Name: controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Denne studien ble støttet av BBSRC (BB/S0001778/1). CR er finansiert av Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Vi takker David Greenald (CRH, University of Edinburgh) og Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) for den slags gave av transgen fisk (Se Supplementary File). Vi takker Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) for den vennlige tilgangen til 3i spinning-disk confocal.

Alle dyrestudier ble utført med godkjenning fra DET britiske hjemmekontoret og i henhold til regelverket, under prosjektlisens PP8160052. Prosjektet ble godkjent av University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee. For eksperimentelle analyser, sebrafisk larver opp til 5-dagers gammel av begge kjønn ble brukt av følgende tilgjengelige transgene linjer: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), T (betaactin:utrophin-mCherry), Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s) og Tg(mnx1:gfp) (se Tilleggsfil 1</str...

<ol>
	<li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration.">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li><li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish.">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li><li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals.">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li><li>Schl&#252;&#223;ler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging.">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li><li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord.">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li><li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury.">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li><li>. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: <a target="_blank" href="https://nc3rs.org.uk">https://nc3rs.org.uk</a> (2021)</li><li>Hui, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+wide+expression+profiling+during+spinal+cord+regeneration+identifies+comprehensive+cellular+responses+in+Zebrafish.">Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).</li><li>Vasudevan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+interneurons+integrate+into+locomotor+circuitry+following+spinal+cord+injury.">Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).</li><li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li><li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li><li>Briona, L. K., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+transection+in+the+larval+Zebrafish.">Spinal cord transection in the larval Zebrafish.</a> Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+regeneration+in+adult+Zebrafish+by+gentamicin+induced+injury.">Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).</li><li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li><li>Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mitochondrial+transport+in+single-axon+regeneration+of+zebrafish+mauthner+cells.">In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).</li><li>Nichols, E. L., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+sensory+root+via+axonal+invasion.">Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion.</a> Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).</li><li>Ellstr&#246;m, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+zebrafish+induced+by+near-infrared+femtosecond+laser+pulses.">Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).</li><li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion.">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li><li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination.">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+Zebrafish.">Stages of embryonic development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>. AndOr Micropoint Manual Available from: <a target="_blank" href="https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual">https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual</a> (2021)</li><li>Knafo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neurons+control+the+timing+of+spinal+microcircuit+selection+during+locomotion.">Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion.</a> eLife. 6, 25260 (2017).</li><li>Tsarouchas, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1&#946;+and+Tnf-&#945;+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration.">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1&#946; and Tnf-&#945; by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).</li><li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+voltage-gated+Na++and+K++currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li><li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+long-term,+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish.">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish.">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li></ol>

Det er et presserende behov for en dypere forståelse av prosessene som spilles under regenerering i sebrafisk. Denne dyremodellen gir mange fordeler for biomedisinsk forskning, spesielt for ryggmargsskader1. De fleste studiene involverer manuelle lesjoner som krever en godt trent operatør og induserer multivevsskader. En laserlesjonsprotokoll presenteres her, slik at kontroll over lesjonsegenskapene og redusert skade på det omkringliggende vevet. Videre er denne teknikken lett nok til å kunne ...

I motsetning til pattedyr kan sebrafisk (Danio rerio) reparere sentralnervesystemet (CNS) etter skade1. Bruken av sebrafisk larver som modell for ryggmargsregenerering er relativt nylig. Det har vist seg verdifullt å undersøke de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn for reparasjon2. Dette skyldes enkel manipulering, den korte eksperimentelle syklusen (nye larver hver uke), vevets optiske gjennomsiktighet og larvenes lille størrelse, ideelt egnet for in vivo fluorescensmikroskopi.
Ved regenerering av ryggmargen er to ekstra fordeler ved å bruke larver hastigheten på utvinning, noen dager sammenlignet med noen uker for voksne, og den enkle å indusere skader ved hjelp av manuelle teknikker. Dette har blitt brukt i mange studier3,4,5, inkludert nyere undersøkelser6,7. Totalt sett fører dette til økt meningsfull dataproduksjon, høy tilpasningsevne av eksperimentelle protokoller og reduserte eksperimentelle kostnader. Bruken av larver yngre enn 5 dager etter befruktning reduserer også bruken av dyr etter 3R-prinsippene i dyreforskning8.
Etter en ryggmargsskade i sebrafisk larver, forekommer mange biologiske prosesser, inkludert inflammatorisk respons, celleproliferasjon, nevrogenese, migrasjon av overlevende eller nylig genererte celler, reformasjon av funksjonelle aksoner og en global ombygging av nevrale prosesser kretser og ryggvev6,7,9,10 . For å lykkes orkestrert, innebærer disse prosessene en finregulert interaksjon mellom en rekke celletyper, ekstracellulære matrisekomponenter og biokjemiske signaler11,12. Unraveling detaljene i denne betydelige omorganiseringen av et komplekst vev som ryggmargen krever bruk og utvikling av presise og kontrollerte eksperimentelle tilnærminger.
Det primære eksperimentelle paradigmet som brukes til å studere ryggmargsregenerering i sebrafisk er å bruke kirurgiske midler for å indusere vevsskader ved reseksjon, stabbing eller kryoinjury3,13. Disse tilnærmingene har ulempen med å kreve spesifikk opplæring i mikrokirurgiferdigheter, noe som er tidkrevende for enhver ny operatør og kan forhindre bruk i kortsiktige prosjekter. Videre fremkaller de vanligvis skade på det omkringliggende vevet, noe som kan påvirke regenerering.
En annen tilnærming er å indusere celleskade kjemisk14 eller ved genetiske manipulasjoner15. Sistnevnte gir svært målrettet skade. En slik teknikk krever imidlertid langt forberedende arbeid for å generere ny transgen fisk før du gjør noe eksperiment, fornyet hver gang en unik celletype er målrettet.
Det er dermed behovet for en metode som tillater målrettede, men allsidige lesjoner som passer til en rekke studier i regenerering. En løsning er å bruke en laser for å indusere lokalisert skade i vev av interesse16,17,18,19,20. Faktisk presenterer bruken av laserindusert vevsskade en robust tilnærming for å generere ryggmargslesjoner med mange fordeler. Mikroskopene utstyrt med slike lasermanipuleringsmoduler gjør det mulig å spesifisere et tilpasset formet område der celleablasjon vil oppstå, med den ekstra fordelen av temporal kontroll. Lesjonens størrelse og posisjon kan dermed tilpasses for å ta opp eventuelle spørsmål.
Den manglende egenskapen til de fleste laserlesjonssystemer er muligheten til å indusere skader på en svært reproduserbar måte for en rekke larver. Her beskrives en original protokoll ved hjelp av en UV-laser for å indusere halvautomatiske presise og kontrollerte lesjoner i sebrafisklarver basert på en mikrofluidisk plattform designet for automatisert larvehåndtering21. Videre, i systemet som presenteres her, settes larver inn i en glasskapillær, noe som tillater fri rotasjon av dyret rundt rostrocaudalaksen. Brukeren kan velge hvilken side av larven som skal presenteres for laseren, samtidig som fluorescensavbildningen kan målrette laserstrålen nøyaktig og vurdere skaden etter lesjonen.
Protokollen beskrevet her brukes med et halvautomatisk sebrafisk larver bildebehandlingssystem kombinert med en spinnende disk utstyrt med en UV-laser (utpekt heretter som VAST-systemet). Imidlertid er hovedpunktene i protokollen og de fleste påstandene om teknikken gyldige for ethvert system utstyrt med en laser som er i stand til celleablasjon, inkludert to-foton laserskanningsmikroskoper, spinneskivemikroskoper utstyrt med en UV-laser (FRAP-modul) eller videomikroskoper med en lasermodul for fotomanipulering. En av de viktigste forskjellene mellom VAST-systemet og konvensjonell prøvehåndtering vil være at for sistnevnte vil monteringslarver i lavsmeltende punkt agarose på glassdeksler / glassbunn Petri-retter i stedet for å laste dem i en 96-brønns tallerken være nødvendig.
Fordelene ved denne metoden åpner muligheter for innovativ forskning på cellulære og molekylære mekanismer under regenereringsprosessen. Videre åpner den høye datakvaliteten for kvantitative undersøkelser i en tverrfaglig sammenheng.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software Zen Blue 2.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Studio Code</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual AxioCam 506 m CCD cameras</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope LSM880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk module CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopeAxio Examiner D1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser</td>
			<td>Micropoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-It EdU Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin acetylated antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic zebrafish lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mnx1:gfp)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by Katy Reid, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae

Sebrafisk larver har et fullt funksjonelt sentralnervesystem (CNS) med høy regenerativ kapasitet bare noen få dager etter befruktning. Dette gjør denne dyremodellen veldig nyttig for å studere ryggmargsskade og regenerering. Standardprotokollen for å indusere slike lesjoner er å transektere den dorsale delen av stammen manuelt. Denne teknikken krever imidlertid omfattende trening og skader ekstra vev. En protokoll ble utviklet for laserinduserte lesjoner for å omgå disse begrensningene, noe som muliggjør høy reproduserbarhet og fullstendig ryggmargstranseksjon over mange dyr og mellom forskjellige økter, selv for en utrent operatør. Videre er vevsskade hovedsakelig begrenset til selve ryggmargen, noe som reduserer forvirrende effekter fra å skade forskjellige vev, for eksempel hud, muskler og CNS. Videre er hemi-lesjoner i ryggmargen mulig. Forbedret bevaring av vevsintegritet etter laserskade letter ytterligere disseksjoner som trengs for ytterligere analyser, for eksempel elektrofysiologi. Derfor gir denne metoden presis kontroll over skadeutbredelsen som ikke kan oppnås manuelt. Dette gir mulighet for nye eksperimentelle paradigmer i denne kraftige modellen i fremtiden.

Validering av ryggmargstranseksjon Strukturelle og funksjonelle undersøkelser ble utført for å vurdere om protokollen tillater en fullstendig ryggmargstranseksjon.
For det første, for å bekrefte at tapet i fluorescens på lesjonsstedet skyldtes nevronal vevsskade og ikke fluorescens fotobleking fra laserbelysningen, ble det utført immunostaining ved hjelp av et antistoff mot acetylert tubulin (se Tabell over materialer og tilleggsfil 1</strong...

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Den nåværende protokollen beskriver en metode for å indusere vevsspesifikke og svært reproduserbare skader i sebrafisk larver ved hjelp av et laserlesjonssystem kombinert med en automatisert mikrofluidisk plattform for larvehåndtering.

Kontrollerte halvautomatiske laserinduserte skader for å studere ryggmargsregenerering i sebrafisk larver

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

Teknikken vi foreslår her lar oss overvinne begrensningene i manuelle lesjonsprotokoller ved å redusere skade på tilstøtende vev og forbedre reproduserbarheten, selv for uerfarne operatører. Denne teknikken lar oss velge nøyaktig hvor vi skal indusere lesjonen uten å skade omkringliggende vev takket være roterende glasskapillær kombinert med en målrettet UV-laser. Mange trinn er involvert i å betjene VAST-utstyret, så jeg vil anbefale å krysse av hvert trinn mens du går for å sikre at alt gjøres riktig.Begynn med å bedøve larver ved hjelp av mediet som inneholder bedøvelsen, og overfør dem deretter til en 96-brønns plate som inneholder 300 mikroliter medium per brønn. Slå på alle systemkomponentene, inkludert laseren for ablasjon. Start deretter den automatiserte sebrafiskavbildningen, eller VAST-programvaren, velg Plate i det første vinduet, og klikk på Ferdig-knappen.Et lite vindu dukker opp og spør om kapillæren er tom og ren. Kontroller bildet av kapillæren for eventuelle luftbobler inni. Hvis det ikke er noen luftbobler inne, klikker du på Ja i popup-vinduet.Neste i LP Sampler-vinduet, gå til Fil-menyen og velg Åpne skript alternativet. Velg en fil som inneholder skriptet som tilsvarer eksperimentet som skal utføres. Deretter går du til Fil i hovedvinduet for VAST-programvaren og velger Åpne eksperiment.Velg eksperimentfilen som tilsvarer det planlagte eksperimentet. Start ImageJ/Fiji-programvaren, gå til Fil-menyen, og velg Nytt skript for å åpne skriptvinduet. Gå deretter til Fil-menyen og velg Åpne for å laste laserlesjonsskriptet.Deretter, for å starte Python IDE, gå til Fil-menyen og velg Åpne fil for å laste skriptet for å administrere laseren. Klikk deretter Kjør -menyen og velg Kjør uten feilsøking for å kjøre skriptet. Kontroller at en sekvens med meldinger i terminalpanelet vises sammen med noe støy mens laserdemperen initialiseres.I hovedvinduet til VAST-programvaren klikker du på pilknappene for å flytte scenen og midtstille kapillæren i forhold til mikroskopmålet. Se gjennom okularene og fokuser på toppen av kapillæren ved hjelp av mikroskopets overførte lys. Plasser en 96-brønnsplate som inneholder larver på venstre plateholder på LP-prøven.Plasser deretter en annen plate for oppsamling på høyre plateholder på prøvetakeren. Pass på at A1-brønnen på platen er i det fremer venstre hjørnet av holderen. I LP Sampler-vinduet til VAST-programvaren klikker du på Platemal-knappen og velger alle brønnene som inneholder larver.Klikk på OK-knappen for å validere og lukke vinduet. Klikk deretter på Kjør plate-knappen i LP Sampler-vinduet for å begynne å laste larven. Deretter går du til mikroskopprogramvaren og klikker på Live-knappen for å avbilde larven.Slå på mikroskopets fokusknapp til ryggmargens sentrale kanal er synlig. Ta et øyeblikksbilde i fluorescens og lagre bildet i en mappe. Åpne bildet i ImageJ og juster kontrasten om nødvendig.Klikk på det interesseområdelinjeverktøyet og tegn en kort linje sentrert på ryggmargen. Bytt mikroskopet til 100 % reflekterende speilposisjon. Last inn ImageJ-skriptet og sett Repetisjon til 2, Eksempel til 1, Bredde til 40 mikron og Demping til 89.Etter å ha satt alle parametrene, klikker du på OK-knappen. Når laserbildesekvensen er ferdig, bytter du til fluorescensavbildning på bildebehandlingsprogramvaren og justerer fokuset. Ta et nytt øyeblikksbilde og lagre det.Åpne dette nye bildet i ImageJ og tegn en ny linje som er større enn selve ryggmargen. Bytt mikroskopet til 100 % reflekterende speilposisjon. Gå til ImageJ-skriptvinduet og sett Repetisjon til 2, Eksempel til 1, Bredde til 40 mikron og Demping til 89.Etter å ha satt alle parametrene, klikker du på OK-knappen. Når laserbildesekvensen er ferdig, må du kontrollere transeksjonskvaliteten ved å avbilde fluorescens og fokusering. Kontroller at ingen celler eller aksoner forblir intakte på lesjonsstedet.Gå til det viktigste VAST-programvarevinduet og klikk på Samle-knappen for å samle de lesjonerte larver i den tomme 96-brønnsplaten. Klikk deretter på avmerkingsboksens skufflys for å slå på VAST-systemlyset igjen. Ta ut larven fra 96-brønnsplaten så snart som mulig, og overfør dem til en ren Petri-tallerken med ferskt fiskevann for larven for å gjenopprette post-lesjon.Legg Petri-parabolen i en inkubator ved 28 grader Celsius. Acetylert tubulin immuno-farging og kalsiumavbildning indikerer at laserlesjon helt forstyrrer kontinuiteten i ryggvevet. En intakt ryggmarg er vist på dette bildet.En fullstendig forstyrrelse av axonene mellom kaudale og rostrale sider av lesjonen bekrefter fullstendig transeksjon av ryggmargen. Et eksempel på ufullstendig transeksjon vises her. Den transekterte ryggmargen på en NBTG cAMP 6-S larve er vist i dette bildet.Rektanglene viser ROIene som brukes til å kvantifisere fluorescensintensiteten i lesjonenes rostrale og kaudale sider. Det grafiske bildet representerer fluorescensintensitetsendringen over tid i ROIene for rostral- og kaudalanalyse. De maksimale intensitetsprojeksjonsfluorescensbildene av en NBT: dsRed larve før laserlesjonen, etter tre timer, 24 timer og 48 timer med laserlesjonen vises her.Etter 24 timer etter skade begynte sårene å lukke seg, noe som førte til en delvis restaurering av ryggmargens opprinnelige struktur etter 48 timer. En delvis funksjonell gjenkobling ble bekreftet etter 48 timer etter skade ved bruk av kalsiumavbildning. Forholdet mellom amplituden til piggene i kaudalområdet og rostralområdet viste en økning mellom 3, 24 og 48 timer etter skade.Makrofagrekruttering ble observert etter laserlesjoner ved hjelp av NBT:dsRed mpeg1 GFP larver laserlesjoner. Det ble ikke observert noen forskjell i antall merkede celler mellom manuelle og laserskader. Unlesioned fisk viste færre dobbeltmerkede celler enn lesjonert fisk under begge lesjonsforholdene.Laser lesjon induserer mindre muskel- og hudskader enn manuell lesjon. Det er viktig å verifisere om lesjonen er fullført eller ikke. Ingen intakt celle eller struktur skal være synlig i lesjonsområdet, bare en svak bakgrunn.For å studere regenerering av ryggmargen bruker vi mange metoder, inkludert immuno-histokjemi og kalsiumavbildning. Viktigst, vi kan også gjøre elektrofysiologi, da vevet tåler disseksjon, i motsetning til manuelt lesjonerte dyr. Denne nye teknikken lar oss kvantitativt studere den strukturelle og funksjonelle vevsorganisasjonen i ryggmargen etter skade ved å tillate reproduserbare og kontrollerte lesjoner.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Akutt og kronisk Taktil Sensory Testing etter ryggmargsskade i Rats

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

Kirurgisk teknikk for Spinal Cord Levering av Therapies: Demonstrasjon av prosedyre i Göttingen minigriser

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Kontrollert Cervical Laserasjon Injury in Mus

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

En Contusion modell av alvorlig ryggmargsskade i rotter

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

A Novel Vertebral Stabilisering metode for å produsere Contusive ryggmargsskade

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Kontrollert Cortical Impact Modell for traumatisk hjerneskade

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

En Radio-telemetrisk system for å overvåke kardiovaskulær funksjon i rotter med ryggmargstran og Embryonic Neural Stem Cell Grafts

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Calibrated pins Modell av ryggmargskompresjon Injury

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Kontrastforsterket ultralyd Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow i Experimental ryggmargsskade

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...