Name: controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Este estudo foi apoiado pelo BBSRC (BB/S0001778/1). A CR é financiada pelo Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Program. Agradecemos a David Greenald (CRH, Universidade de Edimburgo) e Katy Reid (CDBS, Universidade de Edimburgo) pelo tipo de presente de peixe transgênico (Ver Arquivo Suplementar). Agradecemos a Daniel Soong (CRH, Universidade de Edimburgo) pelo tipo de acesso ao 3i spinning-disk confocal.

Todos os estudos em animais foram realizados com aprovação do Ministério do Interior do Reino Unido e de acordo com suas regulamentações, sob licença de projeto PP8160052. O projeto foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Edimburgo. Para análises experimentais, larvas de zebrafish até 5 dias de idade de ambos os sexos foram utilizadas das seguintes linhas transgênicas disponíveis: Tg (Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg (Xla.Tubb:DsRed), Tg (betaactin:utrophin-mCherry),...

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	<li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration.">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li><li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish.">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li><li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals.">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li><li>Schl&#252;&#223;ler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging.">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li><li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord.">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li><li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury.">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li><li>. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1&#946;+and+Tnf-&#945;+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration.">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1&#946; and Tnf-&#945; by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).</li><li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+voltage-gated+Na++and+K++currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li><li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+long-term,+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish.">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish.">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li></ol>

Há uma necessidade urgente de uma compreensão mais profunda dos processos em jogo durante a regeneração em zebrafish. Este modelo animal oferece muitos benefícios para a pesquisa biomédica, em especial para lesões medular1. A maioria dos estudos envolve lesões manuais que requerem um operador bem treinado e induzem danos multi tecidos. Aqui é apresentado um protocolo de lesão a laser, permitindo o controle sobre as características da lesão e danos reduzidos aos tecidos circundantes. Al...

Em contraste com os mamíferos, o zebrafish (Danio rerio) pode reparar seu sistema nervoso central (SNC) após lesões1. O uso de larvas de zebrafish como modelo de regeneração da medula espinhal é relativamente recente. Provou-se valioso para investigar os mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao reparo2. Isso se deve à facilidade de manipulação, ao curto ciclo experimental (novas larvas a cada semana), à transparência óptica dos tecidos e ao pequeno tamanho das larvas, idealmente adequada para microscopia de fluorescência in vivo .
No caso da regeneração da medula espinhal, duas vantagens adicionais do uso de larvas são a velocidade de recuperação, alguns dias em comparação com algumas semanas para adultos, e a facilidade de induzir lesões usando técnicas manuais. Isso tem sido usado com sucesso em muitos estudos3,4,5, incluindo investigações recentes6,7. No geral, isso leva ao aumento da produção significativa de dados, alta adaptabilidade dos protocolos experimentais e diminuição dos custos experimentais. O uso de larvas com menos de 5 dias após a fertilização também reduz o uso de animais seguindo os princípios 3R em pesquisas animais8.
Após uma lesão medular em larvas de zebrafish, muitos processos biológicos ocorrem, incluindo resposta inflamatória, proliferação celular, neurogênese, migração de células sobreviventes ou recém-geradas, reforma de axônios funcionais e uma remodelagem global de circuitos de processos neurais e tecidos da coluna vertebral6,7,9,10 . Para serem orquestrados com sucesso, esses processos envolvem uma interação finamente regulada entre uma gama de tipos de células, componentes de matriz extracelular e sinais bioquímicos11,12. Desvendar os detalhes dessa reorganização significativa de um tecido complexo como a medula espinhal requer o uso e o desenvolvimento de abordagens experimentais precisas e controladas.
O paradigma experimental primário usado para estudar a regeneração da medula espinhal em zebrafish é usar meios cirúrgicos para induzir danos teciduais por ressecção, esfaqueamento ou crio lesão3,13. Essas abordagens têm a desvantagem de exigir treinamento específico em habilidades de microcirurgia, que é demorado para qualquer novo operador e pode impedir seu uso em projetos de curto prazo. Além disso, eles geralmente induzem danos aos tecidos circundantes, o que pode influenciar a regeneração.
Outra abordagem é induzir danos celulares quimicamente14 ou por manipulações genéticas15. Este último permite danos altamente direcionados. No entanto, tal técnica requer um longo trabalho preparatório para gerar novos peixes transgênicos antes de fazer qualquer experimento, renovado cada vez que um tipo de célula única é alvo.
Há, portanto, a necessidade de um método que permita lesões direcionadas, mas versáteis, adequadas a uma variedade de estudos em regeneração. Uma solução é usar um laser para induzir danos localizados no tecido de interesse16,17,18,19,20. De fato, o uso de danos teciduais induzidos por laser apresenta uma abordagem robusta para gerar lesões medular com muitas vantagens. Os microscópios equipados com tais módulos de manipulação a laser permitem especificar uma área em forma personalizada onde ocorrerá a ablação celular, com o benefício extra do controle temporal. O tamanho e a posição da lesão podem ser assim adaptados para responder a quaisquer questões.
A característica que falta na maioria dos sistemas de lesão a laser é a possibilidade de induzir lesões de forma altamente reprodutível para uma série de larvas. Aqui, um protocolo original é descrito usando um laser UV para induzir lesões precisas e controladas semi-automatizadas em larvas de zebrafish baseadas em uma plataforma microfluidica projetada para manuseio automatizado de larvas21. Além disso, no sistema aqui apresentado, as larvas são inseridas em um capilar de vidro, o que permite a livre rotação do animal em torno de seu eixo rostrocaudal. O usuário pode escolher qual lado da larva apresentar ao laser, permitindo que a imagem de fluorescência direja precisamente o raio laser e avalie o dano após a lesão.
O protocolo descrito aqui é usado com um sistema semi-automatizado de imagens de larvas de zebrafish combinado com um disco giratório equipado com um laser UV (designado a partir de agora como o sistema VAST). No entanto, os principais pontos do protocolo e a maioria das alegações da técnica são válidos para qualquer sistema equipado com um laser capaz de ablação celular, incluindo microscópios de varredura a laser de dois fótons, microscópios de disco giratório fornecidos com um laser UV (módulo FRAP), ou microscópios de vídeo com um módulo laser para manipulação de fotos. Uma das principais diferenças entre o sistema VAST e o manuseio convencional da amostra será que, para este último, serão necessárias larvas de montagem em pontos de baixa fusão em tampas de vidro/placas de petri de fundo de vidro no lugar de carregá-las em uma placa de 96 poços.
Os benefícios oferecidos por este método abrem oportunidades para pesquisas inovadoras sobre os mecanismos celulares e moleculares durante o processo de regeneração. Além disso, a alta qualidade dos dados permite investigações quantitativas em um contexto multidisciplinar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software Zen Blue 2.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Studio Code</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual AxioCam 506 m CCD cameras</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope LSM880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk module CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopeAxio Examiner D1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser</td>
			<td>Micropoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-It EdU Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin acetylated antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic zebrafish lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mnx1:gfp)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by Katy Reid, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae

As larvas de zebrafish possuem um sistema nervoso central totalmente funcional (SNC) com alta capacidade regenerativa apenas alguns dias após a fertilização. Isso torna este modelo animal muito útil para estudar lesão medular e regeneração. O protocolo padrão para induzir tais lesões é transectar a parte dorsal do tronco manualmente. No entanto, essa técnica requer treinamento extensivo e danifica tecidos adicionais. Um protocolo foi desenvolvido para lesões induzidas por laser para contornar essas limitações, permitindo alta reprodutibilidade e completude da transeção da medula espinhal sobre muitos animais e entre diferentes sessões, mesmo para um operador não treinado. Além disso, os danos teciduais são limitados principalmente à medula espinhal em si, reduzindo os efeitos de confusão de ferir diferentes tecidos, por exemplo, pele, músculo e CNS. Além disso, são possíveis lesões hemi-lesões da medula espinhal. A melhoria da preservação da integridade tecidual após lesão a laser facilita novas dissecções necessárias para análises adicionais, como a eletrofisiologia. Assim, este método oferece um controle preciso da extensão da lesão que é inalcançável manualmente. Isso permite novos paradigmas experimentais neste modelo poderoso no futuro.

Validação da transeção da medula espinhal Foram realizadas investigações estruturais e funcionais para avaliar se o protocolo permite uma transeção completa da medula espinhal.
Primeiro, verificar se a perda de fluorescência no local da lesão foi devido a danos no tecido neuronal e não à fotoblemação da fluorescência da iluminação laser, foi realizada a imunostenção utilizando um anticorpo contra tubulina acetilada (ver Tabela de Materiais</strong...

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Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

O presente protocolo descreve um método para induzir lesões específicas de tecido e altamente reprodutíveis em larvas de zebrafish usando um sistema de lesão a laser combinado com uma plataforma microfluida automatizada para o manuseio de larvas.

Lesões semi-automatizadas semi-automatizadas controladas por laser para estudar a regeneração da medula espinhal em larvas de zebrafish

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

A técnica que propomos aqui nos permite superar as limitações dos protocolos manuais de lesões, reduzindo os danos aos tecidos adjacentes e melhorando a reprodutibilidade, mesmo para operadores inexperientes. Esta técnica nos permite escolher precisamente onde induzir a lesão sem danificar os tecidos circundantes graças à capilaridade de vidro rotativa combinada com um laser UV direcionado. Muitas etapas estão envolvidas na operação do equipamento VAST, por isso recomendo marcar cada passo que você for, a fim de garantir que tudo seja feito corretamente.Comece anestesiando as larvas usando o meio contendo o anestésico e, em seguida, transfira-as para uma placa de 96 poços contendo 300 microliters de médio por poço. Ligue todos os componentes do sistema, incluindo o laser para ablação. Em seguida, inicie a imagem automatizada de zebrafish, ou software VAST, escolha Placa na primeira janela e clique no botão Done.Uma pequena janela aparecerá perguntando se o capilar está vazio e limpo. Verifique a imagem do capilar para obter bolhas de ar dentro. Se não houver bolhas de ar dentro, clique em Sim na janela estourada.Em seguida, na janela Sampler LP, vá para o menu Arquivo e selecione a opção Abrir script. Escolha um arquivo contendo o script correspondente ao experimento a ser realizado. Em seguida, na janela principal do software VAST, vá para File e escolha o experimento Aberto.Escolha o arquivo de experimento correspondente ao experimento planejado. Inicie o software ImageJ/Fiji, vá para o menu Arquivo e escolha novo script para abrir a janela do script. Em seguida, vá para o menu Arquivo e escolha Abrir para carregar o script de lesão a laser.Em seguida, para lançar o Python IDE, vá para o menu Arquivo e escolha abrir arquivo para carregar o script para gerenciar o laser. Em seguida, clique no menu Executar e escolha Executar sem depuração para executar o script. Certifique-se de que uma sequência de mensagens no painel do terminal apareça junto com algum ruído enquanto o atenuante a laser é inicializado.Na janela principal do software VAST, clique nos botões de seta para mover o palco e centralizar o capilar em relação ao objetivo do microscópio. Olhe através das oculares e foque na parte superior do capilar usando a luz transmitida do microscópio. Coloque uma placa de 96 poços contendo as larvas no porta-placas esquerdas do amostrador LP.Em seguida, coloque outra placa para coleta no suporte da placa direita do sampler. Certifique-se de que o poço A1 da placa está no canto esquerdo dianteiro do suporte. Na janela LP Sampler do software VAST, clique no botão de modelo Placa e selecione todos os poços que contêm larvas.Clique no botão OK para validar e fechar a janela. Em seguida, clique no botão Executar placa na janela Sampler LP para começar a carregar a larva. Em seguida, vá para o software de microscópio e clique no botão Live para imagem da larva.Ligue o botão de foco do microscópio até que o canal central da medula espinhal esteja visível. Tire uma foto em fluorescência e salve a imagem em uma pasta. Abra a imagem no ImageJ e ajuste o contraste, se necessário.Clique na ferramenta de linha região de interesse e desenhe uma linha curta centrada na medula espinhal. Mude o microscópio para uma posição espelhada 100%. Carregue o script ImageJ e defina Repetição para 2, Amostra para 1, Largura para 40 mícrons e Atenuação para 89.Depois de definir todos os parâmetros, clique no botão OK. Quando a sequência de tiro laser estiver terminada, mude para imagens de fluorescência no software de imagem e ajuste o foco. Tire uma nova foto e salve-a.Abra esta nova imagem no ImageJ e desenhe uma nova linha maior que a própria medula espinhal. Mude o microscópio para uma posição espelhada 100%. Vá para a janela de script ImageJ e defina Repetição para 2, Amostra para 1, Largura para 40 mícrons e Atenuação para 89.Depois de definir todos os parâmetros, clique no botão OK. Quando a sequência de tiro a laser estiver concluída, verifique a qualidade da transeção por fluorescência de imagem e foco. Certifique-se de que nenhuma célula ou axônios permaneçam intactos no local da lesão.Vá para a janela principal do software VAST e clique no botão Coletar para coletar as larvas lesionadas na placa vazia de 96 poços. Em seguida, clique na luz da bandeja da caixa de seleção para ligar a luz do sistema VAST. Retire a larva da placa de 96 poços o mais rápido possível, e transfira-as para uma placa de Petri limpa com água de peixe doce para a larva recuperar a pós-lesão.Coloque a placa de Petri em uma incubadora a 28 graus Celsius. A imuno-coloração de tubulina acetilada e a imagem de cálcio indicam que a lesão a laser interrompe completamente a continuidade do tecido espinhal. Uma medula espinhal intacta é mostrada nesta imagem.Uma interrupção completa dos axônios entre os lados caudal e rostral da lesão confirma a transeção completa da medula espinhal. Um exemplo de transeção incompleta é mostrado aqui. A medula espinhal transectada em uma larva NBTG cAMP 6-S é mostrada nesta imagem.Os retângulos mostram os ROIs usados para quantificar a intensidade da fluorescência nos lados rostral e caudal das lesões. A imagem gráfica representa a mudança de intensidade de fluorescência ao longo do tempo nos ROIs de análise rostral e caudal. As imagens de fluorescência de projeção de intensidade máxima de uma larva NBT:dsRed antes da lesão do laser, após três horas, 24 horas e 48 horas da lesão laser são mostradas aqui.Após 24 horas após a lesão, as feridas começaram a se fechar, levando a uma restauração parcial da estrutura inicial da medula espinhal após 48 horas. Uma reconexão funcional parcial foi confirmada após 48 horas após a lesão por meio de imagem de cálcio. A razão entre a amplitude dos picos na área caudal e na área rostral mostrou um aumento entre 3, 24 e 48 horas após a lesão.O recrutamento de macrófagos foi observado após lesões a laser utilizando lesões laser NBT:dsRed mpeg1 GFP. Não foi observada diferença no número de células rotuladas entre lesões manuais e laser. Os peixes não-educulados apresentaram menos células de dupla rotulagem do que os peixes lesados em ambas as condições de lesão.A lesão a laser induz menos dano muscular e de pele do que lesão manual. É fundamental verificar se a lesão está completa ou não. Nenhuma célula ou estrutura intacta deve ser visível na área da lesão, apenas um fundo escuro.Para estudar a regeneração da medula espinhal, usamos muitos métodos, incluindo imuno-histoquímica e imagem de cálcio. É importante ressaltar que também podemos fazer eletrofisiologia, pois o tecido pode suportar a dissecção, ao contrário dos animais com lesões manuais. Esta nova técnica permite estudar quantitativamente a organização estrutural e funcional do tecido na medula espinhal após a lesão, permitindo lesões reprodutíveis e controladas.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Aguda e crônica teste sensorial tátil após a lesão medular em ratos

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Medicina

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

Técnica cirúrgica para entrega da Medula Espinhal de Terapias: Demonstração de Processo em Göttingen porquinhos

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Controlada por laceração do colo do útero em camundongos

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

Um modelo de contusão grave de lesão medular em ratos

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

Um método de estabilização Novel Vertebral para a Produção de contusão Lesão Medular

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Implantação de vidro Medular do Windows em camundongos adultos com Experimental Auto-imune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Controlado Modelo Impact Cortical para lesão cerebral traumática

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

Um sistema de rádio-telemetria para monitorar a função cardiovascular em ratos com Medula Espinhal transecção e Embryonic Stem Neural enxertos de células-

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Calibrado Fórceps Modelo de Lesão Medular Compression

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Contraste melhorado Ecografia de Avaliação da Medula Espinhal fluxo de sangue em Experimental lesão medular

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...