Name: controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי BBSRC (BB/S0001778/1). CR ממומן על ידי הנסיכה המלכותית TENOVUS סקוטלנד מחקר רפואי תוכנית מלגות. אנו מודים לדיוויד גרינלד (CRH, אוניברסיטת אדינבורו) וקייטי ריד (CDBS, אוניברסיטת אדינבורו) על המתנה הנדיבה של דגים מהונדסים (ראה קובץ משלים). אנו מודים לדניאל סונג (CRH, אוניברסיטת אדינבורו) על הגישה האדיבה לקונפוקל 3i ספינינג-דיסק.

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו באישור משרד הפנים הבריטי ועל פי תקנותיו, תחת רישיון הפרויקט PP8160052. הפרויקט אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת אדינבורו. לניתוחים ניסיוניים, זחלי דגי זברה עד גיל 5 ימים משני המינים שימשו לקווים הטרנסגניים הזמינים הבאים: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg...

<ol>
	<li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration.">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li><li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish.">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li><li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals.">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li><li>Schl&#252;&#223;ler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging.">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li><li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord.">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li><li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury.">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li><li>. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: <a target="_blank" href="https://nc3rs.org.uk">https://nc3rs.org.uk</a> (2021)</li><li>Hui, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+wide+expression+profiling+during+spinal+cord+regeneration+identifies+comprehensive+cellular+responses+in+Zebrafish.">Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).</li><li>Vasudevan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+interneurons+integrate+into+locomotor+circuitry+following+spinal+cord+injury.">Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).</li><li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li><li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li><li>Briona, L. K., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+transection+in+the+larval+Zebrafish.">Spinal cord transection in the larval Zebrafish.</a> Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+regeneration+in+adult+Zebrafish+by+gentamicin+induced+injury.">Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).</li><li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li><li>Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mitochondrial+transport+in+single-axon+regeneration+of+zebrafish+mauthner+cells.">In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).</li><li>Nichols, E. L., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+sensory+root+via+axonal+invasion.">Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion.</a> Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).</li><li>Ellstr&#246;m, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+zebrafish+induced+by+near-infrared+femtosecond+laser+pulses.">Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).</li><li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion.">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li><li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination.">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+Zebrafish.">Stages of embryonic development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>. AndOr Micropoint Manual Available from: <a target="_blank" href="https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual">https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual</a> (2021)</li><li>Knafo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neurons+control+the+timing+of+spinal+microcircuit+selection+during+locomotion.">Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion.</a> eLife. 6, 25260 (2017).</li><li>Tsarouchas, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1&#946;+and+Tnf-&#945;+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration.">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1&#946; and Tnf-&#945; by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).</li><li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+voltage-gated+Na++and+K++currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li><li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+long-term,+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish.">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish.">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li></ol>

יש צורך דחוף בהבנה עמוקה יותר של התהליכים במשחק במהלך התחדשות בדגי זברה. מודל זה של בעלי חיים מציע יתרונות רבים למחקר ביו-רפואי, במיוחד עבור פגיעות בחוט השדרה1. רוב המחקרים כוללים נגעים ידניים הדורשים מפעיל מאומן היטב ולגרום נזק רב רקמות. פרוטוקול נגע לייזר מוצג כאן, המאפשר שלי...

בניגוד ליונקים, דגי זברה (דניו ריו) יכולים לתקן את מערכת העצבים המרכזית שלהם (CNS) לאחר פציעה1. השימוש בזחלי דגי זברה כמודל להתחדשות חוט השדרה הוא חדש יחסית. זה הוכיח ערך לחקור את המנגנונים התאיים והמולקולריים שבבסיס תיקון2. הסיבה לכך היא קלות המניפולציה, מחזור הניסויים הקצר (זחלים חדשים מדי שבוע), השקיפות האופטית של הרקמות, וגודלו הקטן של הזחלים, המותאם באופן אידיאלי למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של vivo .
במקרה של התחדשות חוט השדרה, שני יתרונות נוספים של שימוש בזחלים הם מהירות ההתאוששות, כמה ימים לעומת כמה שבועות למבוגרים, ואת הקלות של גרימת פציעות באמצעות טכניקות ידניות. זה שימש בהצלחה במחקרים רבים3,4,5, כולל חקירות האחרונות6,7. בסך הכל, זה מוביל לייצור נתונים משמעותיים מוגברים, הסתגלות גבוהה של פרוטוקולים ניסיוניים, וירידה בעלויות הניסוי. השימוש בזחלים מתחת ל-5 ימים לאחר ההפריה גם מפחית את השימוש בבעלי חיים בעקבות עקרונות ה-3R במחקר בבעלי חיים8.
לאחר פגיעה בחוט השדרה בזחלי דגי הזברה, מתרחשים תהליכים ביולוגיים רבים, כולל תגובה דלקתית, התפשטות תאים, נוירוגנזה, הגירה של תאים ששרדו או חדשים שנוצרו, רפורמציה של אקסונים פונקציונליים, ושיפוץ גלובלי של מעגלי תהליכים עצביים ורקמות עמוד שדרה6,7,9,10 . כדי להיות מתוזמר בהצלחה, תהליכים אלה כרוכים אינטראקציה מווסתת היטב בין מגוון של סוגי תאים, רכיבי מטריצה חוץ תאית, אותות ביוכימיים1,12. חשיפת הפרטים של ארגון מחדש משמעותי זה של רקמה מורכבת כגון חוט השדרה דורשת שימוש ופיתוח של גישות ניסיוניות מדויקות ומבוקרות.
הפרדיגמה הניסיונית העיקרית המשמשת לחקר התחדשות חוט השדרה בדגי זברה היא להשתמש באמצעים כירורגיים כדי לגרום נזק לרקמות על ידי כריתה, דקירה או קריוג'ורי3,13. לגישות אלה יש את החיסרון של דרישת הכשרה ספציפית במיומנויות מיקרוכירורגיות, אשר גוזל זמן רב עבור כל מפעיל חדש ועשוי למנוע את השימוש בהם בפרויקטים לטווח קצר. יתר על כן, הם בדרך כלל לגרום נזק לרקמות שמסביב, אשר עשוי להשפיע על התחדשות.
גישה נוספת היא לגרום נזק לתאים כימית14 או על ידי מניפולציות גנטיות15. זה האחרון מאפשר נזק ממוקד מאוד. עם זאת, טכניקה כזו דורשת עבודת הכנה ארוכה כדי ליצור דגים מהונדסים חדשים לפני ביצוע כל ניסוי, מחודש בכל פעם סוג תא ייחודי הוא ממוקד.
יש, אם כן, את הצורך בשיטה המאפשרת נגעים ממוקדים אך תכליתיים המתאימים למגוון מחקרים בהתחדשות. הפתרון הוא להשתמש בלייזר כדי לגרום נזק מקומי ברקמת העניין16,17,18,19,20. ואכן, השימוש בנזק לרקמות הנגרמות בלייזר מציג גישה חזקה ליצירת נגעים בחוט השדרה עם יתרונות רבים. המיקרוסקופים המצוידים במודולים כאלה של מניפולציה בלייזר מאפשרים לציין אזור מעוצב מותאם אישית שבו תתרחש אבלציה של תאים, עם היתרון הנוסף של שליטה זמנית. כך ניתן להתאים את גודלו ומיקום הנגע כדי לענות על כל שאלה.
התכונה החסרה של רוב מערכות נגע הלייזר היא האפשרות לגרום לפציעות באופן רב לשחזור עבור סדרה של זחלים. כאן מתואר פרוטוקול מקורי באמצעות לייזר UV כדי לגרום לנגעים מדויקים ומבוקרים חצי אוטומטיים בזחלי דגי זברה המבוססים על פלטפורמה מיקרופלואידית המיועדת לטיפול אוטומטי בזחלים21. יתר על כן, במערכת המוצגת כאן, זחלים מוכנסים נימי זכוכית, המאפשר סיבוב חופשי של החיה סביב ציר rostrocaudal שלה. המשתמש יכול לבחור איזה צד של הזחל להציג ללייזר תוך מתן הדמיה פלואורסצנטית כדי למקד במדויק את קרן הלייזר ולהעריך את הנזק לאחר הנגע.
הפרוטוקול המתואר כאן משמש עם מערכת הדמיה אוטומטית למחצה של זחלי דגי זברה בשילוב עם דיסק מסתובב המצויד בלייזר UV (המיועד להלן כמערכת VAST). עם זאת, הנקודות העיקריות של הפרוטוקול ורוב הטענות של הטכניקה תקפות לכל מערכת המצוידת בלייזר המסוגל לאבלציה של תאים, כולל מיקרוסקופים לסריקת לייזר שני פוטונים, מיקרוסקופים של דיסק מסתובב המסופקים עם לייזר UV (מודול FRAP), או מיקרוסקופי וידאו עם מודול לייזר לייזר למניפולציה בתמונה. אחד ההבדלים העיקריים בין מערכת VAST לבין טיפול מדגם קונבנציונאלי יהיה כי עבור האחרון, הרכבה זחלים בנקודת התכה נמוכה התעוררו על כיסויי זכוכית / צלחות פטרי תחתית זכוכית במקום לטעון אותם בצלחת 96-well- well יהיה צורך.
היתרונות המוצעים בשיטה זו פותחים הזדמנויות למחקר חדשני על המנגנונים התאיים והמולקולריים במהלך תהליך ההתחדשות. יתר על כן, איכות הנתונים הגבוהה מאפשרת חקירות כמותיות בהקשר רב תחומי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software Zen Blue 2.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Studio Code</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual AxioCam 506 m CCD cameras</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope LSM880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk module CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopeAxio Examiner D1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser</td>
			<td>Micropoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-It EdU Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin acetylated antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic zebrafish lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mnx1:gfp)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by Katy Reid, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae

לזחלי דגי הזברה יש מערכת עצבים מרכזית מתפקדת לחלוטין (CNS) עם יכולת התחדשות גבוהה רק כמה ימים לאחר ההפריה. זה עושה את המודל החייתי הזה מאוד שימושי לחקר פגיעה בחוט השדרה והתחדשות. הפרוטוקול הסטנדרטי לגרימת נגעים כאלה הוא לחצות את החלק הגבי של תא המטען באופן ידני. עם זאת, טכניקה זו דורשת הכשרה נרחבת ופוגעת ברקמות נוספות. פותח פרוטוקול עבור נגעים הנגרמים בלייזר כדי לעקוף מגבלות אלה, המאפשר רבייה גבוהה ושלמות של העברת חוט השדרה על בעלי חיים רבים ובין מפגשים שונים, אפילו עבור מפעיל לא מאומן. יתר על כן, נזק לרקמות מוגבל בעיקר לחוט השדרה עצמו, מה שמפחית השפעות מבלבלות מפגיעה ברקמות שונות, למשל עור, שרירים ומערכת העצבים המרכזית. יתר על כן, נגעים חמי של חוט השדרה אפשריים. שימור משופר של שלמות הרקמות לאחר פגיעה בלייזר מקל על ניתוחים נוספים הדרושים לניתוחים נוספים, כגון אלקטרופיזיולוגיה. לפיכך, שיטה זו מציעה שליטה מדויקת על היקף הפגיעה שאינו ניתן להשגה באופן ידני. זה מאפשר פרדיגמות ניסיוניות חדשות במודל רב עוצמה זה בעתיד.

אימות של העברת חוט השדרה חקירות מבניות ותפקודיות בוצעו כדי להעריך אם הפרוטוקול מאפשר העברה מלאה של חוט השדרה.
ראשית, כדי לוודא כי אובדן פלואורסצנטיות באתר הנגע נבע מנזק לרקמות עצביות ולא מהלבנת פלואורסצנטיות מתאורת הלייזר, בוצע אימונוסטנציה באמצעות נוגדן נגד טו...

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לגרימת פציעות ספציפיות לרקמות ולשחזור גבוה בזחלי דגי זברה באמצעות מערכת נגע בלייזר בשילוב עם פלטפורמה מיקרופלואידית אוטומטית לטיפול בזחלים.

פציעות חצי אוטומטיות מבוקרות הנגרמות בלייזר לחקר התחדשות חוט השדרה בזחלי דגי זברה

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

הטכניקה שאנו מציעים כאן מאפשרת לנו להתגבר על המגבלות של פרוטוקולי נגעים ידניים על ידי הפחתת נזק לרקמות סמוכות ושיפור רבייה, אפילו עבור מפעילים לא מנוסים. טכניקה זו מאפשרת לנו לבחור בדיוק היכן לגרום לנגע מבלי לפגוע ברקמות שמסביב הודות לנימי זכוכית מסתובבים בשילוב עם לייזר UV ממוקד. צעדים רבים מעורבים בהפעלת הציוד VAST, ולכן אני ממליץ לתקתק כל צעד שאתה הולך על מנת להבטיח שהכל נעשה כראוי.התחל על ידי מרדים את הזחלים באמצעות המדיום המכיל את ההרדמה, ולאחר מכן להעביר אותם לצלחת 96-well המכילה 300 מיקרוליטרים של בינוני לבאר. הפעל את כל רכיבי המערכת כולל הלייזר לאבלציה. לאחר מכן, הפעל את הדמיית דגי הזברה האוטומטית, או תוכנת VAST, בחר צלחת בחלון הראשון ולחץ על לחצן סיים.חלון קטן יצוץ וישאל אם הנימים ריקים ונקיים. בדוק את התמונה של נימי עבור כל בועות אוויר בפנים. אם אין בועות אוויר בפנים, לחץ על כן על החלון הקופץ.הבא בחלון LP Sampler, עבור לתפריט קובץ ובחר באפשרות פתח סקריפט. בחר קובץ המכיל את קובץ ה- Script המתאים לניסוי שיש לבצע. לאחר מכן, בחלון התוכנה הראשי של VAST, עבור אל קובץ ובחר פתח ניסוי.בחר את קובץ הניסוי המתאים לניסוי המתוכנן. הפעל את תוכנת ImageJ/Fiji, עבור לתפריט קובץ ובחר סקריפט חדש כדי לפתוח את חלון הסקריפט. לאחר מכן, עבור לתפריט קובץ ובחר פתח כדי לטעון את סקריפט נגע הלייזר.לאחר מכן, כדי להפעיל את Python IDE, עבור לתפריט קובץ ובחר פתח קובץ כדי לטעון את קובץ ה- Script כדי לנהל את הלייזר. לאחר מכן, לחץ על תפריט הפעלה ובחר הפעל ללא איתור באגים כדי להפעיל את קובץ ה- Script. ודא כי רצף של הודעות בחלונית המסוף מופיע יחד עם רעש מסוים בעת אתחול מנחת הלייזר.בחלון הראשי של תוכנת VAST, לחץ על כפתורי החצים כדי להזיז את הבמה ולרכז את הנימים ביחס למטרת המיקרוסקופ. הבט דרך העיניים והתמקד בחלק העליון של הנימים באמצעות האור המועבר של המיקרוסקופ. מניחים צלחת 96-well המכיל את הזחלים על מחזיק הצלחת השמאלית של סמפלר LP.לאחר מכן, הנח צלחת נוספת לאיסוף על מחזיק הצלחת הימני של הסמפלר. ודא כי באר A1 של הצלחת נמצאת בפינה השמאלית הקדמית של המחזיק. בחלון LP סמפלר של תוכנת VAST, לחץ על כפתור תבנית צלחת ובחר את כל הבארות המכילות זחלים.לחץ על לחצן אישור כדי לאמת ולסגור את החלון. לאחר מכן, לחץ על לחצן לוחית הפעלה בחלון סמפלר LP כדי להתחיל לטעון את הזחל. לאחר מכן, עבור אל תוכנת המיקרוסקופ ולחץ על לחצן Live כדי לדמיין את הזחל.הפעל את ידית המיקוד של המיקרוסקופ עד שהתעלה המרכזית של חוט השדרה נראית לעין. צלם תמונה בפלואורסצנטיות ושמור את התמונה בתיקיה. פתחו את התמונה ב-ImageJ והתאמו את החדות במידת הצורך.לחץ על כלי קו אזור העניין וצייר קו קצר שבמרכזו חוט השדרה. העבר את המיקרוסקופ למיקום מראה רפלקטיבי של 100%. טען את סקריפט ImageJ והגדר חזרה ל- 2, מדגם ל- 1, רוחב ל- 40 מיקרון והנחתה ל- 89.לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על לחצן אישור. לאחר סיום רצף צילומי הלייזר, עבור להדמיית פלואורסצנטיות בתוכנת ההדמיה והתאם את המוקד. קח תמונה חדשה ושמור אותה.פתח תמונה חדשה זו ב- ImageJ וצייר קו חדש גדול יותר מחוט השדרה עצמו. העבר את המיקרוסקופ למיקום מראה רפלקטיבי של 100%. עבור אל חלון הסקריפט ImageJ והגדר את החזרה ל- 2, לדוגמה ל- 1, רוחב ל- 40 מיקרון והנחתה ל- 89.לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על לחצן אישור. כאשר רצף צילומי הלייזר מסתיים, ודא את איכות ההעברה על-ידי הדמיית פלואורסצנטיות ומיקוד. ודא שאף תאים או אקסונים לא יישארו שלמים באתר הנגע.עבור אל חלון התוכנה הראשי VAST ולחץ על כפתור איסוף כדי לאסוף את הזחלים הנגעים לתוך צלחת ריקה 96-well. לאחר מכן, לחץ על נורית מגש תיבת הסימון כדי להפעיל שוב את נורית המערכת VAST. מוציאים את הזחל מצלחת 96 הבארות בהקדם האפשרי, ומעבירים אותם לצלחת פטרי נקייה עם מי דגים טריים לזחל כדי להתאושש לאחר הנגע.שים את צלחת פטרי באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס. אצטילציה טובולין אימונו-כתמים והדמיה סידן עולה כי נגע לייזר משבש לחלוטין את ההמשכיות של רקמת עמוד השדרה. חוט שדרה שלם מוצג בתמונה זו.הפרעה מוחלטת של האקסונים בין הצדדים הקואודליים והרוסטרליים של הנגע מאשרת את ההעברה המלאה של חוט השדרה. דוגמה להעברה לא שלמה מוצגת כאן. חוט השדרה חוצה על זחל NBTG cAMP 6-S מוצג בתמונה זו.המלבנים מראים את החזרי ההשקעה המשמשים לכימות עוצמת הפלואורסצנטיות בצדדים הרוסטרליים והקאודליים של הנגעים. התמונה הגרפית מייצגת את השינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות לאורך זמן ב- ROSTRAL ו- roaudal analysis ROIs. תמונות הפלואורסצנטיות של הקרנת ההקרנה בעוצמה המרבית של זחל NBT:dsRed לפני נגע הלייזר, לאחר שלוש שעות, 24 שעות ו -48 שעות של נגע הלייזר מוצגות כאן.לאחר 24 שעות לאחר הפציעה, הפצעים החלו להיסגר, מה שהוביל לשיקום חלקי של המבנה הראשוני של חוט השדרה לאחר 48 שעות. חיבור תפקודי חלקי אושר לאחר 48 שעות לאחר הפציעה באמצעות הדמיית סידן. היחס בין משרעת הקוצים באזור caudal לבין אזור rostral הראה עלייה בין 3, 24, ו 48 שעות לאחר הפציעה.גיוס מקרופאג נצפתה לאחר נגעים בלייזר באמצעות NBT:dsRed mpeg1 GFP נגעי לייזר זחלים. לא נצפתה הבדל במספר התאים המסומנים בין נגעים ידניים ללייזר. דגים ללא נגע הציגו פחות תאים בעלי תווית כפולה מאשר דגים נגועים בשני תנאי הנגע.נגע בלייזר גורם פחות נזק לשרירים ולעור מאשר נגע ידני. זה קריטי כדי לוודא אם הנגע הושלם או לא. אין לראות תא או מבנה שלם באזור הנגע, רק רקע עמום.כדי לחקור התחדשות חוט השדרה, אנו משתמשים בשיטות רבות, כולל אימונו-היסטוכימיה והדמיה סידן. חשוב לציין, אנחנו יכולים גם לעשות אלקטרופיזיולוגיה, כמו הרקמה יכולה לעמוד בחתך, בניגוד לבעלי חיים נגועים באופן ידני. טכניקה חדשה זו מאפשרת לנו ללמוד כמותית את ארגון הרקמות המבניות והתפקודיות בחוט השדרה לאחר פציעה על ידי מתן אפשרות לנגעים הניתנים לשחזור ומבוקרים.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

אקוטי וכרוני בדיקה חושי טקטילי לאחר פגיעה בחוט השדרה של חולדות

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

טכניקה כירורגית למשלוח חוט שדרה של טיפולים: הפגנה של הנוהל בגטינגן Minipigs

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

פגיעה קריעת צוואר הרחם מבוקרת בעכברים

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

דגם חבורה של פגיעה בחוט השדרה חמורה בחולדות

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

ייצוב שיטה חדש להפקת חוליות פגיעה בחוט השדרה Contusive

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

השתלת זכוכית חוט השדרה של Windows בעכברים בוגרים עם ניסיון אוטואימוניות Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

השפעת דגם קליפת המוח מבוקר לפגיעה מוחית טראומטית

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

מערכת רדיו-telemetric לפקח פונקצית לב וכלי דם אצל חולדות עם חוט השדרה חיתוך רוחב ועוברי גזע עצבי שתלי סלולארי

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

מכויל דגם מלקחיים של חוט השדרה דחיסת פגיעה

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

השווה אולטראסאונד הדמיה משופרת להערכה של חוט השדרה זרימת דם בפגיעה בחוט השדרה הניסויית

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...