Name: controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Diese Studie wurde vom BBSRC unterstützt (BB/S0001778/1). CR wird vom Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme finanziert. Wir danken David Greenald (CRH, University of Edinburgh) und Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) für das freundliche Geschenk transgener Fische (siehe Supplementary File). Wir danken Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) für den freundlichen Zugang zum 3i Spinning-Disk Konfokal.

Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung des britischen Innenministeriums und gemäß seinen Vorschriften unter der Projektlizenz PP8160052 durchgeführt. Das Projekt wurde vom University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt. Für experimentelle Analysen wurden Zebrafischlarven, die bis zu 5 Tage alt sind, beiderlei Geschlechts der folgenden verfügbaren transgenen Linien verwendet: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg(betaactin:utrophin-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) und Tg(...

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	<li>Becker, C. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li><li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li><li>Briona, L. K., Dorsky, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1&#946;+and+Tnf-&#945;+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration.">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1&#946; and Tnf-&#945; by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+voltage-gated+Na++and+K++currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li><li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+long-term,+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish.">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish.">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li></ol>

Es besteht ein dringender Bedarf an einem tieferen Verständnis der Prozesse, die während der Regeneration in Zebrafischen ablaufen. Dieses Tiermodell bietet viele Vorteile für die biomedizinische Forschung, insbesondere für Rückenmarksverletzungen1. Die meisten Studien beinhalten manuelle Läsionen, die einen gut ausgebildeten Bediener erfordern und Multigewebeschäden verursachen. Hier wird ein Laserläsionsprotokoll vorgestellt, das die Kontrolle über die Läsionseigenschaften und die Verr...

Im Gegensatz zu Säugetieren können Zebrafische (Danio rerio) nach einer Verletzung ihr zentrales Nervensystem (ZNS) reparieren1. Die Verwendung von Zebrafischlarven als Modell für die Rückenmarksregeneration ist relativ neu. Es hat sich als wertvoll erwiesen, die zellulären und molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Reparatur zugrunde liegen2. Dies liegt an der einfachen Manipulation, dem kurzen Experimentierzyklus (jede Woche neue Larven), der optischen Transparenz des Gewebes und der geringen Größe der Larven, die sich ideal für die In-vivo-Fluoreszenzmikroskopie eignet.
Im Falle der Rückenmarksregeneration sind zwei weitere Vorteile der Verwendung von Larven die Geschwindigkeit der Genesung, einige Tage im Vergleich zu einigen Wochen für Erwachsene, und die Leichtigkeit, Verletzungen mit manuellen Techniken zu induzieren. Dies wurde in vielen Studien3,4,5, einschließlich neuerer Untersuchungen6,7, erfolgreich eingesetzt. Insgesamt führt dies zu einer erhöhten aussagekräftigen Datenproduktion, einer hohen Anpassungsfähigkeit experimenteller Protokolle und geringeren experimentellen Kosten. Die Verwendung von Larven, die jünger als 5 Tage nach der Befruchtung sind, reduziert auch den Einsatz von Tieren nach den 3R-Prinzipien in Tierversuchen8.
Nach einer Rückenmarksverletzung in Zebrafischlarven treten viele biologische Prozesse auf, darunter Entzündungsreaktion, Zellproliferation, Neurogenese, Migration überlebender oder neu erzeugter Zellen, Reformation funktioneller Axone und eine globale Umgestaltung neuronaler Prozessschaltkreise und Wirbelsäulengewebe6,7,9,10 . Um erfolgreich orchestriert zu werden, beinhalten diese Prozesse eine fein regulierte Interaktion zwischen einer Reihe von Zelltypen, extrazellulären Matrixkomponenten und biochemischen Signalen11,12. Die Entschlüsselung der Details dieser signifikanten Reorganisation eines komplexen Gewebes wie des Rückenmarks erfordert die Verwendung und Entwicklung präziser und kontrollierter experimenteller Ansätze.
Das primäre experimentelle Paradigma, das zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischen verwendet wird, besteht darin, chirurgische Mittel zu verwenden, um Gewebeschäden durch Resektion, Stechen oder Kryoverletzungen zu induzieren3,13. Diese Ansätze haben den Nachteil, dass sie eine spezifische Ausbildung in mikrochirurgischen Fähigkeiten erfordern, was für jeden neuen Bediener zeitaufwendig ist und ihre Verwendung in kurzfristigen Projekten verhindern kann. Darüber hinaus induzieren sie in der Regel Schäden am umgebenden Gewebe, die die Regeneration beeinflussen können.
Ein anderer Ansatz besteht darin, Zellschäden chemisch zu induzieren14 oder durch genetische Manipulationen15. Letzteres ermöglicht einen sehr gezielten Schaden. Eine solche Technik erfordert jedoch lange Vorarbeiten, um neue transgene Fische zu erzeugen, bevor ein Experiment durchgeführt wird, das jedes Mal erneuert wird, wenn ein einzigartiger Zelltyp ins Visier genommen wird.
Es besteht daher die Notwendigkeit einer Methode, die gezielte, aber vielseitige Läsionen ermöglicht, die für eine Vielzahl von Studien zur Regeneration geeignet sind. Eine Lösung besteht darin, einen Laser zu verwenden, um lokalisierte Schäden im interessierenden Gewebe zu induzieren16,17,18,19,20. Tatsächlich stellt die Verwendung von laserinduzierten Gewebeschäden einen robusten Ansatz zur Erzeugung von Rückenmarksläsionen mit vielen Vorteilen dar. Die mit solchen Lasermanipulationsmodulen ausgestatteten Mikroskope ermöglichen die Angabe eines kundenspezifisch geformten Bereichs, in dem die Zellablation stattfinden wird, mit dem zusätzlichen Vorteil der zeitlichen Kontrolle. Die Größe und Position der Läsion kann so angepasst werden, um eventuelle Fragen zu beantworten.
Das fehlende Merkmal der meisten Laserläsionssysteme ist die Möglichkeit, Verletzungen auf hochgradig reproduzierbare Weise für eine Reihe von Larven zu induzieren. Hier wird ein Originalprotokoll unter Verwendung eines UV-Lasers beschrieben, um halbautomatische, präzise und kontrollierte Läsionen in Zebrafischlarven zu induzieren, die auf einer mikrofluidischen Plattform basieren, die für die automatisierte Larvenhandhabung entwickelt wurde21. Darüber hinaus werden in dem hier vorgestellten System Larven in eine Glaskapillare eingeführt, die eine freie Rotation des Tieres um seine rostrocaudale Achse ermöglicht. Der Benutzer kann wählen, welche Seite der Larve dem Laser präsentiert werden soll, während die Fluoreszenzbildgebung den Laserstrahl präzise anvisieren und den Schaden nach der Läsion beurteilen kann.
Das hier beschriebene Protokoll wird mit einem halbautomatischen Zebrafischlarven-Bildgebungssystem in Kombination mit einer sich drehenden Scheibe verwendet, die mit einem UV-Laser ausgestattet ist (im Folgenden als VAST-System bezeichnet). Die Hauptpunkte des Protokolls und die meisten Ansprüche der Technik gelten jedoch für jedes System, das mit einem Laser ausgestattet ist, der zur Zellablation fähig ist, einschließlich Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopen, Spinnscheibenmikroskopen, die mit einem UV-Laser (FRAP-Modul) ausgestattet sind, oder Videomikroskope mit einem Lasermodul zur Fotomanipulation. Einer der Hauptunterschiede zwischen dem VAST-System und der konventionellen Probenhandhabung besteht darin, dass für letzteres die Montage von Larven in Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt auf Glasabdeckungen / Petrischalen mit Glasboden erforderlich ist, anstatt sie in eine 96-Well-Platte zu laden.
Die Vorteile, die diese Methode bietet, eröffnen Möglichkeiten für innovative Forschungen zu den zellulären und molekularen Mechanismen während des Regenerationsprozesses. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Datenqualität quantitative Untersuchungen in einem multidisziplinären Kontext.

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		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software Zen Blue 2.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Studio Code</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual AxioCam 506 m CCD cameras</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope LSM880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk module CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopeAxio Examiner D1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser</td>
			<td>Micropoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-It EdU Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin acetylated antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic zebrafish lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mnx1:gfp)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by Katy Reid, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae

Zebrafischlarven besitzen bereits wenige Tage nach der Befruchtung ein voll funktionsfähiges Zentralnervensystem (ZNS) mit hoher Regenerationsfähigkeit. Dies macht dieses Tiermodell sehr nützlich für die Untersuchung von Rückenmarksverletzungen und Regeneration. Das Standardprotokoll zur Induktion solcher Läsionen besteht darin, den dorsalen Teil des Rumpfes manuell zu transektieren. Diese Technik erfordert jedoch ein umfangreiches Training und schädigt zusätzliches Gewebe. Es wurde ein Protokoll für laserinduzierte Läsionen entwickelt, um diese Einschränkungen zu umgehen, was eine hohe Reproduzierbarkeit und Vollständigkeit der Rückenmarkstransektion bei vielen Tieren und zwischen verschiedenen Sitzungen ermöglicht, selbst für einen ungeschulten Bediener. Darüber hinaus sind Gewebeschäden hauptsächlich auf das Rückenmark selbst beschränkt, wodurch verwirrende Effekte durch die Verletzung verschiedener Gewebe, z. B. Haut, Muskeln und ZNS, verringert werden. Darüber hinaus sind Hemi-Läsionen des Rückenmarks möglich. Die verbesserte Erhaltung der Gewebeintegrität nach einer Laserverletzung erleichtert weitere Dissektionen, die für zusätzliche Analysen wie die Elektrophysiologie erforderlich sind. Daher bietet diese Methode eine präzise Kontrolle des Verletzungsausmaßes, die manuell nicht erreichbar ist. Dies ermöglicht neue experimentelle Paradigmen in diesem mächtigen Modell in der Zukunft.

Validierung der Rückenmarkstransektion Es wurden strukturelle und funktionelle Untersuchungen durchgeführt, um zu beurteilen, ob das Protokoll eine vollständige Rückenmarkstransektion zulässt.
Erstens, um zu überprüfen, ob der Verlust der Fluoreszenz an der Läsionsstelle auf neuronale Gewebeschäden und nicht auf Fluoreszenz-Photobleichen durch die Laserbeleuchtung zurückzuführen war, wurde eine Immunfärbung mit einem Antikörper gegen acetyliertes Tubulin (siehe...

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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Induktion gewebespezifischer und hochreproduzierbarer Verletzungen in Zebrafischlarven unter Verwendung eines Laserläsionssystems in Kombination mit einer automatisierten mikrofluidischen Plattform für die Larvenhandhabung.

Kontrollierte halbautomatische laserinduzierte Verletzungen zur Untersuchung der Rückenmarksregeneration bei Zebrafischlarven

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

Die Technik, die wir hier vorschlagen, ermöglicht es uns, die Einschränkungen manueller Läsionsprotokolle zu überwinden, indem wir Schäden an benachbarten Geweben reduzieren und die Reproduzierbarkeit verbessern, selbst für unerfahrene Bediener. Diese Technik ermöglicht es uns, genau zu wählen, wo die Läsion induziert werden soll, ohne das umgebende Gewebe zu schädigen, dank der rotierenden Glaskapillare in Kombination mit einem gezielten UV-Laser. Viele Schritte sind mit dem Betrieb der VAST-Ausrüstung verbunden, daher würde ich empfehlen, jeden Schritt abzuhaken, um sicherzustellen, dass alles korrekt ausgeführt wird.Beginnen Sie mit der Betäubung der Larven mit dem Medium, das das Anästhetikum enthält, und übertragen Sie sie dann auf eine 96-Well-Platte, die 300 Mikroliter Medium pro Well enthält. Schalten Sie alle Systemkomponenten einschließlich des Lasers für die Ablation ein. Starten Sie dann die automatisierte Zebrafisch-Bildgebung oder die VAST-Software, wählen Sie im ersten Fenster Platte und klicken Sie auf die Schaltfläche Fertig.Ein kleines Fenster öffnet sich und fragt, ob die Kapillare leer und sauber ist. Überprüfen Sie das Bild der Kapillare auf Luftblasen im Inneren. Wenn sich keine Luftblasen im Inneren befinden, klicken Sie im Popup-Fenster auf Ja.Gehen Sie als Nächstes im LP Sampler-Fenster zum Menü Datei und wählen Sie die Option Skript öffnen. Wählen Sie eine Datei aus, die das Skript enthält, das dem auszuführenden Experiment entspricht. Gehen Sie dann im Hauptfenster der VAST-Software zu Datei und wählen Sie Experiment öffnen.Wählen Sie die Experimentdatei aus, die dem geplanten Experiment entspricht. Starten Sie die ImageJ/Fiji-Software, gehen Sie zum Menü Datei und wählen Sie Neues Skript, um das Skriptfenster zu öffnen. Gehen Sie dann zum Menü Datei und wählen Sie Öffnen, um das Laserläsionsskript zu laden.Um die Python-IDE zu starten, gehen Sie zum Menü Datei und wählen Sie Datei öffnen, um das Skript zur Verwaltung des Lasers zu laden. Klicken Sie dann auf das Menü Ausführen und wählen Sie Ohne Debuggen ausführen, um das Skript auszuführen. Stellen Sie sicher, dass eine Abfolge von Meldungen im Klemmenbedienfeld zusammen mit etwas Rauschen angezeigt wird, während das Laserdämpfungsglied initialisiert wird.Klicken Sie im Hauptfenster der VAST-Software auf die Pfeiltasten, um die Bühne zu bewegen und die Kapillare relativ zum Mikroskopobjektiv zu zentrieren. Schauen Sie durch die Okulare und fokussieren Sie sich mit dem Durchlicht des Mikroskops auf die Oberseite der Kapillare. Legen Sie eine 96-Well-Platte, die die Larven enthält, auf den linken Plattenhalter des LP-Probenehmers.Legen Sie dann eine weitere Platte zur Sammlung auf den rechten Plattenhalter des Probenehmers. Stellen Sie sicher, dass sich der A1-Brunnen der Platte in der vorderen linken Ecke des Halters befindet. Klicken Sie im LP Sampler-Fenster der VAST-Software auf die Schaltfläche Plattenvorlage und wählen Sie alle Vertiefungen aus, die Larven enthalten.Klicken Sie auf die Schaltfläche OK, um das Fenster zu validieren und zu schließen. Klicken Sie dann im LP Sampler-Fenster auf die Schaltfläche Platte ausführen, um das Laden der Larve zu starten. Gehen Sie als Nächstes zur Mikroskopsoftware und klicken Sie auf die Schaltfläche Live, um die Larve abzubilden.Schalten Sie den Fokusknopf des Mikroskops ein, bis der zentrale Kanal des Rückenmarks sichtbar ist. Machen Sie einen Schnappschuss in Fluoreszenz und speichern Sie das Bild in einem Ordner. Öffnen Sie das Bild in ImageJ und passen Sie bei Bedarf den Kontrast an.Klicken Sie auf das Linienwerkzeug "Region of Interest" und zeichnen Sie eine kurze Linie, die auf dem Rückenmark zentriert ist. Schalten Sie das Mikroskop auf eine 100% reflektierende Spiegelposition. Laden Sie das ImageJ-Skript, und legen Sie Wiederholung auf 2, Beispiel auf 1, Breite auf 40 Mikrometer und Abschwächung auf 89 fest.Nachdem Sie alle Parameter eingestellt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche OK. Wenn die Laserschusssequenz abgeschlossen ist, wechseln Sie in der Bildgebungssoftware zur Fluoreszenzbildgebung und passen Sie den Fokus an. Machen Sie einen neuen Schnappschuss und speichern Sie ihn.Öffnen Sie dieses neue Bild in ImageJ und zeichnen Sie eine neue Linie, die größer ist als das Rückenmark selbst. Schalten Sie das Mikroskop auf eine 100% reflektierende Spiegelposition. Wechseln Sie zum ImageJ-Skriptfenster, und legen Sie Wiederholung auf 2, Beispiel auf 1, Breite auf 40 Mikrometer und Dämpfung auf 89 fest.Nachdem Sie alle Parameter eingestellt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche OK. Wenn die Laserschusssequenz abgeschlossen ist, überprüfen Sie die Transsektionsqualität, indem Sie Fluoreszenz und Fokussierung abbilden. Stellen Sie sicher, dass keine Zellen oder Axone in der Läsionsstelle intakt bleiben.Gehen Sie zum Hauptfenster der VAST-Software und klicken Sie auf die Schaltfläche Sammeln, um die läsionierten Larven in die leere 96-Well-Platte zu sammeln. Klicken Sie dann auf das Kontrollkästchen Fachleuchte, um die VAST-Systemleuchte wieder einzuschalten. Nehmen Sie die Larve so schnell wie möglich von der 96-Well-Platte und geben Sie sie in eine saubere Petrischale mit frischem Fischwasser, damit sich die Larve nach der Läsion erholen kann.Die Petrischale bei 28 Grad Celsius in einen Inkubator stellen. Acetyliertes Tubulin-Immunfärben und Kalziumbildgebung deuten darauf hin, dass die Laserläsion die Kontinuität des Wirbelsäulengewebes vollständig stört. Ein intaktes Rückenmark ist in diesem Bild zu sehen.Eine vollständige Störung der Axone zwischen der kaudalen und der rostralen Seite der Läsion bestätigt die vollständige Durchtrennung des Rückenmarks. Ein Beispiel für eine unvollständige Transsektion ist hier dargestellt. Das transektorierte Rückenmark an einer NBTG cAMP 6-S Larve ist in diesem Bild dargestellt.Die Rechtecke zeigen die ROIs, die zur Quantifizierung der Fluoreszenzintensität in den rostralen und kaudalen Seiten der Läsionen verwendet werden. Das grafische Bild stellt die Fluoreszenzintensitätsänderung im Laufe der Zeit in den ROIs der Rostral- und Schwanzanalyse dar. Die Fluoreszenzbilder einer NBT:dsRed-Larve mit maximaler Intensität vor der Laserläsion, nach drei Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden der Laserläsion sind hier dargestellt.Nach 24 Stunden nach der Verletzung begannen sich die Wunden zu schließen, was nach 48 Stunden zu einer teilweisen Wiederherstellung der ursprünglichen Struktur des Rückenmarks führte. Eine teilweise funktionelle Rekonnektion wurde nach 48 Stunden nach der Verletzung mittels Kalziumbildgebung bestätigt. Das Verhältnis zwischen der Amplitude der Spikes im kaudalen Bereich und im rostralen Bereich zeigte einen Anstieg zwischen 3, 24 und 48 Stunden nach der Verletzung.Die Makrophagenrekrutierung wurde nach Laserläsionen mit NBT:dsRed mpeg1 GFP-Larvenlaserläsionen beobachtet. Es wurde kein Unterschied in der Anzahl der markierten Zellen zwischen manuellen und Laserläsionen beobachtet. Unlesionierte Fische zeigten bei beiden Läsionsbedingungen weniger doppelt markierte Zellen als läsionierte Fische.Laserläsion verursacht weniger Muskel- und Hautschäden als manuelle Läsionen. Es ist wichtig zu überprüfen, ob die Läsion vollständig ist oder nicht. Keine intakte Zelle oder Struktur sollte im Läsionsbereich sichtbar sein, nur ein dunkler Hintergrund.Um die Regeneration des Rückenmarks zu untersuchen, verwenden wir viele Methoden, einschließlich Immunhistochemie und Kalziumbildgebung. Wichtig ist, dass wir auch Elektrophysiologie betreiben können, da das Gewebe im Gegensatz zu manuell läsionierten Tieren einer Dissektion standhalten kann. Diese neue Technik ermöglicht es uns, die strukturelle und funktionelle Gewebeorganisation im Rückenmark nach einer Verletzung quantitativ zu untersuchen, indem wir reproduzierbare und kontrollierte Läsionen zulassen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Akute und chronische taktile Sensorische Testung nach Verletzungen des Rückenmarks bei der Ratte

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Forschung

Medizin

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

Operationstechnik für Spinal Cord Lieferung von Therapien: Demonstration der Vorgehensweise in Göttingen Minischweine

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Controlled Cervical Laceration Verletzungen in Mäuse

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

Eine Prellung Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

A Novel Wirbelstabilisierungsverfahren zur Herstellung Gequetscht Rückenmarksverletzungen

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Controlled Cortical Impact-Modell für traumatische Hirnverletzung

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

Ein Radio-Telemetrie-System zur Herz-Kreislauf-Funktion bei Ratten mit Rückenmarksdurchtrennung und embryonalen Neural Stem Cell Grafts überwachen

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Calibrated Zange Modell Spinal Cord Injury Compression

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Kontrastverstärkten Ultraschall-Bildgebung zur Beurteilung der Spinal Cord Blood Flow in Experimental Rückenmark-Verletzung

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...