Name: controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae
Uploaded: 2021-11-22T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Bu çalışma BBSRC (BB/S0001778/1) tarafından desteklenmiştir. CR, Princess Royal TENOVUS İskoçya Tıbbi Araştırma Burs Programı tarafından finanse edilmektedir. David Greenald'a (CRH, Edinburgh Üniversitesi) ve Katy Reid'e (CDBS, Edinburgh Üniversitesi) transgenik balıkların nazik hediyesi için teşekkür ederiz ( Ek Dosyaya Bakınız). Daniel Soong'a (CRH, Edinburgh Üniversitesi) 3i eğirme diski konfokaline nazik erişim için teşekkür ederiz.

Tüm hayvan çalışmaları, İngiltere İçişleri Bakanlığı'nın onayıyla ve yönetmeliklerine göre, PP8160052 proje lisansı altında gerçekleştirilmiştir. Proje, Edinburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı. Deneysel analizler için, her iki cinsiyetten 5 güne kadar olan zebra balığı larvaları aşağıdaki mevcut transgenik çizgilerden kullanılmıştır: Tg (Xla.Tubb: DsRed; mpeg1: GFP), Tg (Xla.Tubb: DsRed), Tg (betaaktin: utrophin-mCherry), Tg (Xla.T...

<ol>
	<li>Becker, C. G., Becker, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+zebrafish+as+a+model+for+successful+central+nervous+system+regeneration.">Adult zebrafish as a model for successful central nervous system regeneration.</a> Restorative Neurology and Neuroscience. 26 (2-3), 71-80 (2008).</li><li>Ohnmacht, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Anguita-Salinas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+during+spinal+cord+regeneration+in+larval+zebrafish.">Cellular dynamics during spinal cord regeneration in larval zebrafish.</a> Developmental Neuroscience. 41 (1-2), 112-122 (2019).</li><li>Chapela, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+zebrafish+drug+screening+platform+boosts+the+discovery+of+novel+therapeutics+for+spinal+cord+injury+in+mammals.">A zebrafish drug screening platform boosts the discovery of novel therapeutics for spinal cord injury in mammals.</a> Scientific Reports. 9, 1-12 (2019).</li><li>Schl&#252;&#223;ler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+mapping+of+spinal+cord+growth+and+repair+in+living+zebrafish+larvae+by+brillouin+imaging.">Mechanical mapping of spinal cord growth and repair in living zebrafish larvae by brillouin imaging.</a> Biophysical Journal. 115 (5), 911-923 (2018).</li><li>Cavone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+unique+macrophage+subpopulation+signals+directly+to+progenitor+cells+to+promote+regenerative+neurogenesis+in+the+zebrafish+spinal+cord.">A unique macrophage subpopulation signals directly to progenitor cells to promote regenerative neurogenesis in the zebrafish spinal cord.</a> Developmental Cell. 56 (11), 1617-1630 (2021).</li><li>Keatinge, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+gRNA+phenotypic+screening+in+zebrafish+reveals+pro-regenerative+genes+in+spinal+cord+injury.">CRISPR gRNA phenotypic screening in zebrafish reveals pro-regenerative genes in spinal cord injury.</a> PLoS Genetics. 17 (4), 1-21 (2021).</li><li>. National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research Available from: <a target="_blank" href="https://nc3rs.org.uk">https://nc3rs.org.uk</a> (2021)</li><li>Hui, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+wide+expression+profiling+during+spinal+cord+regeneration+identifies+comprehensive+cellular+responses+in+Zebrafish.">Genome wide expression profiling during spinal cord regeneration identifies comprehensive cellular responses in Zebrafish.</a> PLOS ONE. 9 (1), 1-23 (2014).</li><li>Vasudevan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerated+interneurons+integrate+into+locomotor+circuitry+following+spinal+cord+injury.">Regenerated interneurons integrate into locomotor circuitry following spinal cord injury.</a> Experimental Neurology. 342, 1-10 (2021).</li><li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+cell+interactions+allow+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Dynamic cell interactions allow spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Current Opinion in Physiology. 14, 64-69 (2020).</li><li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+controls+pro-regenerative+Collagen+XII+in+functional+spinal+cord+regeneration+in+zebrafish.">Wnt signaling controls pro-regenerative Collagen XII in functional spinal cord regeneration in zebrafish.</a> Nature Communications. 8 (126), 1-16 (2017).</li><li>Briona, L. K., Dorsky, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+transection+in+the+larval+Zebrafish.">Spinal cord transection in the larval Zebrafish.</a> Journal of Visualised Experiments: JoVE. (87), (2014).</li><li>Kamei, C. N., Liu, Y., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kidney+regeneration+in+adult+Zebrafish+by+gentamicin+induced+injury.">Kidney regeneration in adult Zebrafish by gentamicin induced injury.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (102), (2015).</li><li>Bhatt, D. H., Otto, S. J., Depoister, B., Fetcho, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+AMP-induced+repair+of+zebrafish+spinal+circuits.">Cyclic AMP-induced repair of zebrafish spinal circuits.</a> Science. 305 (5681), 254-258 (2004).</li><li>Xu, Y., Chen, M., Hu, B., Huang, R., Hu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+mitochondrial+transport+in+single-axon+regeneration+of+zebrafish+mauthner+cells.">In vivo imaging of mitochondrial transport in single-axon regeneration of zebrafish mauthner cells.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11 (4), 1-12 (2017).</li><li>Nichols, E. L., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+the+sensory+root+via+axonal+invasion.">Functional regeneration of the sensory root via axonal invasion.</a> Cell Reports. 30 (1), 9-17 (2020).</li><li>Ellstr&#246;m, I. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+injury+in+zebrafish+induced+by+near-infrared+femtosecond+laser+pulses.">Spinal cord injury in zebrafish induced by near-infrared femtosecond laser pulses.</a> Journal of Neuroscience Methods. 311, 259-266 (2016).</li><li>Green, L. A., Nebiolo, J. C., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+exit+the+CNS+in+spinal+root+avulsion.">Microglia exit the CNS in spinal root avulsion.</a> PLOS Biology. 17 (2), 1-30 (2019).</li><li>Early, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+high-resolution+in+vivo+screen+in+zebrafish+to+identify+chemical+regulators+of+myelination.">An automated high-resolution in vivo screen in zebrafish to identify chemical regulators of myelination.</a> eLife. , 1-31 (2018).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+Zebrafish.">Stages of embryonic development of the Zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).</li><li>. AndOr Micropoint Manual Available from: <a target="_blank" href="https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual">https://andor.oxinst.com/downloads/view/andor-micropoint-manual</a> (2021)</li><li>Knafo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanosensory+neurons+control+the+timing+of+spinal+microcircuit+selection+during+locomotion.">Mechanosensory neurons control the timing of spinal microcircuit selection during locomotion.</a> eLife. 6, 25260 (2017).</li><li>Tsarouchas, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+control+of+proinflammatory+cytokines+Il-1&#946;+and+Tnf-&#945;+by+macrophages+in+zebrafish+spinal+cord+regeneration.">Dynamic control of proinflammatory cytokines Il-1&#946; and Tnf-&#945; by macrophages in zebrafish spinal cord regeneration.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li><li>Howell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Statistical methods for psychology. , 324-325 (2002).</li><li>Tukey, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+individual+means+in+the+analysis+of+variance.">Comparing individual means in the analysis of variance.</a> Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).</li><li>Song, M., Mohamad, O., Chen, D., Yu, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+development+of+voltage-gated+Na++and+K++currents+regulates+functional+maturation+of+forebrain+neurons+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">Coordinated development of voltage-gated Na+ and K+ currents regulates functional maturation of forebrain neurons derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cells and Development. 22 (10), 1551-1563 (2013).</li><li>Hong, S., Lee, P., Baraban, S., Lee, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+long-term,+multi-channel+and+non-invasive+electrophysiology+platform+for+Zebrafish.">A novel long-term, multi-channel and non-invasive electrophysiology platform for Zebrafish.</a> Scientific Reports. 6, 1-10 (2016).</li><li>Menelaou, E., McLean, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hierarchical+control+of+locomotion+by+distinct+types+of+spinal+V2a+interneurons+in+zebrafish.">Hierarchical control of locomotion by distinct types of spinal V2a interneurons in zebrafish.</a> Nature Communications. 10, 1-12 (2019).</li></ol>

Zebra balıklarında rejenerasyon sırasında oyunda olan süreçlerin daha derin bir şekilde anlaşılmasına acil bir ihtiyaç vardır. Bu hayvan modeli, biyomedikal araştırmalara, özellikle omurilik yaralanmalarına birçok fayda sağlar1. Çalışmaların çoğu, iyi eğitimli bir operatör gerektiren ve çoklu doku hasarına neden olan manuel lezyonları içermektedir. Burada lezyon özellikleri üzerinde kontrol sağlayan ve çevre dokulara verilen hasarı azaltan bir lazer lezyon protok...

Memelilerin aksine, zebra balığı (Danio rerio) yaralanmadan sonra merkezi sinir sistemlerini (CNS) onarabilir1. Zebra balığı larvalarının omurilik rejenerasyonu için bir model olarak kullanılması nispeten yenidir. Onarımın altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları araştırmak için değerli olduğu kanıtlanmıştır2. Bunun nedeni, manipülasyon kolaylığı, kısa deneysel döngü (her hafta yeni larvalar), dokuların optik şeffaflığı ve larvaların in vivo floresan mikroskobu için ideal olan küçük boyutudur.
Omurilik rejenerasyonu durumunda, larva kullanmanın iki ek avantajı, iyileşme hızı, yetişkinler için birkaç haftaya kıyasla birkaç gün ve manuel teknikler kullanarak yaralanmaları indükleme kolaylığıdır. Bu, son araştırmalar da dahil olmak üzere birçok çalışmada3,4,5 başarıyla kullanılmıştır6,7. Genel olarak, bu anlamlı veri üretiminin artmasına, deneysel protokollerin yüksek uyarlanabilirliğine ve deneysel maliyetlerin azalmasına neden olur. Döllenmeden sonraki 5 günden daha genç larvaların kullanımı, hayvan araştırmalarında 3R ilkelerini izleyerek hayvanların kullanımını da azaltır8.
Zebra balığı larvalarında omurilik yaralanmasından sonra, enflamatuar yanıt, hücre proliferasyonu, nörogenez, hayatta kalan veya yeni üretilen hücrelerin göçü, fonksiyonel aksonların reformu ve nöral süreç devrelerinin ve omurga dokularının küresel olarak yeniden şekillendirilmesi dahil olmak üzere birçok biyolojik süreç meydana gelir6,7,9,10 . Başarılı bir şekilde organize edilmek için, bu süreçler bir dizi hücre tipi, hücre dışı matris bileşenleri ve biyokimyasal sinyaller arasında ince bir şekilde düzenlenmiş bir etkileşimi içerir11,12. Omurilik gibi karmaşık bir dokunun bu önemli yeniden yapılanmasının ayrıntılarını çözmek, hassas ve kontrollü deneysel yaklaşımların kullanılmasını ve geliştirilmesini gerektirir.
Zebra balıklarında omurilik rejenerasyonunu incelemek için kullanılan birincil deneysel paradigma, rezeksiyon, bıçaklama veya kriyoyaralanma yoluyla doku hasarını indüklemek için cerrahi araçlar kullanmaktır3,13. Bu yaklaşımlar, herhangi bir yeni operatör için zaman alıcı olan ve kısa vadeli projelerde kullanılmalarını engelleyebilecek mikrocerrahi becerilerinde özel eğitim gerektirme dezavantajına sahiptir. Ayrıca, genellikle rejenerasyonu etkileyebilecek çevre dokulara zarar verirler.
Başka bir yaklaşım da kimyasal olarak14 veya genetik manipülasyonlarla15 hücre hasarını indüklemektir. İkincisi, yüksek oranda hedeflenmiş hasara izin verir. Bununla birlikte, böyle bir teknik, herhangi bir deney yapmadan önce, her benzersiz bir hücre tipi hedeflendiğinde yenilenen yeni transgenik balıklar üretmek için uzun hazırlık çalışmaları gerektirir.
Bu nedenle, rejenerasyonda çeşitli çalışmalara uygun, hedefe yönelik ancak çok yönlü lezyonlara izin veren bir yönteme ihtiyaç vardır. Bir çözüm, ilgilenilen dokuda lokalize hasarı indüklemek için bir lazer kullanmaktır16,17,18,19,20. Gerçekten de, lazere bağlı doku hasarının kullanımı, birçok avantajı olan omurilik lezyonlarının oluşturulması için sağlam bir yaklaşım sunmaktadır. Bu tür lazer manipülasyon modülleri ile donatılmış mikroskoplar, zamansal kontrolün ekstra yararı ile hücre ablasyonunun gerçekleşeceği özelleştirilmiş şekilli bir alanın belirlenmesine izin verir. Lezyonun boyutu ve pozisyonu böylece herhangi bir soruyu ele almak için uyarlanabilir.
Çoğu lazer lezyon sisteminin eksik özelliği, bir dizi larva için yüksek oranda tekrarlanabilir bir şekilde yaralanmalara neden olma olasılığıdır. Burada, zebra balığı larvalarında yarı otomatik hassas ve kontrollü lezyonları indüklemek için otomatik larva kullanımı için tasarlanmış mikroakışkan bir platforma dayanan orijinal bir protokol açıklanmaktadır21. Dahası, burada sunulan sistemde, larvalar, hayvanın rostrokaudal ekseni etrafında serbest dönmesine izin veren bir cam kılcal damara yerleştirilir. Kullanıcı, larvaların hangi tarafının lazere sunulacağını seçebilirken, floresan görüntülemenin lazer ışınını tam olarak hedeflemesine ve lezyondan sonraki hasarı değerlendirmesine izin verebilir.
Burada açıklanan protokol, UV lazerle donatılmış bir eğirme diski (bundan böyle VAST sistemi olarak anılacaktır) ile birleştirilmiş yarı otomatik bir zebra balığı larva görüntüleme sistemi ile birlikte kullanılmaktadır. Bununla birlikte, protokolün ana noktaları ve tekniğin iddialarının çoğu, iki fotonlu lazer tarama mikroskopları, UV lazerle sağlanan dönen disk mikroskopları (FRAP modülü) veya fotoğraf manipülasyonu için lazer modüllü video mikroskoplar dahil olmak üzere hücre ablasyonu yapabilen bir lazerle donatılmış herhangi bir sistem için geçerlidir. VAST sistemi ile geleneksel numune işleme arasındaki temel farklardan biri, ikincisi için, larvaların 96 delikli bir plakaya yüklenmesi yerine, cam kapaklar / cam tabanlı Petri tabakları üzerine düşük erime noktalı agarozda monte edilmesinin gerekli olmasıdır.
Bu yöntemin sunduğu faydalar, rejenerasyon sürecinde hücresel ve moleküler mekanizmalar hakkında yenilikçi araştırmalar için fırsatlar sunmaktadır. Ayrıca, yüksek veri kalitesi, multidisipliner bir bağlamda nicel araştırmalara izin verir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope software Zen Blue 2.0</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FIJI</td>
			<td>Open-Source</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visual Studio Code</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope and accessories</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ApoTome microscope</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C-Plan-Apochromat 10X (0.5NA) dipping lens</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dual AxioCam 506 m CCD cameras</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser scanning confocal microscope LSM880</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spinning-disk module CSU-X1</td>
			<td>Yokogawa</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Upright microscopeAxio Examiner D1</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV laser</td>
			<td>Micropoint</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VAST BioImager</td>
			<td>Union Biometrica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90 mm Petri dish</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>101R20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3841</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Click-It EdU Imaging Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aminobenzoic-acid-ethyl methyl-ester (MS222)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-chicken Alexa Fluor 488</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>703-545-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti-mouse Cy3</td>
			<td>Jackson</td>
			<td>715-165-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-GFP</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB13970</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-tubulin acetylated antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic zebrafish lines</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(beta-actin:utrophin-mCherry)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(mnx1:gfp)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Flanagan-Steet et al. 2005]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>First described in [Peri and Nusslein-Volhard 2008]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:DsRed;mpeg1:GFP)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by Katy Reid, University of Edinburgh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(Xla.Tubb:GCaMP6s)</td>
			<td></td>
			<td>N/A</td>
			<td>Established by David Greenhald, University of Edinburgh</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

controlled semi-automated laser-induced injuries for studying spinal cord regeneration in zebrafish larvae

Zebra balığı larvaları, döllenmeden sadece birkaç gün sonra yüksek rejeneratif kapasiteye sahip tamamen işlevsel bir merkezi sinir sistemine (CNS) sahiptir. Bu, bu hayvan modelini omurilik yaralanması ve rejenerasyonunu incelemek için çok yararlı kılar. Bu tür lezyonları indüklemek için standart protokol, gövdenin dorsal kısmını manuel olarak transekte etmektir. Bununla birlikte, bu teknik kapsamlı eğitim gerektirir ve ek dokulara zarar verir. Lazerle indüklenen lezyonlar için bu sınırlamaları aşmak için bir protokol geliştirildi ve eğitimsiz bir operatör için bile birçok hayvan üzerinde ve farklı seanslar arasında omurilik transeksiyonunun yüksek tekrarlanabilirliği ve bütünlüğüne izin verdi. Ayrıca, doku hasarı esas olarak omuriliğin kendisi ile sınırlıdır ve cilt, kas ve CNS gibi farklı dokulara zarar vermenin kafa karıştırıcı etkilerini azaltır. Ayrıca, omuriliğin hemi-lezyonları mümkündür. Lazer hasarından sonra doku bütünlüğünün daha iyi korunması, elektrofizyoloji gibi ek analizler için gerekli olan daha ileri diseksiyonları kolaylaştırır. Bu nedenle, bu yöntem manuel olarak ulaşılamayan yaralanma derecesinin hassas kontrolünü sağlar. Bu, gelecekte bu güçlü modelde yeni deneysel paradigmalara izin verir.

Omurilik transeksiyonunun doğrulanması Protokolün tam omurilik transeksiyonuna izin verip vermediğini değerlendirmek için yapısal ve fonksiyonel araştırmalar yapıldı.
İlk olarak, lezyon bölgesindeki floresan kaybının lazer aydınlatmadan floresan fotobeyazlatma değil, nöronal doku hasarından kaynaklandığını doğrulamak için, asetillenmiş tübüline karşı bir antikor kullanarak immün boyama (bakınız Materyal Tablosu ve Ek...

Watch this Scientific Journal Video about Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Controlled Semi-Automated Laser-Induced Injuries for Studying Spinal Cord Regeneration in Zebrafish Larvae

Bu protokol, larva elleçlemesi için otomatik bir mikroakışkan platform ile birleştirilmiş bir lazer lezyon sistemi kullanarak zebra balığı larvalarında dokuya özgü ve yüksek oranda tekrarlanabilir yaralanmaları indüklemek için bir yöntemi açıklamaktadır.

Zebra Balığı Larvalarında Omurilik Rejenerasyonunu İncelemek için Kontrollü Yarı Otomatik Lazer Kaynaklı Yaralanmalar

Zebrafish larvae possess a fully functional central nervous system (CNS) with a high regenerative capacity only a few days after fertilization. This makes ...

Burada önerdiğimiz teknik, bitişik dokulara verilen hasarı azaltarak ve deneyimsiz operatörler için bile tekrarlanabilirliği artırarak manuel lezyon protokollerinin sınırlamalarının üstesinden gelmemizi sağlar. Bu teknik, hedeflenen bir UV lazerle birleştirilmiş dönen cam kılcal damar sayesinde çevre dokulara zarar vermeden lezyonun tam olarak nerede indükleneceğini seçmemizi sağlar. VAST ekipmanının çalıştırılmasında birçok adım söz konusudur, bu nedenle her şeyin doğru yapıldığından emin olmak için her adımı işaretlemenizi tavsiye ederim.Larvaları anestezi içeren ortamı kullanarak anestezi yaparak başlayın ve daha sonra bunları kuyucuk başına 300 mikrolitre ortam içeren 96 delikli bir plakaya aktarın. Ablasyon için lazer de dahil olmak üzere tüm sistem bileşenlerini açın. Ardından, otomatik zebra balığı görüntülemeyi veya VAST yazılımını başlatın, ilk pencerede Plaka'yı seçin ve Bitti düğmesine tıklayın.Kılcal damarın boş ve temiz olup olmadığını soran küçük bir pencere açılacaktır. İçerideki hava kabarcıkları için kılcal damarın görüntüsünü kontrol edin. İçinde hava kabarcığı yoksa, açılan pencerede Evet'e tıklayın.LP Örnekleyici penceresinde, Dosya menüsüne gidin ve Komut dosyasını aç seçeneğini belirleyin. Gerçekleştirilecek denemeye karşılık gelen komut dosyasını içeren bir dosya seçin. Ardından, ana VAST yazılım penceresinde Dosya'ya gidin ve Denemeyi aç'ı seçin.Planlanan denemeye karşılık gelen deneme dosyasını seçin. ImageJ/Fiji yazılımını başlatın, Dosya menüsüne gidin ve komut dosyası penceresini açmak için Yeni komut dosyası'nı seçin. Ardından, Dosya menüsüne gidin ve lazer lezyon betiğini yüklemek için Aç'ı seçin.Ardından, Python IDE'yi başlatmak için Dosya menüsüne gidin ve lazeri yönetmek üzere komut dosyasını yüklemek için Dosya aç'ı seçin. Ardından, Çalıştır menüsüne tıklayın ve komut dosyasını çalıştırmak için Hata Ayıklamadan Çalıştır'ı seçin. Lazer zayıflatıcı başlatılırken terminal panelindeki bir dizi mesajın bir miktar gürültüyle birlikte göründüğünden emin olun.VAST yazılımının ana penceresinde, sahneyi hareket ettirmek ve kılcal damarı mikroskop hedefine göre ortalamak için ok düğmelerine tıklayın. Göz merceklerine bakın ve mikroskopun iletilen ışığını kullanarak kılcal damarın tepesine odaklanın. LP numune alma cihazının sol plaka tutucusuna larvaları içeren 96 delikli bir plaka yerleştirin.Ardından, numune alma cihazının sağ plaka tutucusuna toplama için başka bir plaka yerleştirin. Plakanın A1 kuyucuğunun tutucunun sol ön köşesinde olduğundan emin olun. VAST yazılımının LP Örnekleyici penceresinde, Plaka şablonu düğmesine tıklayın ve larva içeren tüm kuyucukları seçin.Pencereyi doğrulamak ve kapatmak için Tamam düğmesine tıklayın. Ardından, larvaları yüklemeye başlamak için LP Örnekleyici penceresindeki Plakayı çalıştır düğmesine tıklayın. Ardından, mikroskop yazılımına gidin ve larvaları görüntülemek için Canlı düğmesine tıklayın.Mikroskop odak düğmesini, omurilik merkezi kanalı görünene kadar açın. Floresan ile anlık görüntü alın ve görüntüyü bir klasöre kaydedin. Görüntüyü ImageJ'de açın ve gerekirse kontrastı ayarlayın.İlgi alanı çizgi aracına tıklayın ve omuriliğe ortalanmış kısa bir çizgi çizin. Mikroskobu %100 yansıtıcı ayna konumuna getirin. ImageJ komut dosyasını yükleyin ve Tekrarlama'yı 2, Örnek'i 1, Genişlik'i 40 mikrona ve Zayıflamayı 89'a ayarlayın.Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, Tamam düğmesine tıklayın. Lazer çekim sırası tamamlandığında, görüntüleme yazılımında floresan görüntülemeye geçin ve odağı ayarlayın. Yeni bir anlık görüntü alın ve kaydedin.Bu yeni görüntüyü ImageJ'de açın ve omuriliğin kendisinden daha büyük yeni bir çizgi çizin. Mikroskobu %100 yansıtıcı ayna konumuna getirin. ImageJ komut dosyası penceresine gidin ve Tekrarlama'yı 2, Örnek'i 1, Genişlik'i 40 mikrona ve Zayıflamayı 89'a ayarlayın.Tüm parametreleri ayarladıktan sonra, Tamam düğmesine tıklayın. Lazer atış sırası bittiğinde, floresan görüntüleme ve odaklama ile transeksiyon kalitesini doğrulayın. Lezyon bölgesinde hiçbir hücrenin veya aksonun bozulmadan kalmadığından emin olun.Ana VAST yazılım penceresine gidin ve lezyonlu larvaları boş 96 delikli plakaya toplamak için Topla düğmesine tıklayın. Ardından, VAST sistem ışığını tekrar açmak için onay kutusu tepsisi ışığını tıklayın. Larvaları 96 kuyucuklu plakadan mümkün olan en kısa sürede çıkarın ve larvaların lezyon sonrası iyileşmesi için tatlı balık suyu ile temiz bir Petri kabına aktarın.Petri kabını 28 santigrat derecede bir inkübatöre koyun. Asetillenmiş tübülin immüno-boyaması ve kalsiyum görüntüleme, lazer lezyonunun omurilik dokusunun devamlılığını tamamen bozduğunu göstermektedir. Bu resimde sağlam bir omurilik gösterilmiştir.Aksonların lezyonun kaudal ve rostral tarafları arasındaki tam bir bozulması, omuriliğin tam transeksiyonunu doğrular. Tamamlanmamış transeksiyonun bir örneği burada gösterilmiştir. NBTG cAMP 6-S larva üzerindeki transekte omurilik bu resimde gösterilmiştir.Dikdörtgenler, lezyonların rostral ve kaudal taraflarındaki floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılan ROI'leri göstermektedir. Grafik görüntü, rostral ve kaudal analiz ROI'lerinde zaman içinde floresan yoğunluğu değişimini temsil eder. Bir NBT:dsRed larvasının lazer lezyonundan önce, lazer lezyonundan üç saat, 24 saat ve 48 saat sonra maksimum yoğunluk projeksiyon floresan görüntüleri burada gösterilmiştir.Yaralanmadan 24 saat sonra, yaralar kapanmaya başladı ve 48 saat sonra omuriliğin ilk yapısının kısmen restorasyonuna yol açtı. Kalsiyum görüntüleme kullanılarak yaralanmadan 48 saat sonra kısmi fonksiyonel bir yeniden bağlantı doğrulandı. Kaudal bölgedeki sivri uçların genliği ile rostral alan arasındaki oran, yaralanma sonrası 3, 24 ve 48 saat arasında bir artış göstermiştir.NBT:dsRed mpeg1 GFP larva lazer lezyonları kullanılarak lazer lezyonlarından sonra makrofaj alımı gözlendi. Etiketli hücre sayısında manuel ve lazer lezyonları arasında fark gözlenmedi. Lezyonsuz balıklar, her iki lezyon koşulunda da lezyonlu balıklardan daha az çift etiketli hücre gösterdi.Lazer lezyonu manuel lezyona göre daha az kas ve deri hasarına neden olur. Lezyonun tam olup olmadığını doğrulamak çok önemlidir. Lezyon bölgesinde sağlam bir hücre veya yapı görünmemelidir, sadece loş bir arka plan görülmelidir.Omurilik rejenerasyonunu incelemek için, immüno-histokimya ve kalsiyum görüntüleme dahil olmak üzere birçok yöntem kullanıyoruz. Önemli olarak, manuel lezyonlu hayvanların aksine, doku diseksiyona dayanabileceğinden, elektrofizyoloji de yapabiliriz. Bu yeni teknik, tekrarlanabilir ve kontrollü lezyonlara izin vererek yaralanma sonrası omurilikteki yapısal ve fonksiyonel doku organizasyonunu nicel olarak incelememizi sağlar.

Research

JoVE Journal

Medicine

Acute and Chronic Tactile Sensory Testing after Spinal Cord Injury in Rats

Sıçanlarda Spinal Kord Yaralanma sonrası Akut ve Kronik Dokunsal Duyu Testi

Spinal cord injury (SCI) impairs sensory systems causing allodynia1-8. To identify cellular and molecular causes of allodynia, sensitive and valid sensory ...

Surgical Technique for Spinal Cord Delivery of Therapies: Demonstration of Procedure in Gottingen Minipigs

Terapiler Omurilik Teslimat için Cerrahi Tekniği: Göttingen Minipigs Prosedürü gösterilmesi

This is a  compact visual description of a combination of surgical technique and device  for the  delivery of (gene and cell) therapies into the spinal ...

Controlled Cervical Laceration Injury in Mice

Farelerde Kontrollü Servikal yırtığı Sakatlık

Use of genetically modified mice enhances our  understanding of molecular mechanisms underlying several neurological disorders  such as a spinal cord ...

A Contusion Model of Severe Spinal Cord Injury in Rats

Sıçanlarda Şiddetli Spinal Kord Yaralanması bir bere modeli

The translational potential of novel treatments should be investigated in severe spinal cord injury (SCI) contusion models. A detailed methodology is ...

A Novel Vertebral Stabilization Method for Producing  Contusive Spinal Cord Injury

Kontuzif omurilik hasarın üretmek için Yeni Bir Omurga Stabilizasyon Yöntemi

Clinically-relevant animal cervical spinal cord injury (SCI) models are essential for developing and testing potential therapies; however, producing ...

Implanting Glass Spinal Cord Windows in Adult Mice with Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Deneysel Otoimmün Encephalomyelitis Erişkin Farelerde Cam Omurilik Windows&#39;u implante

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in adult rodents is the standard experimental model for studying autonomic demyelinating diseases such as ...

Controlled Cortical Impact Model for Traumatic Brain Injury

Travmatik Beyin Hasarı için Kontrollü Kortikal Etki Modeli

Every year over a million Americans suffer a traumatic brain injury (TBI).  Combined with the incidence of TBIs worldwide, the physical, emotional, ...

A Radio-telemetric System to Monitor Cardiovascular Function in Rats with Spinal Cord Transection and Embryonic Neural Stem Cell Grafts

A Radyo-telemetrik Sistemi Omurilik transeksiyonu ve Embriyonik Nöral Hücre Greftler Kök Sıçanlarda Kardiyovasküler Fonksiyonu Monitör

High thoracic or cervical spinal cord injury (SCI) can lead to cardiovascular dysfunction. To monitor cardiovascular parameters, we implanted a catheter ...

Calibrated Forceps Model of Spinal Cord Compression Injury

Omurilik Sıkıştırma Yaralanma Kalibre Forseps Modeli

Compression injuries of the murine spinal cord are valuable animal models for the study of spinal cord injury (SCI) and spinal regenerative therapy. The ...

Contrast Enhanced Ultrasound Imaging for Assessment of Spinal Cord Blood Flow in Experimental Spinal Cord Injury

Deneysel Spinal Kord Yaralanmalarında Omurilik Kan Akımının Değerlendirilmesi için geliştirilmiş Ultrason Görüntüleme Kontrast

Reduced spinal cord blood flow (SCBF) (i.e., ischemia) plays a key role in traumatic spinal cord injury (SCI) pathophysiology and is accordingly an ...