Name: controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

이 연구는 BBSRC (BB/S0001778/1)에 의해 지원되었다. CR은 Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Program의 지원을 받습니다. 우리는 데이비드 그린 알드 (CRH, 에딘버러 대학)와 케이티 리드 (CDBS, 에딘버러 대학)에게 트랜스제닉 물고기의 친절한 선물에 감사드립니다 ( 보충 파일 참조). 우리는 Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh)에게 3i 회전 디스크 공초점에 대한 친절한 접근에 감사드립니다.

모든 동물 연구는 영국 내무부의 승인과 규정에 따라 프로젝트 라이센스 PP8160052에 따라 수행되었습니다. 이 프로젝트는 University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았습니다. 실험 분석을 위해, 어느 성별의 5 일까지의 제브라 피쉬 유충을 다음과 같은 사용 가능한 트랜스제닉 라인으로 사용했습니다 : Tg (Xla.Tubb : DsRed; mpeg1 : GFP), Tg (Xla.Tubb : DsRed), Tg (betaactin : utrophin-mCherry), Tg (Xl...

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	<li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration.">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li><li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish.">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li><li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals.">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li><li>Schl&#252;&#223;ler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging.">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li><li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord.">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li><li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury.">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li><li>. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: <a target="_blank" href="https://nc3rs.org.uk">https://nc3rs.org.uk</a> (2021)</li><li>Hui, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+wide+expression+profiling+during+spinal+cord+regeneration+identifies+comprehensive+cellular+responses+in+Zebrafish.">Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).</li><li>Vasudevan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+interneurons+integrate+into+locomotor+circuitry+following+spinal+cord+injury.">Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).</li><li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li><li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li><li>Briona, L. K., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+transection+in+the+larval+Zebrafish.">Spinal cord transection in the larval Zebrafish.</a> Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+regeneration+in+adult+Zebrafish+by+gentamicin+induced+injury.">Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).</li><li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li><li>Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mitochondrial+transport+in+single-axon+regeneration+of+zebrafish+mauthner+cells.">In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).</li><li>Nichols, E. L., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+sensory+root+via+axonal+invasion.">Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion.</a> Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).</li><li>Ellstr&#246;m, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+zebrafish+induced+by+near-infrared+femtosecond+laser+pulses.">Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).</li><li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion.">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li><li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination.">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+Zebrafish.">Stages of embryonic development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>. AndOr Micropoint Manual Available from: <a target="_blank" href="https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual">https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual</a> (2021)</li><li>Knafo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neurons+control+the+timing+of+spinal+microcircuit+selection+during+locomotion.">Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion.</a> eLife. 6, 25260 (2017).</li><li>Tsarouchas, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1&#946;+and+Tnf-&#945;+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration.">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1&#946; and Tnf-&#945; by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).</li><li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+voltage-gated+Na++and+K++currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li><li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+long-term,+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish.">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish.">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li></ol>

제브라 피쉬에서 재생하는 동안 재생되는 과정에 대한 더 깊은 이해가 시급히 필요합니다. 이 동물 모델은 생물 의학 연구, 특히 척수 손상에 많은 이점을 제공합니다1. 대부분의 연구는 잘 훈련 된 작업자를 필요로하고 다중 조직 손상을 유도하는 수동 병변을 포함합니다. 레이저 병변 프로토콜이 여기에 제시되어 병변 특성을 제어하고 주변 조직의 손상을 줄일 수 있습니다. 또...

포유류와는 달리, 제브라피쉬(Danio rerio)는 부상 후 중추신경계(CNS)를 회복시킬 수 있습니다1. 척수 재생을위한 모델로 제브라 피쉬 유충을 사용하는 것은 비교적 최근입니다. 수리의 기초가되는 세포 및 분자 메커니즘을 조사하는 것이 가치가 있음이 입증되었습니다2. 이것은 조작의 용이성, 짧은 실험주기 (매주 새로운 애벌레), 조직의 광학 투명성 및 유충의 작은 크기 때문에 생체 내 형광 현미경 검사에 이상적입니다.
척수 재생의 경우, 애벌레 사용의 두 가지 추가 이점은 회복 속도, 성인의 경우 몇 주에 비해 며칠, 수동 기술을 사용하여 부상을 유발할 수 있다는 것입니다. 이것은 최근의 조사6,7을 포함하여 많은 연구3,4,5에서 성공적으로 사용되었습니다. 전반적으로 이로 인해 의미 있는 데이터 생산이 증가하고 실험 프로토콜의 적응성이 높으며 실험 비용이 절감됩니다. 수정 후 5 일 미만의 유충을 사용하면 동물 연구에서 3R 원칙에 따라 동물의 사용이 줄어 듭니다.8.
제브라피쉬 유충의 척수 손상 후, 염증 반응, 세포 증식, 신경 발생, 생존 또는 새로 생성 된 세포의 이동, 기능성 축삭의 개혁, 신경 과정 회로 및 척추 조직의 글로벌 리모델링을 포함한 많은 생물학적 과정이 발생합니다6,7,9,10 . 성공적으로 조율되기 위해, 이러한 과정은 다양한 세포 유형, 세포외 매트릭스 성분 및 생화학적 신호들 사이의 미세하게 조절된 상호작용을 수반한다11,12. 척수와 같은 복잡한 조직의 이러한 중요한 재구성에 대한 세부 사항을 풀기 위해서는 정밀하고 통제 된 실험 접근법의 사용과 개발이 필요합니다.
제브라피쉬에서 척수 재생을 연구하는 데 사용되는 주요 실험 패러다임은 절제술, 찌르기 또는 냉동 손상에 의한 조직 손상을 유도하기 위해 외과 적 수단을 사용하는 것입니다3,13. 이러한 접근법은 미세 수술 기술에 대한 특정 교육이 필요하다는 단점이 있으며, 이는 새로운 운영자에게 시간이 많이 걸리고 단기 프로젝트에서 사용하지 못할 수 있습니다. 또한, 그들은 일반적으로 재생에 영향을 줄 수있는 주변 조직의 손상을 유도합니다.
또 다른 접근법은 화학적으로14 또는 유전자 조작에 의해 세포 손상을 유도하는 것이다15. 후자는 고도로 표적화 된 피해를 허용합니다. 그러나 이러한 기술은 실험을 수행하기 전에 새로운 트랜스제닉 물고기를 생성하기 위해 오랜 준비 작업이 필요하며 고유 한 세포 유형이 타겟팅 될 때마다 갱신됩니다.
따라서, 재생에 있어서의 다양한 연구에 적합한 표적화되지만 다재다능한 병변을 허용하는 방법에 대한 필요성이 존재한다. 해결책은 레이저를 사용하여 관심있는 조직에서 국소 손상을 유도하는 것입니다.16,17,18,19,20. 실제로, 레이저-유도된 조직 손상의 사용은 많은 이점을 갖는 척수 병변을 생성하기 위한 강력한 접근법을 제시한다. 이러한 레이저 조작 모듈이 장착 된 현미경을 사용하면 세포 절제가 발생할 맞춤형 모양의 영역을 지정할 수 있으며 시간적 제어의 추가 이점이 있습니다. 따라서 병변의 크기와 위치는 모든 질문을 해결하기 위해 적응 될 수 있습니다.
대부분의 레이저 병변 시스템의 누락 된 특징은 일련의 유충에 대해 재현성이 높은 방식으로 부상을 유발할 수있는 가능성입니다. 여기서 원래의 프로토콜은 UV 레이저를 사용하여 자동화 된 유충 취급을 위해 설계된 미세 유체 플랫폼을 기반으로 제브라 피쉬 유충에서 반자동화된 정밀하고 통제 된 병변을 유도하기 위해 설명됩니다21. 또한, 여기에 제시된 시스템에서 유충은 유리 모세관에 삽입되어 로스트로 코달 축 주위의 동물의 자유로운 회전을 허용합니다. 사용자는 유충의 어느 쪽이 레이저에 제시할지 선택할 수 있으며 형광 이미징이 레이저 빔을 정확하게 타겟팅하고 병변 후 손상을 평가할 수 있습니다.
여기에 설명 된 프로토콜은 UV 레이저 (이하 VAST 시스템으로 지정됨)가 장착 된 회전 디스크와 결합 된 반자동 제브라 피쉬 유충 이미징 시스템과 함께 사용됩니다. 그러나, 프로토콜의 주요 요점 및 기술의 대부분의 청구항은 이광자 레이저 스캐닝 현미경, UV 레이저(FRAP 모듈)와 함께 제공되는 방사-디스크 현미경, 또는 사진 조작을 위한 레이저 모듈을 갖는 비디오 현미경을 포함하는 세포 절제가 가능한 레이저를 장착한 임의의 시스템에 유효하다. VAST 시스템과 기존 샘플 처리의 주요 차이점 중 하나는 후자의 경우 96 웰 플레이트에 적재하는 대신 유리 커버 슬립 / 유리 바닥 페트리 접시에 저융점 아가로스에 유충을 장착해야한다는 것입니다.
이 방법이 제공하는 이점은 재생 과정에서 세포 및 분자 메커니즘에 대한 혁신적인 연구를위한 기회를 열어줍니다. 또한 높은 데이터 품질로 인해 여러 분야의 맥락에서 정량적 조사가 가능합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software Zen Blue 2.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Studio Code</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual AxioCam 506 m CCD cameras</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope LSM880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk module CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopeAxio Examiner D1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser</td>
			<td>Micropoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-It EdU Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin acetylated antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic zebrafish lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mnx1:gfp)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by Katy Reid, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae

Zebrafish 유충은 수정 후 며칠 만에 높은 재생 능력을 가진 완전히 기능적인 중추 신경계 (CNS)를 가지고 있습니다. 이것은이 동물 모델을 척수 손상 및 재생을 연구하는 데 매우 유용합니다. 이러한 병변을 유도하기 위한 표준 프로토콜은 트렁크의 등쪽 부분을 수동으로 횡단하는 것이다. 그러나이 기술은 광범위한 훈련이 필요하며 추가 조직을 손상시킵니다. 레이저로 인한 병변이 이러한 한계를 우회하기 위해 프로토콜이 개발되어 훈련받지 않은 작업자에게도 많은 동물과 다른 세션 사이에 척수 횡단의 높은 재현성과 완전성을 허용했습니다. 또한, 조직 손상은 주로 척수 자체에 국한되어, 다른 조직, 예를 들어, 피부, 근육 및 CNS를 손상시키는 것으로부터 혼란스러운 효과를 감소시킨다. 또한, 척수의 헤미 병변이 가능합니다. 레이저 손상 후 조직 무결성의 향상된 보존은 전기 생리학과 같은 추가 분석에 필요한 추가 해부를 용이하게합니다. 따라서이 방법은 수동으로 달성 할 수없는 부상 정도를 정확하게 제어 할 수 있습니다. 이것은 미래에이 강력한 모델에서 새로운 실험 패러다임을 허용합니다.

척수 횡단 절제술의 유효성 검사 프로토콜이 완전한 척수 횡단을 허용하는지 여부를 평가하기 위해 구조적 및 기능적 조사가 수행되었다.
먼저, 병변 부위에서의 형광 손실이 레이저 조명으로부터 형광 광표백이 아닌 신경 조직 손상에 기인하였음을 확인하기 위해, 아세틸화된 튜불린에 대한 항체를 이용한 면역염색( 표 1 자료 및 보충 파일 ...

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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

본 프로토콜은 유충 취급을 위한 자동화된 미세유체 플랫폼과 결합된 레이저 병변 시스템을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 조직 특이적이고 재현성이 높은 부상을 유도하는 방법을 기술한다.

제브라피쉬 유충의 척수 재생 연구를위한 제어 된 반자동 레이저 유도 부상

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

우리가 여기서 제안하는 기술은 경험이 부족한 작업자의 경우에도 인접한 조직의 손상을 줄이고 재현성을 향상시킴으로써 수동 병변 프로토콜의 한계를 극복 할 수있게합니다. 이 기술을 사용하면 표적 UV 레이저와 결합 된 회전 유리 모세관 덕분에 주변 조직을 손상시키지 않고 병변을 유도 할 위치를 정확하게 선택할 수 있습니다. VAST 장비 작동에는 많은 단계가 관련되어 있으므로 모든 단계가 올바르게 수행되도록하기 위해 모든 단계를 수행하는 것이 좋습니다.마취제를 함유 한 배지를 사용하여 유충을 마취시킨 다음 웰 당 300 마이크로 리터의 배지를 함유 한 96 웰 플레이트로 옮깁니다. 절제용 레이저를 포함한 모든 시스템 구성 요소를 켭니다. 그런 다음 자동화 된 제브라 피쉬 이미징 또는 VAST 소프트웨어를 실행하고 첫 번째 창에서 플레이트를 선택한 다음 완료 버튼을 클릭하십시오.모세관이 비어 있고 깨끗한지 묻는 작은 창이 나타납니다. 모세관 이미지에 내부에 기포가 있는지 확인하십시오. 내부에 기포가 없으면 팝업 창에서 예를 클릭하십시오.다음으로 LP 샘플러 창에서 파일 메뉴로 이동하여 스크립트 열기 옵션을 선택하십시오. 수행할 실험에 해당하는 스크립트가 포함된 파일을 선택합니다. 그런 다음 기본 VAST 소프트웨어 창에서 파일로 이동하여 실험 열기를 선택합니다.계획된 실험에 해당하는 실험 파일을 선택합니다. ImageJ / Fiji 소프트웨어를 실행하고 파일 메뉴로 이동 한 다음 새 스크립트를 선택하여 스크립트 창을 엽니 다. 그런 다음 파일 메뉴로 이동하여 열기를 선택하여 레이저 병변 스크립트를로드하십시오.그런 다음 Python IDE를 시작하려면 파일 메뉴로 이동하여 파일 열기를 선택하여 레이저를 관리하는 스크립트를로드하십시오. 그런 다음 실행 메뉴를 클릭하고 디버깅하지 않고 실행을 선택하여 스크립트를 실행합니다. 레이저 감쇠기가 초기화되는 동안 터미널 패널의 메시지 시퀀스가 일부 노이즈와 함께 나타나는지 확인하십시오.VAST 소프트웨어의 메인 창에서 화살표 버튼을 클릭하여 스테이지를 이동하고 현미경 목표를 기준으로 모세관을 중앙에 맞춥니다. 접안 렌즈를 살펴보고 현미경의 투과 된 빛을 사용하여 모세관 상단에 집중하십시오. 유충이 들어있는 96-웰 플레이트를 LP 샘플러의 왼쪽 플레이트 홀더에 놓습니다.그런 다음 수집을 위해 다른 플레이트를 샘플러의 오른쪽 플레이트 홀더에 놓습니다. 플레이트의 A1 웰이 홀더의 왼쪽 앞쪽 모서리에 있는지 확인하십시오. VAST 소프트웨어의 LP 샘플러 창에서 플레이트 템플릿 버튼을 클릭하고 애벌레가 들어있는 모든 웰을 선택하십시오.확인 버튼을 클릭하여 창의 유효성을 검사하고 닫습니다. 그런 다음 LP 샘플러 창에서 플레이트 실행 버튼을 클릭하여 애벌레 로딩을 시작하십시오. 그런 다음 현미경 소프트웨어로 이동하여 라이브 버튼을 클릭하여 애벌레를 이미지화하십시오.척수 중앙 운하가 보일 때까지 현미경 초점 손잡이를 켭니다. 형광에서 스냅 샷을 찍고 이미지를 폴더에 저장하십시오. ImageJ에서 이미지를 열고 필요한 경우 대비를 조정합니다.관심 영역 선 도구를 클릭하고 척수 중앙에 짧은 선을 그립니다. 현미경을 100% 반사 거울 위치로 전환합니다. ImageJ 스크립트를 로드하고 반복을 2로, 샘플을 1로, 너비를 40미크론으로, 감쇠를 89로 설정합니다.모든 매개 변수를 설정 한 후 OK 버튼을 클릭하십시오. 레이저 촬영 시퀀스가 완료되면 이미징 소프트웨어에서 형광 이미징으로 전환하고 초점을 조정합니다. 새 스냅숏을 만들어 저장합니다.ImageJ에서이 새 이미지를 열고 척수 자체보다 큰 새 선을 그립니다. 현미경을 100% 반사 거울 위치로 전환합니다. ImageJ 스크립트 창으로 이동하여 반복을 2로, 샘플을 1로, 너비를 40미크론으로, 감쇠를 89로 설정합니다.모든 매개 변수를 설정 한 후 OK 버튼을 클릭하십시오. 레이저 샷 시퀀스가 끝나면 형광을 이미징하고 초점을 맞추어 트랜섹션 품질을 검증하십시오. 병변 부위에 세포나 축삭이 손상되지 않았는지 확인하십시오.주요 VAST 소프트웨어 창으로 이동하여 수집 버튼을 클릭하여 병변 유충을 빈 96 웰 플레이트에 수집하십시오. 그런 다음 확인란 트레이 표시등을 클릭하여 VAST 시스템 표시등을 다시 켭니다. 가능한 한 빨리 96 웰 플레이트에서 유충을 꺼내어 유충이 병변 후 회복 할 수 있도록 신선한 생선 물이 담긴 깨끗한 페트리 접시로 옮깁니다.페트리 접시를 섭씨 28도의 인큐베이터에 넣으십시오. 아세틸화 튜불린 면역 염색 및 칼슘 이미징은 레이저 병변이 척추 조직의 연속성을 완전히 방해한다는 것을 나타냅니다. 이 이미지에는 손상되지 않은 척수가 표시됩니다.병변의 caudal 및 rostral 측면 사이의 축삭의 완전한 붕괴는 척수의 완전한 횡단을 확인합니다. 불완전한 횡단의 예가 여기에 나와 있습니다. NBTG cAMP 6-S 유충의 횡단 척수가이 이미지에 표시됩니다.사각형은 병변의 rostral 및 caudal 측에서 형광 강도를 정량화하는 데 사용되는 ROI를 보여줍니다. 그래픽 이미지는 로스트랄 및 인과적 분석 ROI에서 시간에 따른 형광 강도 변화를 나타냅니다. NBT:dsRed 유충의 최대 강도 프로젝션 형광 이미지, 레이저 병변의 세 시간, 24시간 및 48시간 후의 레이저 병변이 여기에 도시되어 있다.부상 후 24 시간 후, 상처가 닫히기 시작하여 48 시간 후에 척수의 초기 구조가 부분적으로 회복되었습니다. 부분적인 기능적 재연결은 칼슘 이미징을 사용하여 손상 후 48시간 후에 확인되었다. 인과 부위의 스파이크 진폭과 로스트랄 영역 사이의 비율은 부상 후 3, 24 및 48 시간 사이에 증가한 것으로 나타났습니다.대식세포 모집은 NBT:dsRed mpeg1 GFP 유충 레이저 병변을 사용하여 레이저 병변 후에 관찰되었다. 수동 병변과 레이저 병변 사이의 표지된 세포의 수에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 병변이없는 물고기는 두 병변 조건에서 병변 된 물고기보다 이중 표지 된 세포가 적습니다.레이저 병변은 수동 병변보다 근육과 피부 손상을 덜 유도합니다. 병변이 완전한지 여부를 확인하는 것이 중요합니다. 손상되지 않은 세포나 구조는 병변 부위에 보이지 않아야하며 희미한 배경 만 볼 수 있어야합니다.척수 재생을 연구하기 위해, 우리는 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징을 포함한 많은 방법을 사용합니다. 중요하게도, 우리는 또한 조직이 수동으로 병변 한 동물과는 달리 해부를 견딜 수 있기 때문에 전기 생리학을 할 수 있습니다. 이 새로운 기술을 통해 우리는 재현 가능하고 통제 된 병변을 허용함으로써 손상 후 척수의 구조적 및 기능적 조직 조직을 정량적으로 연구 할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

쥐의 척수를 다친 후에 급성 및 만성 촉각 감각 테스트

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

연구

의학

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

치료의 척추 배달을위한 수술 기법 : 괴팅겐 Minipigs의 절차의 데모

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

마우스의 제어 자궁 경부 열상 상해

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

쥐에 심각한 척수 손상의 타박상 모델

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

Contusive 척수 손상의 제조 소설 척추 안정화 방법

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

실험자가 면역 뇌척수염 성인 마우스에 유리 척수 Windows를 이식

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

외상성 뇌 손상에 대한 제어 피질 충격 모델

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

무선 원격 측정 시스템은 척수 절개 및 배아 신경 세포 이식 줄기와 흰쥐의 심장 혈관 기능을 모니터링 할 수

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

척수 압축 부상의 보정 집게 모델

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

실험 척수 부상에서 척수 혈액 흐름의 평가를위한 향상된 초음파 이미징 대비

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...