Name: controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Questo studio è stato supportato dal BBSRC (BB/S0001778/1). CR è finanziato dal Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Ringraziamo David Greenald (CRH, Università di Edimburgo) e Katy Reid (CDBS, Università di Edimburgo) per il gentile dono del pesce transgenico (Vedi file supplementare). Ringraziamo Daniel Soong (CRH, Università di Edimburgo) per il gentile accesso alla confocale a disco rotante 3i.

Tutti gli studi sugli animali sono stati condotti con l'approvazione del Ministero degli Interni del Regno Unito e secondo i suoi regolamenti, sotto la licenza di progetto PP8160052. Il progetto è stato approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Edimburgo. Per le analisi sperimentali, sono state utilizzate larve di zebrafish fino a 5 giorni di entrambi i sessi delle seguenti linee transgeniche disponibili: Tg (Xla.Tubb: DsRed;mpeg1: GFP), Tg (Xla.Tubb: DsRed), Tg (betaacti...

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	<li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration.">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li><li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish.">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li><li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals.">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li><li>Schl&#252;&#223;ler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging.">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li><li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord.">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li><li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury.">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li><li>. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: <a target="_blank" href="https://nc3rs.org.uk">https://nc3rs.org.uk</a> (2021)</li><li>Hui, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+wide+expression+profiling+during+spinal+cord+regeneration+identifies+comprehensive+cellular+responses+in+Zebrafish.">Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).</li><li>Vasudevan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+interneurons+integrate+into+locomotor+circuitry+following+spinal+cord+injury.">Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).</li><li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li><li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li><li>Briona, L. K., Dorsky, R. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li><li>Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mitochondrial+transport+in+single-axon+regeneration+of+zebrafish+mauthner+cells.">In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).</li><li>Nichols, E. L., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+sensory+root+via+axonal+invasion.">Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion.</a> Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).</li><li>Ellstr&#246;m, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+zebrafish+induced+by+near-infrared+femtosecond+laser+pulses.">Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).</li><li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion.">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li><li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination.">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+Zebrafish.">Stages of embryonic development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>. AndOr Micropoint Manual Available from: <a target="_blank" href="https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual">https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual</a> (2021)</li><li>Knafo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neurons+control+the+timing+of+spinal+microcircuit+selection+during+locomotion.">Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion.</a> eLife. 6, 25260 (2017).</li><li>Tsarouchas, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1&#946;+and+Tnf-&#945;+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration.">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1&#946; and Tnf-&#945; by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).</li><li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+voltage-gated+Na++and+K++currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li><li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+long-term,+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish.">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish.">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li></ol>

C'è un urgente bisogno di una comprensione più profonda dei processi in gioco durante la rigenerazione nel pesce zebra. Questo modello animale offre molti vantaggi per la ricerca biomedica, in particolare per le lesioni del midollo spinale1. La maggior parte degli studi riguarda lesioni manuali che richiedono un operatore ben addestrato e inducono danni multi-tessuto. Qui viene presentato un protocollo di lesione laser, che consente il controllo delle caratteristiche della lesione e la riduzione...

A differenza dei mammiferi, il pesce zebra (Danio rerio) può riparare il loro sistema nervoso centrale (SNC) dopo un infortunio1. L'uso di larve di zebrafish come modello per la rigenerazione del midollo spinale è relativamente recente. Si è dimostrato utile studiare i meccanismi cellulari e molecolari alla base della riparazione2. Ciò è dovuto alla facilità di manipolazione, al breve ciclo sperimentale (nuove larve ogni settimana), alla trasparenza ottica dei tessuti e alle piccole dimensioni delle larve, ideali per la microscopia a fluorescenza in vivo .
Nel caso della rigenerazione del midollo spinale, due ulteriori vantaggi dell'utilizzo delle larve sono la velocità di recupero, pochi giorni rispetto a poche settimane per gli adulti, e la facilità di indurre lesioni utilizzando tecniche manuali. Questo è stato utilizzato con successo in molti studi3,4,5, comprese recenti indagini6,7. Nel complesso, ciò porta a una maggiore produzione di dati significativi, un'elevata adattabilità dei protocolli sperimentali e una diminuzione dei costi sperimentali. L'uso di larve di età inferiore ai 5 giorni dopo la fecondazione riduce anche l'uso di animali seguendo i principi 3R nella ricerca sugli animali8.
Dopo una lesione del midollo spinale nelle larve di zebrafish, si verificano molti processi biologici, tra cui la risposta infiammatoria, la proliferazione cellulare, la neurogenesi, la migrazione delle cellule sopravvissute o di nuova generazione, la riforma degli assoni funzionali e un rimodellamento globale dei circuiti dei processi neurali e dei tessuti della colonna vertebrale6,7,9,10 . Per essere orchestrati con successo, questi processi comportano un'interazione finemente regolata tra una gamma di tipi di cellule, componenti della matrice extracellulare e segnali biochimici11,12. Svelare i dettagli di questa significativa riorganizzazione di un tessuto complesso come il midollo spinale richiede l'uso e lo sviluppo di approcci sperimentali precisi e controllati.
Il paradigma sperimentale primario utilizzato per studiare la rigenerazione del midollo spinale nel pesce zebra è quello di utilizzare mezzi chirurgici per indurre danni ai tessuti mediante resezione, pugnalata o crioigiura3,13. Questi approcci hanno lo svantaggio di richiedere una formazione specifica nelle competenze di microchirurgia, che richiede tempo per qualsiasi nuovo operatore e può impedirne l'uso in progetti a breve termine. Inoltre, di solito inducono danni ai tessuti circostanti, che possono influenzare la rigenerazione.
Un altro approccio consiste nell'indurre danni cellulari chimicamente14 o mediante manipolazioni genetiche15. Quest'ultimo consente danni altamente mirati. Tuttavia, tale tecnica richiede un lungo lavoro preparatorio per generare nuovi pesci transgenici prima di fare qualsiasi esperimento, rinnovato ogni volta che viene preso di mira un tipo di cellula unico.
C'è, quindi, la necessità di un metodo che consenta lesioni mirate ma versatili adatte a una varietà di studi sulla rigenerazione. Una soluzione consiste nell'utilizzare un laser per indurre danni localizzati nel tessuto di interesse16,17,18,19,20. In effetti, l'uso del danno tissutale indotto dal laser presenta un approccio robusto per generare lesioni del midollo spinale con molti vantaggi. I microscopi dotati di tali moduli di manipolazione laser consentono di specificare un'area sagomata personalizzata in cui si verificherà l'ablazione cellulare, con l'ulteriore vantaggio del controllo temporale. La dimensione e la posizione della lesione possono quindi essere adattate per rispondere a qualsiasi domanda.
La caratteristica mancante della maggior parte dei sistemi di lesioni laser è la possibilità di indurre lesioni in modo altamente riproducibile per una serie di larve. Qui viene descritto un protocollo originale che utilizza un laser UV per indurre lesioni semi-automatizzate precise e controllate nelle larve di zebrafish basate su una piattaforma microfluidica progettata per la manipolazione automatizzata delle larve21. Inoltre, nel sistema qui presentato, le larve sono inserite in un capillare di vetro, che consente la libera rotazione dell'animale attorno al suo asse rostrocaudale. L'utente può scegliere quale lato della larva presentare al laser, consentendo al contempo l'imaging a fluorescenza per indirizzare con precisione il raggio laser e valutare il danno dopo la lesione.
Il protocollo qui descritto viene utilizzato con un sistema di imaging semi-automatizzato delle larve di zebrafish combinato con un disco rotante dotato di un laser UV (designato di seguito come sistema VAST). Tuttavia, i punti principali del protocollo e la maggior parte delle affermazioni della tecnica sono validi per qualsiasi sistema dotato di un laser in grado di ablazione cellulare, compresi microscopi a scansione laser a due fotoni, microscopi a disco rotante dotati di un laser UV (modulo FRAP) o videomicroscopi con un modulo laser per la manipolazione fotografica. Una delle principali differenze tra il sistema VAST e la gestione convenzionale dei campioni sarà che per quest'ultimo sarà necessario montare larve in agarosio a basso punto di fusione su coperture di vetro / piastre di Petri con fondo di vetro invece di caricarle in una piastra a 96 pozzetti.
I benefici offerti da questo metodo aprono opportunità di ricerca innovativa sui meccanismi cellulari e molecolari durante il processo di rigenerazione. Inoltre, l'elevata qualità dei dati consente indagini quantitative in un contesto multidisciplinare.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software Zen Blue 2.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Studio Code</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual AxioCam 506 m CCD cameras</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope LSM880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk module CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopeAxio Examiner D1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser</td>
			<td>Micropoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-It EdU Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin acetylated antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic zebrafish lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mnx1:gfp)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by Katy Reid, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae

Le larve di zebrafish possiedono un sistema nervoso centrale (SNC) completamente funzionale con un'elevata capacità rigenerativa solo pochi giorni dopo la fecondazione. Questo rende questo modello animale molto utile per studiare le lesioni e la rigenerazione del midollo spinale. Il protocollo standard per indurre tali lesioni è quello di transettare manualmente la parte dorsale del tronco. Tuttavia, questa tecnica richiede un ampio allenamento e danneggia i tessuti aggiuntivi. È stato sviluppato un protocollo per le lesioni indotte dal laser per aggirare queste limitazioni, consentendo un'elevata riproducibilità e completezza della transezione del midollo spinale su molti animali e tra diverse sessioni, anche per un operatore non addestrato. Inoltre, il danno tissutale è principalmente limitato al midollo spinale stesso, riducendo gli effetti confondenti derivanti dalla lesione di diversi tessuti, ad esempio pelle, muscoli e SNC. Inoltre, sono possibili emi-lesioni del midollo spinale. Una migliore conservazione dell'integrità dei tessuti dopo una lesione laser facilita ulteriori dissezioni necessarie per ulteriori analisi, come l'elettrofisiologia. Quindi, questo metodo offre un controllo preciso dell'entità della lesione che è irraggiungibile manualmente. Ciò consente nuovi paradigmi sperimentali in questo potente modello in futuro.

Validazione della transezione del midollo spinale Sono state eseguite indagini strutturali e funzionali per valutare se il protocollo consente una completa traslazione del midollo spinale.
In primo luogo, per verificare che la perdita di fluorescenza nel sito della lesione fosse dovuta al danno del tessuto neuronale e non alla fotosbiancamento a fluorescenza dall'illuminazione laser, è stata eseguita l'immunocolorazione utilizzando un anticorpo contro la tubulina acetilata...

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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Il presente protocollo descrive un metodo per indurre lesioni tessuto-specifiche e altamente riproducibili nelle larve di zebrafish utilizzando un sistema di lesione laser combinato con una piattaforma microfluidica automatizzata per la manipolazione delle larve.

Lesioni indotte da laser semi-automatizzate controllate per lo studio della rigenerazione del midollo spinale nelle larve di zebrafish

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

La tecnica che proponiamo qui ci permette di superare i limiti dei protocolli delle lesioni manuali riducendo i danni ai tessuti adiacenti e migliorando la riproducibilità, anche per gli operatori inesperti. Questa tecnica ci permette di scegliere con precisione dove indurre la lesione senza danneggiare i tessuti circostanti grazie al capillare vetro rotante combinato con un laser UV mirato. Molti passaggi sono coinvolti nel funzionamento dell'apparecchiatura VAST, quindi consiglierei di spuntare ogni passaggio mentre si procede per garantire che tutto sia fatto correttamente.Inizia anestetizzando le larve usando il mezzo contenente l'anestetico, quindi trasferiscile su una piastra a 96 pozzetti contenente 300 microlitri di mezzo per pozzetto. Accendere tutti i componenti del sistema compreso il laser per l'ablazione. Quindi, avvia l'imaging zebrafish automatizzato o il software VAST, scegli Piastra nella prima finestra e fai clic sul pulsante Fine.Apparirà una piccola finestra che chiederà se il capillare è vuoto e pulito. Controllare l'immagine del capillare per eventuali bolle d'aria all'interno. Se non ci sono bolle d'aria all'interno, fai clic su Sì nella finestra spuntata.Quindi, nella finestra LP Sampler, vai al menu File e seleziona l'opzione Apri script. Scegli un file contenente lo script corrispondente all'esperimento da eseguire. Quindi, nella finestra principale del software VAST, vai su File e scegli Apri esperimento.Scegliere il file dell'esperimento corrispondente all'esperimento pianificato. Avvia il software ImageJ / Fiji, vai al menu File e scegli Nuovo script per aprire la finestra dello script. Quindi, vai al menu File e scegli Apri per caricare lo script della lesione laser.Successivamente, per avviare l'IDE Python, vai al menu File e scegli Apri file per caricare lo script per gestire il laser. Quindi, fare clic sul menu Esegui e scegliere Esegui senza debug per eseguire lo script. Assicurarsi che venga visualizzata una sequenza di messaggi nel pannello terminale insieme a un po' di rumore durante l'inizializzazione dell'attenuatore laser.Nella finestra principale del software VAST, fare clic sui pulsanti freccia per spostare il palco e centrare il capillare rispetto all'obiettivo del microscopio. Guarda attraverso gli oculari e concentrati sulla parte superiore del capillare usando la luce trasmessa dal microscopio. Posizionare una piastra a 96 pozzetti contenente le larve sul supporto sinistro del campionatore LP.Quindi, posizionare un'altra piastra per la raccolta sul supporto destro del campionatore. Assicurarsi che il pozzetto A1 della piastra si trovi nell'angolo anteriore sinistro del supporto. Nella finestra LP Sampler del software VAST, fare clic sul pulsante Modello di piastra e selezionare tutti i pozzetti contenenti larve.Fare clic sul pulsante OK per convalidare e chiudere la finestra. Quindi, fai clic sul pulsante Esegui piastra nella finestra LP Sampler per iniziare a caricare la larva. Quindi, vai al software del microscopio e fai clic sul pulsante Live per visualizzare la larva.Accendere la manopola di messa a fuoco del microscopio fino a quando il canale centrale del midollo spinale è visibile. Scatta un'istantanea in fluorescenza e salva l'immagine in una cartella. Aprire l'immagine in ImageJ e regolare il contrasto, se necessario.Fare clic sullo strumento linea della regione di interesse e disegnare una breve linea centrata sul midollo spinale. Impostare il microscopio in posizione dello specchio riflettente al 100%. Caricare lo script ImageJ e impostare Ripetizione su 2, Campione su 1, Larghezza su 40 micron e Attenuazione su 89.Dopo aver impostato tutti i parametri, fare clic sul pulsante OK. Al termine della sequenza di riprese laser, passare all'imaging a fluorescenza sul software di imaging e regolare la messa a fuoco. Scatta una nuova istantanea e salvala.Apri questa nuova immagine in ImageJ e disegna una nuova linea più grande del midollo spinale stesso. Impostare il microscopio in posizione dello specchio riflettente al 100%. Vai alla finestra dello script ImageJ e imposta Ripetizione su 2, Campione su 1, Larghezza su 40 micron e Attenuazione su 89.Dopo aver impostato tutti i parametri, fare clic sul pulsante OK. Al termine della sequenza di riprese laser, verificare la qualità della trasezione mediante l'imaging della fluorescenza e della messa a fuoco. Assicurarsi che nessuna cellula o assone rimanga intatto nel sito della lesione.Vai alla finestra principale del software VAST e fai clic sul pulsante Raccogli per raccogliere le larve lesionate nella piastra vuota da 96 pozzetti. Quindi, fare clic sulla spia del vassoio della casella di controllo per riaccendere la luce del sistema VAST. Estrarre la larva dal piatto a 96 pozzetti il prima possibile e trasferirla in una capsula di Petri pulita con acqua di pesce fresco affinché la larva recuperi la post-lesione.Metti la capsula di Petri in un'incubatrice a 28 gradi Celsius. L'immunocolorazione acetilata della tubulina e l'imaging del calcio indicano che la lesione laser interrompe completamente la continuità del tessuto spinale. Un midollo spinale intatto è mostrato in questa immagine.Una completa interruzione degli assoni tra i lati caudale e rostrale della lesione conferma la completa trasezione del midollo spinale. Un esempio di transezione incompleta è mostrato qui. Il midollo spinale transettato su una larva NBTG cAMP 6-S è mostrato in questa immagine.I rettangoli mostrano i ROI utilizzati per quantificare l'intensità di fluorescenza nei lati rostrale e caudale delle lesioni. L'immagine grafica rappresenta la variazione di intensità della fluorescenza nel tempo nei ROI di analisi rostrale e caudale. Le immagini di fluorescenza di proiezione di massima intensità di una larva NBT:dsRed prima della lesione laser, dopo tre ore, 24 ore e 48 ore della lesione laser sono mostrate qui.Dopo 24 ore dopo l'infortunio, le ferite hanno iniziato a chiudersi, portando a un parziale ripristino della struttura iniziale del midollo spinale dopo 48 ore. Una parziale riconnessione funzionale è stata confermata dopo 48 ore dopo l'infortunio utilizzando l'imaging del calcio. Il rapporto tra l'ampiezza dei picchi nell'area caudale e l'area rostrale ha mostrato un aumento tra 3, 24 e 48 ore dopo l'infortunio.Il reclutamento dei macrofagi è stato osservato dopo lesioni laser utilizzando lesioni laser larve NBT:dsRed mpeg1 GFP. Non è stata osservata alcuna differenza nel numero di cellule marcate tra lesioni manuali e laser. I pesci non menzionati hanno mostrato meno cellule a doppia etichetta rispetto ai pesci lesionati in entrambe le condizioni di lesione.La lesione laser induce meno danni muscolari e cutanei rispetto alla lesione manuale. È fondamentale verificare se la lesione è completa o meno. Nessuna cellula o struttura intatta deve essere visibile nell'area della lesione, solo uno sfondo debole.Per studiare la rigenerazione del midollo spinale, utilizziamo molti metodi, tra cui l'immuno-istochimica e l'imaging del calcio. È importante sottolineare che possiamo anche fare elettrofisiologia, poiché il tessuto può resistere alla dissezione, contrariamente agli animali lesionati manualmente. Questa nuova tecnica ci permette di studiare quantitativamente l'organizzazione strutturale e funzionale dei tessuti nel midollo spinale dopo la lesione consentendo lesioni riproducibili e controllate.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Acuta e Cronica test sensoriale tattile dopo lesione del midollo spinale in ratti

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Ricerca

Medicina

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

Tecnica chirurgica per la consegna del midollo spinale per le terapie: Dimostrazione di procedura a Gottinga nel maialino

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Controllata cervicale lesioni lacerazione nei topi

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

Un modello Contusione di gravi lesioni del midollo spinale nei ratti

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

A Novel vertebrale metodo di stabilizzazione per la produzione di Contusivi Cord Injury spinale

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Controllata corticale modello Impact per trauma cranico

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

Un sistema radio-telemetria per monitorare la funzionalità cardiovascolare in ratti con midollo spinale e Transection embrionali staminali neurali Innesti cellulari

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Calibrato forcipe Modello di Spinal Cord Injury Compression

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Ultrasuoni Imaging per la valutazione di Spinal Cord Blood Flow in Sperimentale midollo spinale Lesioni

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...