Name: controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Это исследование было поддержано BBSRC (BB/S0001778/1). CR финансируется Программой стипендий Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Program. Мы благодарим Дэвида Гринальда (CRH, Эдинбургский университет) и Кэти Рид (CDBS, Эдинбургский университет) за добрый подарок трансгенной рыбы (см. Дополнительный файл). Мы благодарим Даниэля Сунга (CRH, Эдинбургский университет) за добрый доступ к конфокальному 3i-вращающемуся диску.

Все исследования на животных проводились с одобрения Министерства внутренних дел Великобритании и в соответствии с его правилами, в соответствии с лицензией на проект PP8160052. Проект был одобрен Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Эдинбургского университета...

<ol>
	<li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration.">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li><li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish.">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li><li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals.">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li><li>Schl&#252;&#223;ler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging.">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li><li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord.">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li><li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury.">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li><li>. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: <a target="_blank" href="https://nc3rs.org.uk">https://nc3rs.org.uk</a> (2021)</li><li>Hui, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+wide+expression+profiling+during+spinal+cord+regeneration+identifies+comprehensive+cellular+responses+in+Zebrafish.">Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).</li><li>Vasudevan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+interneurons+integrate+into+locomotor+circuitry+following+spinal+cord+injury.">Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).</li><li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li><li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li><li>Briona, L. K., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+transection+in+the+larval+Zebrafish.">Spinal cord transection in the larval Zebrafish.</a> Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+regeneration+in+adult+Zebrafish+by+gentamicin+induced+injury.">Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).</li><li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li><li>Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mitochondrial+transport+in+single-axon+regeneration+of+zebrafish+mauthner+cells.">In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).</li><li>Nichols, E. L., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+sensory+root+via+axonal+invasion.">Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion.</a> Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).</li><li>Ellstr&#246;m, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+zebrafish+induced+by+near-infrared+femtosecond+laser+pulses.">Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).</li><li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion.">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li><li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination.">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+Zebrafish.">Stages of embryonic development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>. AndOr Micropoint Manual Available from: <a target="_blank" href="https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual">https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual</a> (2021)</li><li>Knafo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neurons+control+the+timing+of+spinal+microcircuit+selection+during+locomotion.">Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion.</a> eLife. 6, 25260 (2017).</li><li>Tsarouchas, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1&#946;+and+Tnf-&#945;+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration.">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1&#946; and Tnf-&#945; by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).</li><li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+voltage-gated+Na++and+K++currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li><li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+long-term,+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish.">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish.">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li></ol>

Существует острая необходимость в более глубоком понимании процессов, происходящих во время регенерации у рыбок данио. Эта модель на животных предлагает много преимуществ для биомедицинских исследований, в частности для травм спинного мозга1. Большинство исследований вк...

В отличие от млекопитающих, рыбки данио (Danio rerio) могут восстанавливать свою центральную нервную систему (ЦНС) после травмы1. Использование личинок рыбок данио в качестве модели регенерации спинного мозга относительно недавно. Оказалось полезным исследовать клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе репарации2. Это связано с простотой манипуляций, коротким экспериментальным циклом (новые личинки каждую неделю), оптической прозрачностью тканей и небольшим размером личинок, идеально подходящим для флуоресцентной микроскопии in vivo.
В случае регенерации спинного мозга двумя дополнительными преимуществами использования личинок являются скорость восстановления, несколько дней по сравнению с несколькими неделями для взрослых, и легкость индуцирования травм с использованием мануальных методов. Это было успешно использовано во многих исследованиях3,4,5, включая недавние исследования6,7. В целом, это приводит к увеличению значимого производства данных, высокой адаптивности экспериментальных протоколов и снижению экспериментальных затрат. Использование личинок моложе 5 дней после оплодотворения также снижает использование животных в соответствии с принципами 3R в исследованиях на животных8.
После травмы спинного мозга у личинок рыбок данио происходят многие биологические процессы, включая воспалительную реакцию, пролиферацию клеток, нейрогенез, миграцию выживших или вновь генерируемых клеток, реформирование функциональных аксонов и глобальное ремоделирование цепей нервных процессов и тканей позвоночника6,7,9,10 . Чтобы быть успешно организованными, эти процессы включают в себя тонко регулируемое взаимодействие между рядом типов клеток, компонентов внеклеточного матрикса и биохимических сигналов11,12. Разгадка деталей этой значительной реорганизации сложной ткани, такой как спинной мозг, требует использования и разработки точных и контролируемых экспериментальных подходов.
Основная экспериментальная парадигма, используемая для изучения регенерации спинного мозга у рыбок данио, заключается в использовании хирургических средств для индуцирования повреждения тканей путем резекции, колющего ранения или криоправмы3,13. Эти подходы имеют тот недостаток, что требуют специальной подготовки по навыкам микрохирургии, что отнимает много времени у любого нового оператора и может препятствовать их использованию в краткосрочных проектах. Кроме того, они обычно вызывают повреждение окружающих тканей, что может повлиять на регенерацию.
Другой подход заключается в том, чтобы вызвать повреждение клеток химическим путем14 или с помощью генетических манипуляций15. Последнее позволяет наносить целенаправленный урон. Однако такой метод требует длительной подготовительной работы по получению новой трансгенной рыбы перед проведением любого эксперимента, обновляемого каждый раз, когда нацеливается уникальный тип клеток.
Таким образом, существует необходимость в методе, позволяющем проводить целенаправленные, но универсальные поражения, подходящие для различных исследований в области регенерации. Решение состоит в том, чтобы использовать лазер для индуцирования локализованного повреждения в интересующей ткани16,17,18,19,20. Действительно, использование лазерно-индуцированного повреждения тканей представляет собой надежный подход к созданию поражений спинного мозга со многими преимуществами. Микроскопы, оснащенные такими модулями лазерной манипуляции, позволяют указать область индивидуальной формы, где будет происходить абляция клеток, с дополнительным преимуществом временного контроля. Таким образом, размер и положение поражения могут быть адаптированы для решения любых вопросов.
Недостающей особенностью большинства лазерных систем поражения является возможность вызывать травмы высоко воспроизводимым способом для серии личинок. Здесь описан оригинальный протокол с использованием УФ-лазера для индуцирования полуавтоматических точных и контролируемых поражений у личинок рыбок данио на основе микрофлюидной платформы, предназначенной для автоматизированной обработки личинок21. Более того, в представленной здесь системе личинки вставляются в стеклянный капилляр, что позволяет свободно вращаться животному вокруг его рострокодальной оси. Пользователь может выбрать, какую сторону личинки представить лазеру, позволяя флуоресцентной визуализации точно нацеливаться на лазерный луч и оценивать повреждение после поражения.
Протокол, описанный здесь, используется с полуавтоматизированной системой визуализации личинок рыбок данио в сочетании со вращающимся диском, оснащенным ультрафиолетовым лазером (далее обозначенным как система VAST). Однако основные пункты протокола и большинство пунктов формулы техники справедливы для любой системы, оснащенной лазером, способным к абляции клеток, включая двухфотонные лазерные сканирующие микроскопы, вращающиеся дисковые микроскопы, снабженные УФ-лазером (модуль FRAP), или видеомикроскопы с лазерным модулем для фотоманипуляции. Одно из основных различий между системой VAST и обычной обработкой проб будет заключаться в том, что для последней потребуется установка личинок в агарозе с низкой температурой плавления на стеклянных крышках / чашках Петри со стеклянным дном вместо их загрузки в 96-луночную пластину.
Преимущества, предлагаемые этим методом, открывают возможности для инновационных исследований клеточных и молекулярных механизмов в процессе регенерации. Кроме того, высокое качество данных позволяет проводить количественные исследования в междисциплинарном контексте.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software Zen Blue 2.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Studio Code</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual AxioCam 506 m CCD cameras</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope LSM880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk module CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopeAxio Examiner D1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser</td>
			<td>Micropoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-It EdU Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin acetylated antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic zebrafish lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mnx1:gfp)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by Katy Reid, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae

Личинки рыбок данио обладают полностью функциональной центральной нервной системой (ЦНС) с высокой регенеративной способностью всего через несколько дней после оплодотворения. Это делает эту животную модель очень полезной для изучения травм и регенерации спинного мозга. Стандартным протоколом индуцирования таких поражений является трансекция дорсальной части ствола вручную. Однако эта методика требует обширной подготовки и повреждает дополнительные ткани. Был разработан протокол для лазерно-индуцированных поражений, чтобы обойти эти ограничения, что обеспечивает высокую воспроизводимость и полноту трансекции спинного мозга у многих животных и между различными сеансами, даже для неподготовленного оператора. Кроме того, повреждение тканей в основном ограничивается самим спинным мозгом, уменьшая смешанные эффекты от повреждения различных тканей, например, кожи, мышц и ЦНС. Кроме того, возможны геми-поражения спинного мозга. Улучшенное сохранение целостности тканей после лазерного повреждения облегчает дальнейшие вскрытия, необходимые для дополнительных анализов, таких как электрофизиология. Следовательно, этот метод предлагает точный контроль степени травмы, которая недостижима вручную. Это позволяет создавать новые экспериментальные парадигмы в этой мощной модели в будущем.

Валидация трансекции спинного мозга Структурные и функциональные исследования были проведены, чтобы оценить, допускает ли протокол полную трансекцию спинного мозга.
Во-первых, чтобы убедиться, что потеря флуоресценции в месте поражения была вызвана поврежде...

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Настоящий протокол описывает способ индуцирования тканеспецифических и высоковоспроизводимых повреждений у личинок рыбок данио с использованием лазерной системы поражения в сочетании с автоматизированной микрофлюидной платформой для обработки личинок.

Контролируемые полуавтоматизированные лазерно-индуцированные повреждения для изучения регенерации спинного мозга у личинок рыбок данио

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

Методика, которую мы предлагаем здесь, позволяет преодолеть ограничения протоколов ручных поражений за счет уменьшения повреждения соседних тканей и улучшения воспроизводимости даже для неопытных операторов. Эта методика позволяет нам точно выбирать, где индуцировать поражение, не повреждая окружающие ткани благодаря вращающемуся стеклянному капилляру в сочетании с целевым УФ-лазером. В эксплуатации оборудования VAST задействовано много шагов, поэтому я бы рекомендовал отмечать каждый шаг по ходу дела, чтобы убедиться, что все сделано правильно.Начните с обезболивания личинок с использованием среды, содержащей анестетик, а затем перенесите их на 96-луночную пластину, содержащую 300 микролитров среды на лунку. Включите все компоненты системы, включая лазер для абляции. Затем запустите автоматизированную визуализацию рыбок данио или программное обеспечение VAST, выберите «Тарелка» в первом окне и нажмите кнопку «Готово».Появится небольшое окошко, спрашивающее, пуст ли капилляр и чист. Проверьте изображение капилляра на наличие пузырьков воздуха внутри. Если внутри нет пузырьков воздуха, нажмите «Да» на появившемся окне.Затем в окне LP Sampler перейдите в меню Файл и выберите опцию Открыть скрипт. Выберите файл, содержащий сценарий, соответствующий выполняемому эксперименту. Затем в главном окне программного обеспечения VAST перейдите в Файл и выберите Открыть эксперимент.Выберите файл эксперимента, соответствующий запланированному эксперименту. Запустите программное обеспечение ImageJ/Fiji, перейдите в меню Файл и выберите Новый скрипт, чтобы открыть окно скрипта. Затем перейдите в меню Файл и выберите Открыть, чтобы загрузить сценарий лазерного поражения.Затем, чтобы запустить среду разработки Python, перейдите в меню Файл и выберите Открыть файл, чтобы загрузить сценарий для управления лазером. Затем щелкните меню Выполнить и выберите «Выполнить без отладки», чтобы запустить сценарий. Убедитесь, что последовательность сообщений на панели терминала отображается вместе с некоторым шумом во время инициализации лазерного аттенюатора.В главном окне программного обеспечения VAST нажмите на кнопки со стрелками, чтобы переместить сцену и центрировать капилляр относительно объектива микроскопа. Посмотрите через окуляры и сосредоточьтесь на верхней части капилляра, используя проходящий свет микроскопа. Поместите 96-луночную пластину, содержащую личинки, на левый держатель пластины пробоотборника LP.Затем поместите еще одну пластину для сбора на правый держатель пластины пробоотборника. Убедитесь, что колодец формата А1 пластины находится в переднем левом углу держателя. В окне LP Sampler программного обеспечения VAST нажмите на кнопку шаблона Plate и выберите все скважины, содержащие личинки.Нажмите кнопку OK, чтобы проверить и закрыть окно. Затем нажмите кнопку Run plate в окне LP Sampler, чтобы начать загрузку личинки. Затем перейдите к программному обеспечению микроскопа и нажмите кнопку Live, чтобы визуализировать личинку.Включите ручку фокусировки микроскопа до тех пор, пока не будет виден центральный канал спинного мозга. Сделайте снимок во флуоресценции и сохраните изображение в папку. Откройте изображение в ImageJ и при необходимости отрегулируйте контрастность.Нажмите на инструмент «Линия области интереса» и нарисуйте короткую линию, центрированную на спинном мозге. Переключите микроскоп в 100% отражающее зеркальное положение. Загрузите сценарий ImageJ и установите для параметра «Повторение» значение 2, «Образец» — 1, «Ширина» — 40 микрон и значение «Затухание» — значение 89.После установки всех параметров нажмите на кнопку OK. Когда последовательность лазерного снимка будет завершена, переключитесь на флуоресцентную визуализацию в программном обеспечении для визуализации и отрегулируйте фокус. Сделайте новый снимок и сохраните его.Откройте это новое изображение в ImageJ и нарисуйте новую линию больше, чем сам спинной мозг. Переключите микроскоп в 100% отражающее зеркальное положение. Перейдите в окно сценария ImageJ и установите для параметра Повторение значение 2, для параметра Выборка значение 1, для параметра Ширина для 40 микрон и для параметра Затухание значение 89.После установки всех параметров нажмите на кнопку OK. Когда последовательность лазерного снимка будет завершена, проверьте качество трансекции, визуализируя флуоресценцию и фокусировку. Убедитесь, что никакие клетки или аксоны не остаются нетронутыми в месте поражения.Перейдите в главное окно программного обеспечения VAST и нажмите на кнопку Collect, чтобы собрать пораженных личинок в пустую 96-луночную пластину. Затем нажмите на индикатор лотка флажка, чтобы снова включить системный индикатор VAST. Выньте личинок из 96-луночной пластины как можно скорее и перенесите их в чистую чашку Петри со свежей рыбной водой, чтобы личинка восстановилась после поражения.Поместите чашку Петри в инкубатор при температуре 28 градусов по Цельсию. Иммуноокрасление ацетилированного тубулина и кальциевая визуализация указывают на то, что лазерное поражение полностью нарушает непрерывность спинномозговой ткани. Неповрежденный спинной мозг показан на этом изображении.Полное нарушение работы аксонов между каудальной и ростральной сторонами поражения подтверждает полную трансекцию спинного мозга. Пример неполной трансекции показан здесь. Трансецированный спинной мозг на личинке NBTG cAMP 6-S показан на этом изображении.Прямоугольники показывают ROI, используемые для количественной оценки интенсивности флуоресценции в ростральной и каудальной сторонах поражения. Графическое изображение представляет изменение интенсивности флуоресценции с течением времени в ROI рострального и каудального анализа. Максимальная интенсивность проекционных флуоресцентных изображений личинки NBT:dsRed до лазерного поражения, через три часа, 24 часа и 48 часов лазерного поражения показаны здесь.Через 24 часа после травмы раны начали закрываться, что привело к частичному восстановлению первоначальной структуры спинного мозга через 48 часов. Частичное функциональное воссоединение было подтверждено через 48 часов после травмы с использованием кальциевой визуализации. Соотношение между амплитудой шипов в каудальной области и ростральной области показало увеличение между 3, 24 и 48 часами после травмы.Рекрутирование макрофагов наблюдалось после лазерных поражений с использованием лазерных поражений личинок NBT:dsRed mpeg1 GFP. Не наблюдалось никакой разницы в количестве меченых клеток между ручными и лазерными поражениями. Разве что рыбы показали меньше двойных клеток, чем пораженные рыбы в обоих условиях поражения.Лазерное поражение вызывает меньше повреждений мышц и кожи, чем ручное поражение. Очень важно проверить, является ли поражение полным или нет. В области поражения не должно быть видно неповрежденной клетки или структуры, только тусклый фон.Для изучения регенерации спинного мозга мы используем множество методов, включая иммуногистохимию и кальциевую визуализацию. Важно отметить, что мы также можем заниматься электрофизиологией, так как ткань может выдерживать рассечение, в отличие от пораженных вручную животных. Эта новая методика позволяет количественно изучить структурно-функциональную организацию тканей в спинном мозге после травмы, допуская воспроизводимые и контролируемые поражения.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Острые и хронические Тактильная сенсорная тестирования после травмы спинного мозга у крыс

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

Хирургическая техника для спинного Доставка Шнур Терапия: Демонстрация процедуры в Геттингене Minipigs

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Контролируемые травма шейного Laceration у мышей

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

Контузия Модель тяжелого повреждения спинного мозга у крыс

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

Роман позвоночника Стабилизация Способ получения Contusive с повреждением спинного мозга

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Контролируемая Кортикальная Модель воздействия для черепно-мозговой травмой

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

Радио-телеметрическая система для мониторинга сердечно-сосудистой системы у крыс с спинного мозга Перерезка и эмбриональной нервной стволовой клетки трансплантатов

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Калиброванный щипцы Модель спинного мозга Компрессия травмы

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Контраст расширенного ультразвуковое исследование для оценки спинного мозга кровотока в экспериментальной повреждением спинного мозга

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...