson-zèbre (Danio rerio) peut réparer son système nerveux central (SNC) après une blessure1. L’utilisation des larves de poisson zèbre comme modèle de régénération de la moelle épinière est relativement récente. Il s’est avéré utile d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à la réparation2. Cela est dû à la facilité de manipulation, au cycle expérimental court (nouvelles larves chaque semaine), à la transparence optique des tissus et à la petite taille des larves, idéale pour la microscopie à fluorescence in vivo .
Dans le cas de la régénération de la moelle épinière, deux avantages supplémentaires de l’utilisation de larves sont la rapidité de récupération, quelques jours par rapport à quelques semaines pour les adultes, et la facilité d’induire des blessures à l’aide de techniques manuelles. Cela a été utilisé avec succès dans de nombreuses études3,4,5, y compris des enquêtes récentes6,7. Dans l’ensemble, cela conduit à une production accrue de données significatives, à une grande adaptabilité des protocoles expérimentaux et à une diminution des coûts expérimentaux. L’utilisation de larves moins de 5 jours après la fécondation réduit également l’utilisation d’animaux suivant les principes des 3R dans la recherche animale8.
Après une lésion de la moelle épinière chez les larves de poisson zèbre, de nombreux processus biologiques se produisent, notamment une réponse inflammatoire, une prolifération cellulaire, une neurogenèse, la migration des cellules survivantes ou nouvellement générées, la reformation des axones fonctionnels et un remodelage global des circuits des processus neuronaux et des tissus de la colonne vertébrale6,7,9,10 . Pour être orchestrés avec succès, ces processus impliquent une interaction finement régulée entre une gamme de types de cellules, de composants de matrice extracellulaire et de signaux biochimiques11,12. Démêler les détails de cette réorganisation importante d’un tissu complexe tel que la moelle épinière nécessite l’utilisation et le développement d’approches expérimentales précises et contrôlées.
Le principal paradigme expérimental utilisé pour étudier la régénération de la moelle épinière chez le poisson-zèbre consiste à utiliser des moyens chirurgicaux pour induire des lésions tissulaires par résection, coup de couteau ou cryofreinture3,13. Ces approches ont l’inconvénient de nécessiter une formation spécifique aux compétences en microchirurgie, ce qui prend du temps pour tout nouvel opérateur et peut empêcher leur utilisation dans des projets à court terme. En outre, ils induisent généralement des dommages aux tissus environnants, ce qui peut influencer la régénération.
Une autre approche consiste à induire des dommages cellulaires chimiquement14 ou par des manipulations génétiques15. Ce dernier permet des dégâts très ciblés. Cependant, une telle technique nécessite un long travail préparatoire pour générer de nouveaux poissons transgéniques avant de faire toute expérience, renouvelée chaque fois qu’un type de cellule unique est ciblé.
Il y a donc besoin d’une méthode permettant des lésions ciblées mais polyvalentes adaptées à une variété d’études en régénération. Une solution consiste à utiliser un laser pour induire des dommages localisés dans le tissu d’intérêt16,17,18,19,20. En effet, l’utilisation de lésions tissulaires induites par le laser présente une approche robuste pour générer des lésions de la moelle épinière avec de nombreux avantages. Les microscopes équipés de tels modules de manipulation laser permettent de spécifier une zone de forme personnalisée où l’ablation cellulaire aura lieu, avec l’avantage supplémentaire du contrôle temporel. La taille et la position de la lésion peuvent ainsi être adaptées pour répondre à toutes les questions.
La caractéristique manquante de la plupart des systèmes de lésions laser est la possibilité d’induire des blessures de manière hautement reproductible pour une série de larves. Ici, un protocole original est décrit à l’aide d’un laser UV pour induire des lésions semi-automatisées précises et contrôlées chez les larves de poisson zèbre sur la base d’une plate-forme microfluidique conçue pour la manipulation automatisée des larves21. De plus, dans le système présenté ici, les larves sont insérées dans un capillaire en verre, ce qui permet une rotation libre de l’animal autour de son axe rostrocaudal. L’utilisateur peut choisir le côté de la larve à présenter au laser tout en permettant à l’imagerie par fluorescence de cibler précisément le faisceau laser et d’évaluer les dommages après la lésion.
Le protocole décrit ici est utilisé avec un système d’imagerie semi-automatisé des larves de poisson-zèbre combiné à un disque rotatif équipé d’un laser UV (désigné ci-après comme le système VAST). Cependant, les principaux points du protocole et la plupart des revendications de la technique sont valables pour tout système équipé d’un laser capable d’ablation cellulaire, y compris les microscopes à balayage laser à deux photons, les microscopes à disque rotatif équipés d’un laser UV (module FRAP) ou les vidéomicroscopes avec un module laser pour la manipulation de photos. L’une des principales différences entre le système VAST et la manipulation conventionnelle des échantillons sera que, pour ces derniers, le montage de larves dans l’agarose à faible point de fusion sur des couvercles en verre / boîtes de Petri à fond de verre au lieu de les charger dans une plaque de 96 puits sera nécessaire.
Les avantages offerts par cette méthode ouvrent des opportunités pour la recherche innovante sur les mécanismes cellulaires et moléculaires au cours du processus de régénération. De plus, la haute qualité des données permet des enquêtes quantitatives dans un contexte multidisciplinaire.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software Zen Blue 2.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Studio Code</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual AxioCam 506 m CCD cameras</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope LSM880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk module CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopeAxio Examiner D1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser</td>
			<td>Micropoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-It EdU Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin acetylated antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic zebrafish lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mnx1:gfp)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by Katy Reid, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae

Les larves de poisson zèbre possèdent un système nerveux central (SNC) entièrement fonctionnel avec une capacité de régénération élevée seulement quelques jours après la fécondation. Cela rend ce modèle animal très utile pour étudier les lésions de la moelle épinière et la régénération. Le protocole standard pour induire de telles lésions consiste à transecter manuellement la partie dorsale du tronc. Cependant, cette technique nécessite un entraînement approfondi et endommage des tissus supplémentaires. Un protocole a été développé pour les lésions induites par laser afin de contourner ces limitations, permettant une reproductibilité et une exhaustivité élevées de la transsection de la moelle épinière sur de nombreux animaux et entre différentes séances, même pour un opérateur non formé. En outre, les lésions tissulaires se limitent principalement à la moelle épinière elle-même, ce qui réduit les effets de confusion liés à la blessure de différents tissus, par exemple la peau, les muscles et le SNC. De plus, des hémi-lésions de la moelle épinière sont possibles. L’amélioration de la préservation de l’intégrité des tissus après une blessure au laser facilite d’autres dissections nécessaires pour des analyses supplémentaires, telles que l’électrophysiologie. Par conséquent, cette méthode offre un contrôle précis de l’étendue de la blessure qui est irréalisable manuellement. Cela permet de nouveaux paradigmes expérimentaux dans ce modèle puissant à l’avenir.

Validation de la transsection de la moelle épinière Des investigations structurelles et fonctionnelles ont été effectuées pour évaluer si le protocole permet une transsection complète de la moelle épinière.
Tout d’abord, pour vérifier que la perte de fluorescence au site de la lésion était due à des lésions tissulaires neuronales et non à un photoblanchiment de fluorescence provenant de l’éclairage laser, une immunocoloration à l’aide d’un anticorps...

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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Le présent protocole décrit une méthode pour induire des lésions tissulaires spécifiques et hautement reproductibles chez les larves de poisson zèbre à l’aide d’un système de lésion laser combiné à une plate-forme microfluidique automatisée pour la manipulation des larves.

Lésions semi-automatisées contrôlées induites par laser pour étudier la régénération de la moelle épinière chez les larves de poisson zèbre

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

La technique que nous proposons ici nous permet de surmonter les limites des protocoles de lésions manuelles en réduisant les dommages aux tissus adjacents et en améliorant la reproductibilité, même pour les opérateurs inexpérimentés. Cette technique nous permet de choisir précisément où induire la lésion sans endommager les tissus environnants grâce à un capillaire en verre rotatif combiné à un laser UV ciblé. De nombreuses étapes sont impliquées dans le fonctionnement de l’équipement VAST, je vous recommande donc de cocher chaque étape au fur et à mesure afin de vous assurer que tout est fait correctement.Commencez par anesthésier les larves à l’aide du milieu contenant l’anesthésique, puis transférez-les sur une plaque de 96 puits contenant 300 microlitres de milieu par puits. Allumez tous les composants du système, y compris le laser pour l’ablation. Ensuite, lancez l’imagerie automatisée du poisson-zèbre ou le logiciel VAST, choisissez Plate dans la première fenêtre et cliquez sur le bouton Terminé.Une petite fenêtre apparaîtra demandant si le capillaire est vide et propre. Vérifiez l’image du capillaire pour toute bulle d’air à l’intérieur. S’il n’y a pas de bulles d’air à l’intérieur, cliquez sur Oui dans la fenêtre ouverte.Ensuite, dans la fenêtre LP Sampler, accédez au menu Fichier et sélectionnez l’option Ouvrir le script. Choisissez un fichier contenant le script correspondant à l’expérience à effectuer. Ensuite, dans la fenêtre principale du logiciel VAST, accédez à Fichier et choisissez Ouvrir l’expérience.Choisissez le fichier d’expérience correspondant à l’expérience planifiée. Lancez le logiciel ImageJ/Fiji, accédez au menu Fichier et choisissez Nouveau script pour ouvrir la fenêtre de script. Ensuite, allez dans le menu Fichier et choisissez Ouvrir pour charger le script de lésion laser.Ensuite, pour lancer l’IDE Python, allez dans le menu Fichier et choisissez Ouvrir le fichier pour charger le script afin de gérer le laser. Ensuite, cliquez sur le menu Exécuter et choisissez Exécuter sans débogage pour exécuter le script. Assurez-vous qu’une séquence de messages dans le panneau du terminal apparaît avec du bruit pendant l’initialisation de l’atténuateur laser.Dans la fenêtre principale du logiciel VAST, cliquez sur les boutons fléchés pour déplacer la scène et centrer le capillaire par rapport à l’objectif du microscope. Regardez à travers les oculaires et concentrez-vous sur le dessus du capillaire en utilisant la lumière transmise du microscope. Placez une plaque de 96 puits contenant les larves sur le support de plaque gauche de l’échantillonneur LP.Ensuite, placez une autre plaque pour la collecte sur le support de plaque droit de l’échantillonneur. Assurez-vous que le puits A1 de la plaque se trouve dans le coin avant gauche du support. Dans la fenêtre LP Sampler du logiciel VAST, cliquez sur le bouton Modèle de plaque et sélectionnez tous les puits contenant des larves.Cliquez sur le bouton OK pour valider et fermer la fenêtre. Ensuite, cliquez sur le bouton Run plate dans la fenêtre LP Sampler pour commencer à charger la larve. Ensuite, allez dans le logiciel de microscope et cliquez sur le bouton Live pour imager la larve.Allumez le bouton de mise au point du microscope jusqu’à ce que le canal central de la moelle épinière soit visible. Prenez un instantané en fluorescence et enregistrez l’image dans un dossier. Ouvrez l’image dans ImageJ et ajustez le contraste si nécessaire.Cliquez sur l’outil de ligne de région d’intérêt et tracez une courte ligne centrée sur la moelle épinière. Basculez le microscope en position miroir réfléchissant à 100 %. Chargez le script ImageJ et définissez Répétition sur 2, Échantillon sur 1, Largeur sur 40 microns et Atténuation sur 89.Après avoir défini tous les paramètres, cliquez sur le bouton OK. Lorsque la séquence de prise de vue laser est terminée, passez à l’imagerie par fluorescence sur le logiciel d’imagerie et ajustez la mise au point. Prenez un nouvel instantané et enregistrez-le.Ouvrez cette nouvelle image dans ImageJ et tracez une nouvelle ligne plus grande que la moelle épinière elle-même. Basculez le microscope en position miroir réfléchissant à 100 %. Accédez à la fenêtre de script ImageJ et définissez Répétition sur 2, Échantillon sur 1, Largeur sur 40 microns et Atténuation sur 89.Après avoir défini tous les paramètres, cliquez sur le bouton OK. Lorsque la séquence de tir laser est terminée, vérifiez la qualité de la transsection en imageant la fluorescence et la mise au point. Assurez-vous qu’aucune cellule ou axone ne reste intact dans le site de la lésion.Allez dans la fenêtre principale du logiciel VAST et cliquez sur le bouton Collecter pour collecter les larves lésionnées dans la plaque vide de 96 puits. Ensuite, cliquez sur la case à cocher du voyant du plateau pour rallumer le voyant du système VAST. Retirez la larve de la plaque de 96 puits dès que possible et transférez-la dans une boîte de Petri propre avec de l’eau de poisson fraîche pour que la larve puisse récupérer après la lésion.Mettez la boîte de Petri dans un incubateur à 28 degrés Celsius. L’immunofichitecture à la tubuline acétylée et l’imagerie calcique indiquent que la lésion au laser perturbe entièrement la continuité du tissu rachidien. Une moelle épinière intacte est montrée sur cette image.Une perturbation complète des axones entre les côtés caudal et rostral de la lésion confirme la transsection complète de la moelle épinière. Un exemple de transsection incomplète est montré ici. La moelle épinière transectée sur une larve NBTG cAMP 6-S est montrée sur cette image.Les rectangles montrent les ROIs utilisés pour quantifier l’intensité de fluorescence dans les côtés rostral et caudal des lésions. L’image graphique représente le changement d’intensité de fluorescence au fil du temps dans les rois d’analyse rostrale et caudale. Les images de fluorescence de projection d’intensité maximale d’une larve NBT:dsRed avant la lésion laser, après trois heures, 24 heures et 48 heures de la lésion laser sont montrées ici.Après 24 heures après la blessure, les plaies ont commencé à se refermer, entraînant une restauration partielle de la structure initiale de la moelle épinière après 48 heures. Une reconnexion fonctionnelle partielle a été confirmée après 48 heures après la blessure à l’aide de l’imagerie calcique. Le rapport entre l’amplitude des pointes dans la région caudale et la région rostrale a montré une augmentation entre 3, 24 et 48 heures après la blessure.Le recrutement de macrophages a été observé après des lésions laser à l’aide de lésions laser de larves de larves mpeg1 MPEG1 NBT:dsRed. Aucune différence n’a été observée dans le nombre de cellules marquées entre les lésions manuelles et laser. Les poissons non sectionnés présentaient moins de cellules à double marquage que les poissons sectionnés dans les deux conditions de lésion.La lésion au laser induit moins de dommages musculaires et cutanés que la lésion manuelle. Il est essentiel de vérifier si la lésion est complète ou non. Aucune cellule ou structure intacte ne doit être visible dans la zone de la lésion, seulement un fond sombre.Pour étudier la régénération de la moelle épinière, nous utilisons de nombreuses méthodes, y compris l’immuno-histochimie et l’imagerie calcique. Il est important de noter que nous pouvons également faire de l’électrophysiologie, car le tissu peut résister à la dissection, contrairement aux animaux sectionnés manuellement. Cette nouvelle technique nous permet d’étudier quantitativement l’organisation tissulaire structurelle et fonctionnelle de la moelle épinière après une blessure en permettant des lésions reproductibles et contrôlées.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Médecine

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