Name: controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Denna studie stöddes av BBSRC (BB/S0001778/1). CR finansieras av Princess Royal TENOVUS Scotland Medical Research Scholarship Programme. Vi tackar David Greenald (CRH, University of Edinburgh) och Katy Reid (CDBS, University of Edinburgh) för den typ av transgen fisk (se kompletterande fil). Vi tackar Daniel Soong (CRH, University of Edinburgh) för den vänliga tillgången till 3i spinning-disk confocal.

Alla djurstudier utfördes med godkännande från det brittiska inrikesministeriet och enligt dess regler, under projektlicens PP8160052. Projektet godkändes av University of Edinburgh Institutional Animal Care and Use Committee. För experimentella analyser användes zebrafisklarver upp till 5-dagarsgamla av båda könen av följande tillgängliga transgena linjer: Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP), Tg(Xla.Tubb:DsRed), Tg (betaactin:utrophin-mCherry), Tg (Xla.Tubb:GCaMP6s) och Tg(mnx1:gfp) (se Kompletterande fil 1: gfp) (se...

<ol>
	<li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration.">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li><li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish.">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li><li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals.">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li><li>Schl&#252;&#223;ler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging.">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li><li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord.">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li><li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury.">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li><li>. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: <a target="_blank" href="https://nc3rs.org.uk">https://nc3rs.org.uk</a> (2021)</li><li>Hui, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+wide+expression+profiling+during+spinal+cord+regeneration+identifies+comprehensive+cellular+responses+in+Zebrafish.">Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).</li><li>Vasudevan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+interneurons+integrate+into+locomotor+circuitry+following+spinal+cord+injury.">Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).</li><li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li><li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li><li>Briona, L. K., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+transection+in+the+larval+Zebrafish.">Spinal cord transection in the larval Zebrafish.</a> Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+regeneration+in+adult+Zebrafish+by+gentamicin+induced+injury.">Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).</li><li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li><li>Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mitochondrial+transport+in+single-axon+regeneration+of+zebrafish+mauthner+cells.">In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).</li><li>Nichols, E. L., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+sensory+root+via+axonal+invasion.">Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion.</a> Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).</li><li>Ellstr&#246;m, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+zebrafish+induced+by+near-infrared+femtosecond+laser+pulses.">Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).</li><li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion.">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li><li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination.">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+Zebrafish.">Stages of embryonic development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>. AndOr Micropoint Manual Available from: <a target="_blank" href="https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual">https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual</a> (2021)</li><li>Knafo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neurons+control+the+timing+of+spinal+microcircuit+selection+during+locomotion.">Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion.</a> eLife. 6, 25260 (2017).</li><li>Tsarouchas, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1&#946;+and+Tnf-&#945;+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration.">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1&#946; and Tnf-&#945; by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).</li><li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+voltage-gated+Na++and+K++currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li><li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+long-term,+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish.">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish.">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li></ol>

Det finns ett trängande behov av en djupare förståelse för de processer som står på spel under regenerering hos zebrafisk. Denna djurmodell erbjuder många fördelar för biomedicinsk forskning, särskilt för ryggmärgsskador1. De flesta av studierna involverar manuella lesioner som kräver en välutbildad operatör och inducerar skador i flera vävnader. En laser lesion protokoll presenteras här, tillåter kontroll över lesion egenskaper och minskade skador på de omgivande vävnaderna. ...

I motsats till däggdjur kan zebrafisk (Danio rerio) reparera sitt centrala nervsystem (CNS) efter skada1. Användningen av zebrafisklarver som modell för ryggmärgsregenerering är relativt ny. Det har visat sig värdefullt att undersöka de cellulära och molekylära mekanismer som ligger till grund för reparation2. Detta beror på hur lätt manipulering, den korta experimentella cykeln (nya larver varje vecka), vävnadernas optiska transparens och larvernas lilla storlek, idealisk för in vivo fluorescensmikroskopi.
Vid ryggmärgsregenerering är två ytterligare fördelar med att använda larver återhämtningshastigheten, några dagar jämfört med några veckor för vuxna och hur lätt det är att inducera skador med hjälp av manuella tekniker. Detta har framgångsrikt använts i många studier3,4,5, inklusive nyligen genomförda undersökningar6,7. Sammantaget leder detta till ökad meningsfull dataproduktion, hög anpassningsförmåga för experimentella protokoll och minskade experimentella kostnader. Användningen av larver yngre än 5 dagar efter befruktning minskar också användningen av djur enligt 3R-principerna i djurforskning8.
Efter en ryggmärgsskada i zebrafisklarver uppstår många biologiska processer, inklusive inflammatoriskt svar, cellproliferation, neurogenes, migrering av överlevande eller nygenererade celler, reformation av funktionella axoner och en global ombyggnad av neurala processer kretsar och ryggradsvävnader6,7,9,10 . För att framgångsrikt orkestreras innebär dessa processer en fint reglerad interaktion mellan en rad celltyper, extracellulära matriskomponenter och biokemiska signaler11,12. Att reda ut detaljerna i denna betydande omorganisation av en komplex vävnad som ryggmärgen kräver användning och utveckling av exakta och kontrollerade experimentella metoder.
Det primära experimentella paradigmet som används för att studera ryggmärgsregenerering hos zebrafisk är att använda kirurgiska medel för att inducera vävnadsskador genom samband, stickning eller kryoinjury3,13. Dessa metoder har nackdelen att kräva särskild utbildning i mikrokirurgifärdigheter, vilket är tidskrävande för alla nya aktörer och kan förhindra att de används i kortsiktiga projekt. Dessutom inducerar de vanligtvis skador på de omgivande vävnaderna, vilket kan påverka regenerering.
Ett annat tillvägagångssätt är att inducera cellskador kemiskt14 eller genom genetiska manipuleringar15. Den senare möjliggör mycket riktade skador. En sådan teknik kräver dock långt förberedande arbete för att generera ny transgen fisk innan du gör något experiment, förnyas varje gång en unik celltyp är riktad.
Det finns således behovet av en metod som möjliggör riktade men mångsidiga skador som är lämpliga för en mängd olika studier i regenerering. En lösning är att använda en laser för att inducera lokaliserade skador i vävnaden av intresse16,17,18,19,20. Användningen av laser-inducerad vävnad skador utgör en robust strategi för att generera ryggmärg organskador med många fördelar. Mikroskopen utrustade med sådana lasermanipulationsmoduler gör det möjligt att specificera ett anpassat format område där cellablation kommer att uppstå, med den extra fördelen med temporal kontroll. Storleken och positionen för lesionen kan således anpassas för att ta itu med eventuella frågor.
Den saknade funktionen hos de flesta laser lesion system är möjligheten att inducera skador på ett mycket reproducerbart sätt för en serie larver. Här beskrivs ett ursprungligt protokoll med hjälp av en UV-laser för att inducera halvautomatiska exakta och kontrollerade skador i zebrafisklarver baserade på en mikrofluidisk plattform utformad för automatiserad larverhantering21. Dessutom sätts larver i ett glaskapillär i det system som presenteras här i en glaskapillär, vilket tillåter fri rotation av djuret runt sin rostrocaudalaxel. Användaren kan välja vilken sida av larven som ska presenteras för lasern samtidigt som fluorescensavbildningen exakt kan rikta laserstrålen och bedöma skadan efter lesionen.
Protokollet som beskrivs här används med ett halvautomatiskt zebrafisk larver imaging system kombinerat med en snurrande skiva utrustad med en UV-laser (betecknas nedan som VAST-systemet). Protokollets huvudpunkter och de flesta påståendena om tekniken är dock giltiga för alla system som är utrustade med en laser som kan cellablation, inklusive två fotonlaserskanningsmikroskop, spinndiskmikroskop som är försedda med en UV-laser (FRAP-modul) eller videomikroskop med en lasermodul för fotomanipulation. En av de största skillnaderna mellan VAST-systemet och konventionell provhantering kommer att vara att för den senare kommer montering av larver i lågsmältpunktsagaros på glasöverdrag/petriskål med glasbotten i stället för lastning av dem i en 96-brunnsplatta att krävas.
Fördelarna med denna metod öppnar möjligheter för innovativ forskning om cellulära och molekylära mekanismer under regenereringsprocessen. Dessutom möjliggör den höga datakvaliteten kvantitativa undersökningar i ett tvärvetenskapligt sammanhang.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software Zen Blue 2.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Studio Code</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual AxioCam 506 m CCD cameras</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope LSM880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk module CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopeAxio Examiner D1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser</td>
			<td>Micropoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-It EdU Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin acetylated antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic zebrafish lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mnx1:gfp)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by Katy Reid, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae

Zebrafisk larver har ett fullt fungerande centrala nervsystem (CNS) med hög regenerativ kapacitet bara några dagar efter befruktning. Detta gör denna djurmodell mycket användbar för att studera ryggmärgsskada och regenerering. Standardprotokollet för att inducera sådana skador är att transect den dorsala delen av stammen manuellt. Denna teknik kräver dock omfattande träning och skadar ytterligare vävnader. Ett protokoll utvecklades för laser-inducerade skador för att kringgå dessa begränsningar, vilket möjliggör hög reproducerbarhet och fullständighet av ryggmärgstransection över många djur och mellan olika sessioner, även för en otränad operatör. Dessutom är vävnadsskador främst begränsade till ryggmärgen själv, vilket minskar förvirrande effekter från att skada olika vävnader, t.ex. hud, muskler och CNS. Dessutom är hemi-lesioner i ryggmärgen möjliga. Förbättrad bevarande av vävnad integritet efter laser skada underlättar ytterligare dissekeringar som behövs för ytterligare analyser, såsom elektrofysiologi. Därför erbjuder denna metod exakt kontroll av den skada som är ouppnåelig manuellt. Detta möjliggör nya experimentella paradigm i denna kraftfulla modell i framtiden.

Validering av ryggmärgstransection Strukturella och funktionella undersökningar utfördes för att bedöma om protokollet tillåter en komplett ryggmärgstransection.
För det första, för att verifiera att förlusten av fluorescens på lesionsplatsen berodde på neuronal vävnadsskada och inte fluorescens fotobleaching från laserbelysningen, immunostaining med hjälp av en antikropp mot acetyated tubulin (se tabell över material och kompletter...

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Detta protokoll beskriver en metod för att inducera vävnad-specifika och mycket reproducerbara skador i zebrafish larver med hjälp av en laser lesion system i kombination med en automatiserad microfluidic plattform för larver hantering.

Kontrollerade halvautomatiska laserinducerade skador för att studera ryggmärgsregenerering i zebrafisklarver

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

Tekniken vi föreslår här gör det möjligt för oss att övervinna begränsningarna av manuella lesioner protokoll genom att minska skador på intilliggande vävnader och förbättra reproducerbarhet, även för oerfarna operatörer. Denna teknik gör det möjligt för oss att välja exakt var vi ska inducera lesionen utan att skada omgivande vävnader tack vare roterande glaskapillär i kombination med en riktad UV-laser. Många steg är involverade i driften av VAST-utrustningen, så jag rekommenderar att du kryssar av varje steg när du går för att säkerställa att allt görs korrekt.Börja med att bedöva larverna med hjälp av mediet som innehåller bedövningen och överför dem sedan till en 96-brunnsplatta som innehåller 300 mikroliter medium per brunn. Slå på alla systemkomponenter inklusive lasern för ablation. Starta sedan den automatiserade zebrafiskavbildningen, eller VAST-programvaran, välj Plate i det första fönstret och klicka på knappen Klar.Ett litet fönster dyker upp och frågar om kapillären är tom och ren. Kontrollera bilden av kapillären för eventuella luftbubblor inuti. Om det inte finns några luftbubblor inuti, klicka på Ja på det poppade fönstret.Gå sedan till Arkiv-menyn i LP Sampler-fönstret och välj alternativet Öppna skript. Välj en fil som innehåller skriptet som motsvarar experimentet som ska utföras. Gå sedan till Arkiv i huvudfönstret i VAST och välj Öppna experiment.Välj den experimentfil som motsvarar det planerade experimentet. Starta ImageJ/Fiji-programvara, gå till Arkiv-menyn och välj Nytt skript för att öppna skriptfönstret. Gå sedan till Arkiv-menyn och välj Öppna för att läsa in laserinfilionskriptet.Därefter går du till Arkiv-menyn för att starta Python IDE och väljer Öppna fil för att läsa in skriptet för att hantera lasern. Klicka sedan på Kör-menyn och välj Kör utan felsökning för att köra skriptet. Se till att en sekvens av meddelanden på terminalpanelen visas tillsammans med visst brus medan laserdämpningen initieras.I huvudfönstret i VAST-programvaran klickar du på pilknapparna för att flytta scenen och centrera kapillären i förhållande till mikroskopmålet. Titta igenom okularen och fokusera på toppen av kapillären med hjälp av mikroskopets överförda ljus. Placera en 96-brunnsplatta som innehåller larverna på lp-provtagarens vänstra plåthållare.Placera sedan en annan platta för uppsamling på provtagarens högra tallrikshållare. Se till att plattans A1-brunn sitter i hållarens vänstra hörn. I LP Sampler-fönstret i VAST-programvaran klickar du på knappen Plåtmall och väljer alla brunnar som innehåller larver.Klicka på ok-knappen för att validera och stänga fönstret. Klicka sedan på knappen Kör platta i LP Sampler-fönstret för att börja ladda larven. Gå sedan till mikroskopprogramvaran och klicka på Live-knappen för att avbilda larven.Sätt på mikroskopets fokusknopp tills ryggmärgens centrala kanal är synlig. Ta en ögonblicksbild i fluorescens och spara bilden i en mapp. Öppna bilden i ImageJ och justera kontrasten om det behövs.Klicka på verktyget för områdesräntelinje och rita en kort linje centrerad på ryggmärgen. Byt mikroskop till 100% reflekterande spegelläge. Läs in ImageJ-skriptet och ställ in Upprepning på 2, Prov på 1, Bredd till 40 mikron och Dämpning till 89.När du har ställt in alla parametrar klickar du på OK-knappen. När laserskottsekvensen är klar byter du till fluorescensavbildning på bildbehandlingsprogramvaran och justerar fokus. Ta en ny ögonblicksbild och spara den.Öppna den här nya bilden i ImageJ och rita en ny linje större än själva ryggmärgen. Byt mikroskop till 100% reflekterande spegelläge. Gå till ImageJ-skriptfönstret och ställ in Upprepning på 2, Prov till 1, Bredd till 40 mikron och Dämpning till 89.När du har ställt in alla parametrar klickar du på OK-knappen. När laserskottsekvensen är klar kontrollerar du omsektionskvaliteten genom att avbilda fluorescens och fokusering. Se till att inga celler eller axoner förblir intakta i lesionsstället.Gå till huvudPROGRAMMET OCH klicka på knappen Samla för att samla in de skadade larverna i den tomma 96-brunnsplattan. Klicka sedan på kryssrutefackets lampa för att slå på VAST-systemlampan igen. Ta ut larven från 96-brunnsplattan så snart som möjligt och överför dem till en ren Petri-maträtt med färskt fiskvatten för larven att återhämta sig efter lesion.Lägg Petri-skålen i en inkubator vid 28 grader Celsius. Acetylated tubulin immuno-staining och kalcium imaging indikerar att laser lesion helt stör kontinuiteten i spinal vävnad. En intakt ryggmärg visas i denna bild.En fullständig störning av axons mellan caudal och rostral sidor av lesion bekräftar fullständig omsektion av ryggmärgen. Ett exempel på ofullständig omsektion visas här. Den transected ryggmärgen på en NBTG cAMP 6-S larva visas i denna bild.Rektanglarna visar de ROIs som används för att kvantifiera fluorescensintensiteten i lesionernas rostral och kaudala sidor. Den grafiska bilden representerar fluorescensintensitetens förändring över tid i rom och kaudala analys-ROI: er. Maximal intensitet projektion fluorescence bilder av en NBT:dsRed larva före laser lesion, efter tre timmar, 24 timmar och 48 timmar av laser lesion visas här.Efter 24 timmar efter skadan började såren stängas, vilket ledde till en partiell restaurering av ryggmärgens ursprungliga struktur efter 48 timmar. En partiell funktionella återanslutning bekräftades efter 48 timmar efter skada med kalcium imaging. Förhållandet mellan amplituden av spikarna i det kaudala området och rostral området visade en ökning mellan 3, 24 och 48 timmar efter skada.Macrophage rekrytering observerades efter laser organskador med NBT:dsRed mpeg1 GFP larver laser skador. Ingen skillnad observerades i antalet märkta celler mellan manuella och laser organskador. Unlesioned fisk visade färre dubbelmärkta celler än lesionerade fisk i båda lesion villkor.Laser lesion inducerar mindre muskel- och hudskador än manuell lesion. Det är viktigt att kontrollera om lesionen är fullständig eller inte. Ingen intakt cell eller struktur bör vara synlig i lesionsområdet, endast en dim bakgrund.För att studera ryggmärgsregenerering använder vi många metoder, inklusive immuno-histokemi och kalciumavbildning. Viktigt är att vi också kan göra elektrofysiologi, eftersom vävnaden kan motstå dissekering, i motsats till manuellt lesionerade djur. Denna nya teknik gör det möjligt för oss att kvantitativt studera den strukturella och funktionella vävnadsorganisationen i ryggmärgen efter skada genom att tillåta reproducerbara och kontrollerade skador.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Akut och kronisk Taktil Sensorisk Provning efter ryggmärgsskada hos råttor

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

Kirurgisk teknik för ryggmärg Leverans av terapier: Demonstration av förfarande i Göttingen minigris

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Kontrollerad Cervikal Laceration Skada hos möss

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

En Contusion Modell av svår ryggmärgsskada hos råttor

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

A Novel Vertebrala Stabilisering metod för framställning Contusive Ryggmärgsskada

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Kontrollerad Kortikal Impact modell för traumatisk hjärnskada

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

En radio-telemetri system för att övervaka hjärtfunktionen hos råttor med ryggmärgstransection och embryonala Neural Stem Cell Transplantat

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Kalibrerad Tång Modell av ryggmärgskompression skada

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Kontrastförstärkt ultraljud Imaging för Bedömning av ryggmärgs blodflöde i experimentell Ryggmärgsskada

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...